填充豆腐是以葡萄酸-δ-内酯（glucono-δ-lactone，GDL）为凝固剂的豆制品，以其质地细腻、口感软嫩、食用方便等特点深受我国消费者喜爱。自20世纪80年代以来，我国填充豆腐的生产一直沿用从日本引入的低温点脑、高温凝固的工艺。该工艺利用GDL在低温下缓慢释放H＋的特点，将加热的豆浆降温至15～20 ℃，与GDL快速混合，随后升温至85 ℃，升温过程溶液中H＋浓度逐渐升高，促使变性的大豆蛋白发生凝聚，形成凝胶[1]。该工艺实现了填充豆腐自动化连续生产，提高了豆腐的生产效率，并延长了保质期。但是，低温点脑、高温凝固的生产工艺需要两次升温、两次降温，工艺复杂，设备投资高，增加了生产和维修成本，也造成能源浪费。同时，降温点脑过程增加了产品微生物污染的风险，并且还存在凝固剂过量、豆腐口味发酸的问题。因此，在保证产品品质前提下，简化生产工艺、减少能耗、降低生产成本，成为豆制品加工行业亟待解决的问题。
目前，国内外关于填充豆腐凝固机理的研究很多。大豆蛋白主要由大豆球蛋白（glycinin，11S）和β-伴大豆球蛋白（β-con-glycinin，7S）组成，7S和11S的变性温度分别为70 ℃左右和90 ℃左右[2]。Campbell等[3]研究表明，中性条件下加热大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）形成大的聚合体被GDL酸化时，SPI可与天然存在的蛋白共沉形成更大的聚合体，凝胶网络结构主要靠疏水作用和二硫键维持。李里特等[4]研究显示，随着加热温度（80～95 ℃）升高，豆腐凝胶强度增强，加热温度越高，大豆蛋白暴露的活性基团越多，在凝固剂作用下，凝固形成的网络结构越完整，凝胶强度越强。凝固温度是影响豆腐品质的关键因素。一方面，凝固温度影响大豆蛋白变性程度，随着温度的升高，大豆蛋白变性加剧，更多的疏水基团暴露，有利于凝胶网络的形成[5]；另一方面，凝固温度影响GDL分解释放H＋速率，降低体系pH值能中和大豆蛋白表面电负性，使大豆蛋白凝聚成为网状结构[6]。Chang等[7]从流变学的角度对GDL制备黑豆豆腐凝胶形成过程进行了研究，结果显示黑豆豆腐饱和储能模量（G’sat）受凝固温度、豆浆浓度及GDL浓度影响，G’sat随豆浆浓度和GDL浓度增大而增大，凝固温度为75 ℃时，G’sat最大。Liu Zhisheng等[8]采用两步法加热，即在75 ℃加热5 min，再升温至95 ℃加热5 min，制备内酯豆腐，其凝胶弹性显著增加，豆腐保水性增强。GDL在水中的分解速率与温度正相关，温度越高，分解速率越快，蛋白凝聚速率越快[9]。陶汝清等[10]研究了以GDL为凝固剂，热处理对SPI结构和凝胶性的影响，结果显示，随着加热温度在70～95 ℃范围内升高，SPI中的自由氨基浓度、自由巯基含量及表面疏水性增高，SPI凝胶强度先上升后下降，凝胶失水率呈下降趋势。李倩如等[11]研究了酸化速率对内酯诱导的SPI凝胶结构的影响，结果表明，温度与蛋白凝胶的酸化速率成正比，随着酸化速率的增加，大豆分离蛋白凝胶强度和刚性不断提高。
本团队研发的热浆高效混合灌装装备可实现高温豆浆与点脑剂的瞬时均匀混合，改变了传统填充豆腐点脑过程需两次升温两次降温的生产工艺，简化了生产设备，降低了生产能耗。本研究针对填充豆腐现有生产过程能源消耗大的行业共性问题，对热豆浆与GDL混合过程蛋白质形成凝胶机制进行研究，为创制热浆节能点脑技术及装备提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆为市售。
GDL 上海黄浦食品添加剂有限公司；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250 美国Amresco公司；其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
