中国白酒是以粮谷为主要原料,以酒曲为糖化发酵剂,经固态、半固态或液态发酵、蒸馏、贮存、勾兑而成的蒸馏酒[1]。白酒作为中国传统的饮料酒,与威士忌、伏特加、朗姆酒、白兰地和金酒并列为世界著名六大蒸馏酒。白酒按照香气风格特点可分为酱香型、浓香型、清香型、米香型、兼香型、凤香型等13 个香型[2]。酿造白酒的原料较多,以高粱、玉米、大米、小麦、糯米和青稞等粮食为主。不同原料酿造白酒的风味物质并不同,这些物质主要由醇、酸、酯、醛、酮类等物质构成,它们在酒中的分布和含量不相同,也因此决定白酒的香气和口味[3-5]。
白酒中的微量香味成分是构成白酒香味和风格的重要物质。从20世纪50年代开始研究,到目前为止己经在我国白酒中检测到近1 000 种成分[6]。目前经常使用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GCMS)联用技术结合气相色谱-闻香(gas chromatographyolfactometry,GC-O)技术对白酒中的风味物质进行定量和定性分析[7-9]。GC-MS出现于20世纪50年代,它具有GC可对复杂组分分离和含量测量的特点,还兼顾MS的选择性高、鉴别能力强的优点[10]。GC-MS联用技术能快速分离和鉴定样品,并对于批量物质的整体和动态分析起到了很大的促进作用。自20世纪90年代以后,GC-MS技术在白酒香气成分的鉴定中得到广泛应用[11-16]。GC-O技术是一种发现样品中可能存在的香气化合物的技术,它将传统的人工闻香与GC技术结合,通过在色谱柱末端增加一个三通,将原来直接进入检测器的气流分一部分出来,进行人工闻香[17]。21世纪初,GC-O技术在白酒风味分析中也得到广泛应用[18-20]。
目前,国内对于白酒风味的研究报道非常多,包括各种香型白酒风味的分析比较[21-28],但是对不同原料酿造白酒风味物质的研究非常少。本研究采用GC-O-MS技术对5 种不同原料高粱、小麦、大米、糯米和玉米酿造白酒的风味物质进行定量分析,并针对这5 种原料酒的香气活性物质进行鉴定,最后采用感官评价方式比较它们的酒体风味和质量,为选择不同的酿酒原料提供科学依据[29-30]。课题组己研究5 种不同原料蒸煮后对白酒香气的影响[31],现进一步对不同原料酿造白酒中风味物质的特异性进行分析。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
粮谷原料为高粱、小麦、大米、糯米、玉米,原料产地分别为澳大利亚和中国河南、四川、湖北、甘肃。
大曲为中温大曲(酒厂提供);酵母购自安琪酵母(伊犁)有限公司。
内标试剂:叔戊醇(色谱纯,96.0%)、乙酸正戊酯(色谱纯,98.5%)、2-乙基丁酸(色谱纯,99%)美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
DLFU盘式粉碎机 德国Buhler-Miag公司;ST180-A苏格电磁炉 广东省中山市苏格电器有限公司;Clarus 600气相色谱仪-Autosystem XL质谱仪 美国PerkinElmer公司;CP-WAX毛细管柱(50 m×0.25 mm,0.2 μm)、7890 A-Sniffer 9000-7000 GC-MS联用仪美国Agilent公司;Al204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;嗅闻仪 瑞士Brechbuhler公司;蒸酒器设备(2 kg规格) 自制改装。
1.3 方法
1.3.1 酿酒工艺流程和要点
以清香型大曲白酒的工艺流程为基础,进行酿造实验,见图1。
图1 清香型白酒工艺流程
Fig. 1 Flow chart for the brewing process of Fen-f l avor Chinese Baijiu
