朱运明,王晓飞,闵伟红*,詹冬玲,王隆洋
ZHU Yun-ming, WANG Xiao-fei, MIN Wei-hong*, ZHAN Dong-ling, WANG Long-yang
摘要:
采用饱和定点突变和高通量筛选技术,对北京棒杆菌天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)AK Gly377位点进行突变,并筛选获得高活力突变体G377F,分离纯化后对G377F AK酶学性质进行表征。结果表明:突变体AK最适pH值为9.0,较突变前野生型(wide type,WT)最适pH值为8.5有所提高;最适反应温度与WT一致,均为25 ℃;半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h;pH耐受性在5 h内保持其活力50%以上,与WT 3 h内酶活力保持能力相同。G377F对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性。其中,Lys的抑制作用在一定程度上被解除,当Lys和Met同时存在时对AK具有明显的激活作用。动力学研究显示:G377F AK Vmax较WT提高9.3 倍;n值为1.0明显低于WT的2.7,说明AK正协同性降低,趋向于米氏酶。