AR1000旋转流变仪 英国TA公司；TA-XT质构仪英国Stable Micro System公司；HTX酶标仪 美国BioTek公司；RJDN-1型热浆连续式点脑装备 北京食品科学研究院。
1.3 方法
1.3.1 样品的制备
1.3.1.1 RJDN-1型热浆点脑装备制备填充豆腐凝胶
采用新型低耗水制浆工艺制豆浆[12]，生豆浆加热煮沸，保持3 min，所得熟豆浆的可溶性固形物含量为10 °Brix。豆浆分别于30、40、50、60、70、80、85 ℃下通过RJDN-1型热浆点脑装备与3%（质量分数，下同）GDL溶液按体积比20∶1混合，并在相应温度下保温20 min，于4 ℃下冷藏过夜制得凝胶。
1.3.1.2 模拟生产过程制备填充豆腐凝胶
大豆浸泡后制浆，生豆浆加热煮沸，保持3 min，所得熟豆浆可溶性固形物含量为10 °Brix。之后将豆浆冷却到20 ℃，将其与3% GDL按体积比20∶1混合均匀，置于85 ℃下凝固20 min，后继续保温20 min，之后置于冷水槽中冷却1 h，于4 ℃下冷藏过夜制得成品。
1.3.2 凝胶形成过程的流变学特性测定
对凝胶在恒温（30、40、50、60、70、80、85 ℃）凝固过程和模拟生产升温凝固过程的流变学特性进行测定，具体方法参考文献[13]。
取1.3.1.1节制备的2.0 mL 10 °Brix熟豆浆，加入流变仪平行板（d＝40 mm、间隙1 mm），刮去多余样品，加入矿物油密封样品防止测试过程水分蒸发。对于恒温凝固过程流变学测定，分别预热至30、40、50、60、70、80、85 ℃（根据目前实际生产情况，填充豆腐凝固升温至85 ℃，为了与实际生产情况保持一致，因此实验最高温度设定为85 ℃）；对于升温凝固过程，将温度以0.2 ℃/s从20 ℃升至85 ℃，并维持15 min。再取0.1 mL 3% GDL溶液，快速注入平行板间隙中，开始测定样品弹性模量G′和黏性模量G″随时间的变化。其他测试参数：频率1 Hz；应力0.1%；扫描时间：1 200 s。
1.3.3 质构特性测定
质构特性测定参考文献[14]。采用取样器制备直径1 cm、高2 cm的圆柱形样品，采用质构仪通过TPA模式测定凝胶的质构特性。测定条件：测前、测中、测后速率均为5 mm/s，压缩比例30%，间隔时间5 s，探头P/26。根据TPA质构曲线计算硬度、弹性、内聚性和黏着性。
1.3.4 感官评价
感官评价共有色泽、口感、外观、风味4 项指标，每项满分25 分，最低分0 分，分数越高表明该项品质越好。感官评价小组由10 名成员组成，6 名女性，4 名男性，均没有大豆过敏史且每周食用豆腐制品至少一次[15-16]。感官评价标准见表1。
表1 填充豆腐感官评分标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of tofu coagulated with glucono-δ-lactone
指标 评分标准 评分色泽发黄 10略带黄色，均一 15白色，均一 25口感质地粗糙，无弹性 10质地较细腻，有一定弹性 15质地细腻，弹性好 25外观块型不完整，表面粗糙 10块型较完整，表面较光滑 15块型完整，表面光滑 25风味豆香味淡，酸味明显 10有淡淡豆香味，酸味较淡 15豆香味浓，无酸味 25
1.3.5 蛋白分子间作用力测定