粉碎:称取原料1.7 kg,用粉碎机粉碎粒度至1.5 mm。润粮堆积:向粉碎后的原料中加入原料量65%的热水;用纱布覆盖堆料,每隔5～6 h翻拌一次;堆积22 h。蒸粮:原料采用清蒸;装甑上料,要求见汽撒料,均匀上平;蒸粮80 min。加水扬冷:蒸后的红糁趁热出甑并摊成长方形,泼入原料量30%的冷水。添加微生物:大曲加入量为原料量的12%,安琪酵母加入量为原料量的0.02%,再加入原料量2%糖水活化20 min。发酵:采用坛子发酵,瓷碗倒扣后加水密封,发酵期为25 d。蒸酒:发酵结束,酒醅拌入原料量20%的稻壳进行清蒸接酒。
1.3.2 GC-MS条件
GC条件:进口温度240 ℃,载气He,流速1 mL/min,进样量1 µL,分流比10∶1。升温程序为35 ℃保持6 min,以4 ℃/min程序升温至60 ℃,以6 ℃/min程序升温至110 ℃,保持3 min,以6 ℃/min程序升温至205 ℃,保持13 min。
MS条件:电子电离源70 eV,离子源温度230 ℃,传输线温度240 ℃,质量扫描范围29～300 u。
1.3.3 固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)条件
将白酒样品稀释至体积分数15%,量取10 mL于30 mL萃取瓶中,加盖密封置于55 ℃水浴锅中平衡20 min,SPME吸附40 min后插入GC进样口,250 ℃条件下解吸5 min。
1.3.4 GC-O-MS分析条件
GC柱温箱程序升温条件:初始温度40 ℃,以2 ℃/min速率升至215 ℃,保持3 min。进样口温度250 ℃,载气He,流速1.2 mL/min,压力145.82 kPa,不分流。
MS条件:电子电离源,电子能量70 eV,传输线温度280 ℃,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,溶剂延迟4 min,质量扫描范围m/z 55～500。
嗅闻口:接口温度为200 ℃。通以湿空气,提高嗅闻人员的灵敏度和舒适度。
本实验选择3 位嗅闻人员,均己通过标准品的培训,其中有1 位是白酒国家评委。感官评价员嗅闻时记录所闻到化合物的保留时间、气味强度以及对其气味特性进行适当的描述。气味强度共分为5 个等级进行评价,即1:极弱;2:弱;3:中等;4:强;5:极强。当3 个评价员中至少有2 个得出相同的结论,评价方可算作有效,从而来确定嗅闻活性物质的强度。
1.3.5 化合物定性
化合物在GC-O-MS上的采集信息通过Masshunter Workstation B.03.01数据处理软件处理。采用美国国家标准与技术研究所NIST(National Institute of Standards and Technology)谱库2.0检索、化合物的保留指数和气味特性3 种方法共同定性挥发性香气成分;部分物质通过与标准化合物的线性保留指数(linear retention index,LRI)和芳香特性比较实现精确定性。化合物LRI利用系列正构烷烃换算,计算公式如下:
式中:tn+1为碳数为n+1的正构烷烃保留时间;tn为碳数为n的正构烷烃保留时间;t为未知物的GC保留时间(tn＜t＜tn+1)。
1.3.6 感官评价
选择7 名国家级白酒评委进行感官品评,将酿造出不同的白酒依次倒入50 mL无色透明的品评杯中供其品尝。每次品尝微量(约2 mL),品尝完漱口进行下一种白酒的品尝,依次打分并且描述其特征。打分的范围为0(无味)～9(无法掩盖的味道)。
2 结果与分析
2.1 5 种原料酒GC-O-MS分析
5 种白酒经SPME提取,GC-O-MS检测分析,鉴定出的挥发性成分并不都对白酒的香气有贡献。GC-O-MS可以通过嗅闻鉴定出白酒的香气活性物质,总离子流图见图2。
图25 种原料酒GC-O-MS谱图
Fig. 2 GC-O-MS Spectra for five single-grain Chinese Baijiu
5 种单粮白酒经GC-O-MS分析,香气成分主要包括萜烯类、杂环类、醇类、芳香类、醛类、酯类物质,5 种粮食的香气成分差异见图3。高粱、小麦、大米、玉米、糯米的单粮白酒样品分别发现71、59、62、31、70 种香气成分。5 种白酒样品中酯类物质最多,萜烯类的物质最少。其中,高粱酒中酯类物质最多,醛类和芳香类物质在高粱酒和糯米酒中最多,醇类、杂环类、萜烯类和其他类物质在5 种酒样中数量相差无几。
