多重PCR-DHPLC检测4种主要致腹泻性大肠埃希氏菌方法的建立与应用

doi:10.7506/spkx1002-6630-201020060

食品科学 ›› 2010, Vol. 31 ›› Issue (20): 293-297.doi: 10.7506/spkx1002-6630-201020060

多重PCR-DHPLC检测4种主要致腹泻性大肠埃希氏菌方法的建立与应用

徐义刚¹，崔丽春^{2 ,}*，李苏龙¹，曹际娟³，姜艳春¹，张子群¹，刘新亮¹

1.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 2.东北林业大学 3.辽宁出入境检验检疫局

收稿日期:2010-02-22 出版日期:2010-10-25 发布日期:2010-12-29
通讯作者: 崔丽春 E-mail:degree82191656@yahoo.com.cn
基金资助:
黑龙江省青年基金项目(QC2009C90)；黑龙江省博士后基金项目(LBH-Z09)

Development and Application of a Multiplex PCR/DHPLC Method for Detecting Four Common Diarrheogenic Escherichia coli Strains

XU Yi-gang1，CUI Li-chun2,*，LI Su-long1，CAO Ji-juan3，JIANG Yan-chun1，ZHANG Zi-qun1，LIU Xin-liang1

1. Technical Centre, Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China ；2. Northeast Forestry
University, Harbin 150040, China ；3. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116065, China

Received:2010-02-22 Online:2010-10-25 Published:2010-12-29
Contact: CUI Li-chun E-mail:degree82191656@yahoo.com.cn

摘要/Abstract

摘要：

肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)是引起腹泻、危害食品安全和人类健康的4 种主要大肠杆菌。本实验基于ETEC LT 基因、EPEC bfpA 基因、EHEC O 抗原基因和EIEC 侵袭性质粒基因序列，设计了4 对特异性引物，利用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)技术，通过体系优化，建立了致腹泻性大肠杆菌多重PCR-DHPLC 检测方法，达到同时检测4 种致病菌的目的。该方法灵敏度高，最低检测限为EHEC 6 × 101拷贝/μL、ETEC 1.3 × 102 拷贝/μL、EPEC 9 × 101 拷贝/μL、EIEC 7 × 101 拷贝/μL。特异性试验表明，对22种共41 株细菌进行检测，所试6 株致腹泻性大肠杆菌均为阳性。实践证明，该方法具有良好的实用性，可用于ETEC、EPEC、EHEC 和EIEC 的单一或混合感染的检测。

关键词: 致泻性大肠杆菌, 聚合酶链反应, 变性高效液相色谱, 检测

Abstract:

Four pairs of specific primers were designed according to the sequences of the LT gene from enterotoxigenic E.coli (ETEC), the bfpA gene from enteropathogenic E.coli (EPEC), the O antigen gene from enterohemorrhagic E.coli (EHEC) and the invasive plasmid gene from enteroinvasive E.coli (EIEC) for the development of a multiplex polymerase chain reaction/denaturing high performance liquid chromatography (PCR/DHPLC) method for the simultaneous detection of the four common diarrheogenic E.coli strains. The PCR/DHPLC method had high sensitivity and its detection limit was 6×101 copies/μL for EHEC, 1.3×102 copies/μL for ETEC, 9×101 copies/μL for EPEC and 7×101 copies/μL for EIEC. The specificity evaluation showed that 6 of 41 stains from 22 species were determined to be positive. This method proves to be applicable and suitable for the detection of infection with one or more of the four E.coli strains.

Key words: diarrheogenic E.coli, PCR, DHPLC, detection

中图分类号:

徐义刚1，崔丽春2,*，李苏龙1，曹际娟3，姜艳春1，张子群1，刘新亮1. 多重PCR-DHPLC检测4种主要致腹泻性大肠埃希氏菌方法的建立与应用[J]. 食品科学, 2010, 31(20): 293-297.

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