蛋白质分子间作用力测定参照Tan[17]和邓丽[18]等的方法，并加以改进。称取0.6 g冻干豆腐样品加5 mL 0.6 mol/L NaCl，进行分离提取（5 000 r/min匀浆2 min，4 ℃放置1 h，再10 000 r/min离心20 min，于1 000 目滤布过滤，下同），得到上清液S1。所得沉淀加入5 mL提取液A（含1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl）后进行分离提取操作，得到上清液S2。所得沉淀加入5 mL提取液B（含8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl），分离提取两次，合并两次提取上清液得到S3。沉淀加入5 mL提取液C（含0.5 mol/L β-巯基乙醇、8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl）后进行分离提取，得到上清液S4。将每次离心取得的上清液置于4 ℃下保存。将上述上清液采用考马斯亮蓝法测定蛋白质量浓度。离子键、氢键、疏水键和二硫键相对含量分别为上清液S1、S2、S3和S4中蛋白质量浓度与这4 种上清液中总蛋白质量浓度的比值。
1.4 数据统计与分析
实验做3 组平行，釆用Excel软件统计数据，利用SPSS 22软件对数据进行Duncan’s多重比较显著性分析和双变量相关性分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 填充豆腐凝胶形成过程中的流变学特性分析结果
对于黏弹体系，G’和G”分别表示凝胶的“类固”程度（弹性）和“类液”程度（黏性）[18]。体系的动态流变曲线可以描述体系在凝固过程中凝胶形成的变化过程，G’反映体系凝胶强度的大小，G”反应体系黏性的大小。通过比较G’和G”随时间的变化，可以反映体系中凝胶形成速率，以及凝胶在不同时间的状态[19]。
由图1可知，凝固温度对填充豆腐凝胶的G’和G”影响较大。当凝固温度小于60 ℃时，凝胶体系的G’和G”较小，形成的凝胶强度很差。而当凝固温度不低于60 ℃时，体系的G’和G”较大。凝固反应初期，温度越高曲线斜率越大，表现为凝胶反应速率越大；曲线达到稳定增长所需时间越短，表现为凝胶反应时间越短，凝胶反应结束时形成的凝胶强度越大。填充豆腐凝胶的形成受两方面因素影响：一方面，GDL溶于水后会分解成葡萄糖酸，并释放H＋，中和大豆蛋白表面电荷，从而使大豆蛋白发生聚集，形成凝胶[19]。温度越高，GDL分解速率越快，体系中H＋浓度越高，凝胶反应越迅速，G’和G”增长速率越快[20]；另一方面，加热会促使大豆蛋白质分子链展开，内部的疏水基团暴露于体系表面，疏水基团之间的相互作用，促使大豆蛋白分子结合在一起，形成凝胶[21]。温度越高，大豆蛋白变性加剧，暴露出的疏水基团越多，形成凝胶越迅速，凝胶强度越高[4,22]。另外，由于大豆蛋白中的主要组分7S和11S蛋白，其变性温度分别为70 ℃左右和90 ℃左右[2]，当凝固温度过低时，即使有凝固剂的参与，也无法形成具有一定凝胶强度的蛋白质凝胶。由上述分析可见，高温凝固有利于形成具有一定凝胶强度的填充豆腐，温度越高，凝胶强度越大。
图1 不同凝固温度下填充豆腐的动态黏弹特性曲线
Fig.1 Dynamic viscoelastic properties of tofu coagulated at different temperatures
2.2 升温凝固与高温下恒温凝固对凝胶形成速率的影响
为了反映不同凝固过程对凝胶形成速率的影响，实验模拟了实际生产中连续升温凝固过程，测定了连续升温条件下体系G’和G”随时间的变化曲线（图2），并测定了凝固温度为85 ℃时体系G’和G”随时间的变化曲线（图3）。
图2 模拟生产过程G’和G”随时间变化曲线
Fig.2 Changes in G’ and G” during simulated coagulation process at rising temperatures