表1 5 种原料酒香气活性物质分析
Table 1Aroma-active compounds identi fied in five single-grain Chinese Baijiu
注:MS.质谱检索;RI.保留指数;odour.嗅闻气味特征定性。1～5表示对应提取方法能鉴定并嗅闻到的香气强度级别;—.未嗅闻到。
序号 RI/RIL 化合物 气味描述 鉴定方式 嗅闻强度高粱酒 小麦酒 大米酒 糯米酒 玉米酒1 870/882 乙酸乙酯 ethyl acetate 酒香 MS、RIL、odour 4 5 4 3 4 2 910/910 异戊醛 3-methylbutyraldehyde 苹果香气 MS、RIL、odour 3 4 3 1 3 3 948/930 乙醇 ethanol 特殊香味 MS、RIL、odour 4 3 3 3 2 4 964/965 异丁酸乙酯 ethyl 2-methylpropanoate 果香 MS、RIL、odour 2 3 1 3 3 5 1 033/1 036 丁酸乙酯 ethyl butanoate 甜果香 MS、RIL、odour 4 3 1 — 3 6 1 049/1 056 2-甲基丁酸乙酯 ethyl 2-methylbutyrate 果香 MS、RIL、odour 3 4 4 4 2 7 1 063/1 056 异戊酸乙酯 ethyl 3-methylbutanoate 果香 MS、RIL、odour 4 1 1 4 4 8 1 177/1 070 正庚醛 heptanal 果香 MS、RIL、odour 2 2 — — 2 9 1 182/1 181 异己酸乙酯 ethyl 4-methylpentanoate 果香 MS、RIL、odour 3 — — 4 —10 1 207/1 206 异戊醇 3-methyl-1-butanol 苦杏仁味 MS、RIL、odour 2 2 4 2 4 11 1 221/1 231 2-正戊基呋喃 2-pentylfuran 豆香、果香 MS、RIL、odour 3 4 3 3 4 12 1 227/1 244 己酸乙酯 ethyl hexanoate 果香和酒香 MS、RIL、odour 4 4 3 3 4 13 1 283/1 287 正辛醛 1-octanal 玫瑰和橙皮香气 MS、RIL、odour 5 2 — 4 —14 1 312/1 324 己酸丙酯 propyl hexanoate 菠萝和黑莓香气 MS、RIL、odour — 2 — — —15 1 319/1 388 反式-2-庚烯醛 (E)-2-heptenal 青草和油脂香气 MS、RIL、odour 5 5 — 3 5 16 1 388/1 394 壬醛 nonanal 玫瑰、柑橘香气 MS、RIL、odour 2 3 2 2 1 17 1 394/1 404 三甲基吡嗪 trimethylpyrazine 坚果香气 MS、RIL、odour — — — — 1 18 1 404/1 431 己酸丁酯 butyl hexanoate 菠萝和葡萄酒香气 MS、RIL、odour — 1 — — —19 1 431/1 532 辛酸乙酯 ethyl octanoate 白兰地酒香味 MS、RIL、odour 5 5 5 3 5 20 1 532/1 637 壬酸乙酯 ethyl nonanoate 果香及玫瑰样香气 MS、RIL、odour 3 3 3 2 2 21 1 637/1 630 癸酸乙酯 ethyl decanoate 椰子香味 MS、RIL、odour 3 3 4 3 3 22 1 662 (E)-4-癸烯酸乙酯 ethyl trans-4-decenoate 蜡香和梨香气 MS、odour 2 3 1 2 3 23 1 672/1 667 α-石竹烯 humulene 柑橘香气 MS、RIL、odour 1 1 1 — 3 24 1 841/1 840 月桂酸乙酯 ethyl laurate 花果香气 MS、RIL、odour 4 2 4 3 3 25 2 256/2 252 棕榈酸乙酯 ethyl hexadecanoate 微弱蜡香、奶油香 MS、RIL、odour 3 3 4 4 2