由图2可知，模拟生产过程中，凝固温度随时间从20 ℃逐渐升高至85 ℃为升温凝固过程。当温度低于70 ℃时，体系中G’和G”呈波动变化趋势，且趋势平缓；当温度不低于70 ℃时，体系中G’＞G”，且这两者均急速上升。在豆腐凝胶形成过程中，当体系为液态时，G”＞G’，体系表现为液体性质；随着加热与凝固剂的加入，G’和G”同时升高，当凝胶形成时，G’＞G”，体系表现为固体性质[20]。因此，可以根据G’和G”随时间的变化曲线的交点，判断体系的凝胶时间。现有的填充豆腐生产工艺，为了使豆浆在凝固前与GDL充分混合，采用了低温混合、高温凝固的生产工艺，凝固过程较缓慢，当温度增至70 ℃时，G’＞G”用时250 s左右，开始形成凝胶。
图3 填充豆腐85 ℃恒温凝固过程中G’和G”随时间变化曲线
Fig.3 Changes in G’ and G” of tofu during coagulation at a constant temperature of 85 ℃
图3表示85 ℃热豆浆直接混合GDL时体系G’和G”随时间变化曲线，此过程为恒温凝固。由于85 ℃下凝固反应迅速，为了清晰地反映体系凝固过程G’和G”的变化，图3只截取了反应前几秒体系G’和G”随时间变化曲线。由图3可知，85 ℃热浆直接混合GDL时，凝固反应极快，仅用时1.8 s左右。对比图2与图3可知，与传统的连续升温凝固过程相比，85 ℃下凝固反应极为迅速。因此，要实现85 ℃下均匀凝固，需要在极短的时间内完成凝固剂与豆浆的快速混合。而现有的生产设备无法实现高温下豆浆与GDL均匀快速混合，也就不能形成完整均匀的豆腐凝胶。基于改进现有工艺的难题，解决豆制品加工能耗高的瓶颈，本团队采用撞击流原理所研制的热浆连续式点脑装备实现了豆浆与GDL瞬间均匀混合，使内酯豆腐高温点脑、灌装、成型一系列过程同时完成[23]。
2.3 凝固温度对填充豆腐凝胶强度的影响
图4 不同凝固条件填充豆腐的G’最大值
Fig.4 G’max of tofu under different coagulation conditions
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。图6同。
图4对比了不同凝固温度下，填充豆腐弹性模量G’的最大值。凝固温度从60 ℃升高至70 ℃时，
显著增加（P＜0.05），之后随着凝固温度升高，
缓慢增加。温度越高，大豆蛋白变性越充分，暴露出的疏水基团越多，酸化后形成的网络越稳定，凝胶强度越大，凝胶的弹性模量越高[24]。当凝固温度达到85 ℃时，
为143.5 kPa。而模拟实际生产条件，得到的填充豆腐
为129.7 kPa。虽然通过两种凝固方式都能形成较稳固的凝胶结构，但采用85 ℃高温快速凝固比采用连续升温凝固更有利于增加填充豆腐凝胶强度，提高填充豆腐品质。
2.4 凝固温度对填充豆腐质构特性的影响
表2 不同凝固温度及模拟生产过程填充豆腐质构特性的比较
Table 2 Comparison of texture properties of tofu prepared at different coagulation temperatures and under simulated production conditions
注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
凝固温度/℃ 硬度/g 弹性 内聚性 黏着性/g 30 39.08±4.15a 0.89±0.01a 0.64±0.10a 25.16±6.15a 40 45.91±6.56a 0.98±0.04a 0.63±0.03a 29.01±2.17a 50 87.42±8.68b 0.94±0.07a 0.61±0.07a 53.55±8.52b 60 130.65±16.12c 0.98±0.05a 0.62±0.10a 81.24±10.84c 70 139.33±10.14c 1.28±0.09b 0.82±0.07b 114.76±20.85d 80 181.76±9.32d 1.59±0.05c 0.87±0.08b 157.77±10.96e 85 204.86±3.85e 1.82±0.03d 0.90±0.02b 184.17±18.21f模拟生产条件 84.36±2.13b 1.65±0.13c 0.68±0.05a 77.44±1.34c
质构特性是豆腐品质评价的主要手段，硬度、内聚性、弹性、黏着性是豆腐质构评价的主要指标[25-26]。表2表明，随着凝固温度升高，填充豆腐的硬度、弹性、内聚性、黏着性不同程度地增加。当凝固温度小于60 ℃时，凝胶弹性、硬度、黏着性都很低，凝胶成半凝固状态；当凝固温度大于70 ℃时，凝胶的硬度、内聚性和黏着性显著提高（P＜0.05）。不同凝固温度下凝胶的质构特性与对应的流变曲线变化规律一致。与模拟生产过程制得的填充豆腐相比，凝固温度为85 ℃时，豆腐硬度、弹性、内聚性和胶黏性均显著提高（P＜0.05）。由此可见，利用本实验室研制的热浆连续式点脑装备制作的填充豆腐品质优良。
2.5 凝固温度对感官评分的影响
图5 不同凝固温度及模拟生产条件下填充豆腐的感官评分
Fig.5 Sensory scores of tofu prepared under different coagulation temperatures and simulated production conditions
根据流变特性分析可知，凝固温度≥60 ℃时，可以形成具有一定凝胶强度的豆腐凝胶。因此，本实验选择了凝固温度为60、70、80、85 ℃的填充豆腐并与模拟生产过程连续升温条件下的填充豆腐进行感官评价，结果如图5所示。不同凝固温度形成的填充豆腐，在风味、口感、外观方面有明显差异，色泽差异较小。85 ℃下凝固的填充豆腐在色泽、风味、口感、外观4 个指标中得分均最高，随着凝固温度降低，填充豆腐凝胶强度下降，产品的外观、口感、风味也变差。与模拟生产条件的填充豆腐相比，凝固温度为85 ℃时的填充豆腐豆香味更浓，且无酸味，豆腐弹性更强，豆腐更加完整，断面光滑。
2.6 凝固温度对填充豆腐分子间作用力的影响
图6 不同凝固温度下填充豆腐化学作用力的变化
Fig.6 Change in chemical forces of tofu at different coagulation temperatures
A.离子键相对含量；B.氢键相对含量；C.疏水相互作用相对含量；D.二硫键相对含量。
豆腐凝胶特性的差异反映了大豆蛋白分子结构的不同[27]。对大豆蛋白空间构象影响最主要的分子间作用力为氢键、离子键、二硫键、疏水作用[28]。本研究对不同凝固温度对填充豆腐凝胶作用力的影响进行了分析，探讨了高凝固温度下豆腐凝胶的成型机理，为热浆连续式点脑装备开发与应用提供理论依据。
由图6可知，随着凝固温度的升高，凝胶体系中的离子键和氢键相对含量均显著下降（P＜0.05）。当凝固温度从50 ℃升高至60 ℃时，体系中离子键相对含量和氢键相对含量分别下降56.9%和51.5%。离子键和氢键是维持蛋白质分子构象的重要作用力[29]，它们主要存在于蛋白质分子的极性基团之间[30]。豆浆经煮浆加热，维持蛋白质构象的氢键、离子键发生断裂，蛋白质分子链展开，内部疏水基团及活性基团暴露[31]。低温点脑时，由于温度下降，变性的大豆蛋白会部分发生复性，疏水基团被重新掩藏[32]，带电的极性基团重新结合，形成新的离子键、氢键以稳定蛋白质分子结构，因此低温点脑时，体系的离子键和氢键含量较高。高温点脑时，随着体系pH值快速下降，蛋白分子的表面电荷被中和，极性基团静电斥力下降[33]，分子间的疏水基团相互结合，促进蛋白凝胶的形成。因此，高温点脑时体系的离子键和氢键含量下降。