图3 5 种单粮白酒的香气成分对比分析
Fig. 3 Comparative analysis of flavor compounds of five single-grain Chinese Baijiu
除对比5 种单粮白酒的整体风味情况以外,进一步根据嗅闻强度共鉴定出25 种香气活性物质,如表1所示。其中小麦酒的香气活性物质最多,为23 种,高梁酒为22 种,玉米酒2 种,大米酒为20 种,糯米酒18 种。5 种原料酒均检测到的香气活性物质为16 种:乙酸乙酯、异戊醛、乙醇、异丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、异戊醇、2-正戊基呋喃、己酸乙酯、壬醛、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、(E)-4-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯。这些种物质中,大部分为酯类,贡献了水果香和花香。贡献香气程度较大的物质为乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-正戊基呋喃、己酸乙酯、辛酸乙酯,贡香比例(酒体中各香气活性物质提供香气的比例)分别为2.68%～3.97%、0.07%～0.16%、0.14%～1.25%、2.3%～3.74%、8.64%～19.64%。其中高粱酒有9 种物质的香气贡献较大(嗅闻强度≥4),小麦酒、大米酒和玉米酒分别有7 种,糯米酒有5 种。
2.2 5 种原料酒感官评价分析
图4 5 种原料酒酒风味感官指纹图谱
Fig. 4 Sensory evaluation fingerprints of flavor of five single-grain Chinese Baijiu
经专业人员对5 种原料酒进行感官评价及评分,整理并绘制成粮谷酒风味特征雷达图。从图4可以看出,高粱酒在润滑感、协调感、整体风格较其他原料酿造的白酒评价高,高粱酒酯香则和小麦酒的感官评价相同;玉米酒在原料香、醇香上评价高;糯米酒爽净感与大米酒相同;大米酒在花香上感官特征比其他原料高。这一结果与传统酿造中“高粱香,玉米甜,大米净”相契合。
3 结 论
通过GC-O-MS技术首先鉴定出高粱、小麦、大米、玉米、糯米单粮白酒样品的风味物质,分别有71、59、62、31、70 种香气成分,可见各种单粮白酒存在显著差异。同时,基于嗅闻情况,发现高粱酒、小麦酒、大米酒、糯米酒和玉米酒的香气活性物质分别为22、23、20、18、21 种,贡献香气程度较大的物质是乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-正戊基呋喃、己酸乙酯、辛酸乙酯,贡香比例范围分别为2.68%～3.97%、0.07%～0.16%、0.14%～1.25%、2.3%～3.74%、8.64%～19.64%。其中高粱酒有9 种物质的香气贡献较大(嗅闻强度≥4),小麦酒、大米酒和玉米酒分别有7 种,糯米酒有5 种。通过感官评价分析,高粱以酯香、整体协调风格评价最高,小麦酒以酯香为主,玉米酒以原料香和醇香为主,大米酒和糯米酒则以爽净感为主。
综上所述,选择高粱为酿制白酒的主要原料是中国白酒长期的生产实践[30],本研究从挥发性成分含量和香气活性物质的嗅闻强度以及感官评价等实验表明,高粱酒的风味都是占据优势地位。本研究中不同的原料酿造的白酒风味各具特色,可为提高白酒质量提供了理论依据,同时对酿造白酒时选择原料提供了指导。
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