随着凝固温度的升高，填充豆腐疏水相互作用和二硫键相对含量均呈显著上升趋势（P＜0.05）。当凝固温度从50 ℃升高至60 ℃时，体系中疏水相互作用相对含量和二硫键相对含量分别提高17.8%和11.2%。疏水相互作用是存在于大豆蛋白非极性基团之间的作用力[34]，而二硫键是两个半胱氨酸残基中的巯基氧化后形成的共价键，存在于蛋白质肽链的链内和链间[29]。二者均是蛋白凝胶形成过程中主要的作用力，对稳定蛋白质空间结构起到重要作用[35]。当凝固温度较低时，大豆蛋白变性不充分，疏水基团、巯基等可以相互作用的基团仍被包裹在分子内部，蛋白分子间能够相互作用的活性基团较少，无法形成疏水相互作用和二硫键。此时，无论添加何种凝固剂都难以形成豆腐凝胶，呈半流体状[25]。在较高温度下点脑时，蛋白分子内部的疏水基团和巯基暴露，蛋白质表面疏水作用力增强[36]，暴露的巯基使蛋白质之间产生交联作用，形成牢固的二硫键[37]。随着GDL水解释放H＋，蛋白质分子间的静电斥力下降，再加上疏水作用和二硫键的结合力，大豆蛋白凝胶形成[21,38]。
2.7 填充豆腐分子间作用力与质构特性相关性分析
分子间作用力是维持凝胶外观形态及物性的主要作用力[18]。由表3可知，反映填充豆腐质构特性的指标与分子间作用力之间呈较强的相关性。其中，填充豆腐凝胶弹性和内聚性与离子键、氢键、疏水相互作用及二硫键的相对含量呈显著相关（P＜0.05）；硬度和黏着性与离子键、氢键、疏水相互作用及二硫键相对含量呈极显著相关（P＜0.01）。
表3 填充豆腐质构特性与分子间作用力之间的相关性
Table 3 Correlation between texture characteristics and chemical forces of tofu
注：*.显著相关（P＜0.05），**.极显著相关（P＜0.01）。
指标 离子键相对含量氢键相对含量疏水相互作用相对含量二硫键相对含量硬度 -0.953** -0.976** 0.961** 0.954**弹性 -0.789* -0.868* 0.869* 0.772*黏着性 -0.910** -0.963** 0.952** 0.910**内聚性 -0.766* -0.866* 0.859* 0.772*
3 结 论
与传统的连续升温凝固方式相比，高温凝固更有利于得到凝胶强度大的填充豆腐。当凝固温度为85 ℃时，凝固反应用时1.8 s左右，最终形成凝胶的G’max为143.5 kPa，凝胶强度大于传统工艺制备的填充豆腐。高温凝固有利于提高填充豆腐的质构特性。凝固温度大于70 ℃，凝胶的硬度、内聚性和黏着性显著提高（P＜0.05）。感官评价结果表明，凝固温度为85 ℃时，制得的填充豆腐色泽、风味、口感、外观均优于模拟生产条件下的填充豆腐。
疏水相互作用、二硫键、氢键、离子键为填充豆腐凝胶的主要分子间作用力。随着凝固温度的升高，离子键和氢键所占比例显著下降，疏水相互作用和二硫键所占比例升高。填充豆腐质构特性与分子间作用力之间具有高度相关性。当凝固温度较低时（＜60 ℃），形成填充豆腐凝胶的主要分子间作用力为疏水相互作用和氢键，此时凝胶弹性、硬度、黏着性和内聚性均较低；当凝固温度较高时，形成凝胶的主要化学作用力为二硫键和疏水相互作用。此时，凝胶强度较高，凝胶弹性、硬度、黏着性和内聚性均较高。
以上表明，利用本团队研发的热浆连续式点脑装备，可以实现85 ℃豆浆与GDL瞬间混合，并同时完成灌装凝固过程。该工艺制得的填充豆腐弹性、硬度俱佳，明显优于市售同类产品。该结果为热浆自动点脑装备的开发及标准化加工提供了基础数据及理论支持。下一步将在本研究的基础上，从不同凝固过程形成凝胶的微观结构、胶凝过程的分子作用机制等方面进行深入探讨。
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