保健食品能调节人体机能,是对人们正常膳食的有益补充[1],随着社会经济的发展和亚健康人群的增加,保健食品市场销量与日俱增。近年来该行业持续发酵,呈现较为混乱的局面[2],一些不法商家为突出功效,吸引消费者,谋取高额利润,在产品中非法添加短期内见效快、成本低廉、副作用大的化学药物[3-4],为消费者的健康埋下了隐患。其中补肾壮阳类保健品是非法添加的重灾区,非法添加的壮阳类药物主要是以西地那非为代表的那非类物质[5-6],该类化合物将给消费者带来严重的健康威胁,产生心律失常、心肌梗死、心脏猝死、脑血管出血、高血压等严重不良反应[7-9],患有高血压等心血管疾病和糖尿病患者在不知情的情况下服用这些非法添加化学成分的药物甚至会导致死亡[10]。
目前,保健食品中那非类物质的检测方法有薄层色谱法[11-12]、液相色谱法[13-16]、液相色谱-高分辨质谱法[17-21]和高效液相色谱-串联质谱法[22-26]等。其中,薄层色谱法前处理复杂,干扰大且容易出现假阳性;液相色谱法检测的物质较单一,且检出限较高。随着分析检测技术和分析仪器的不断发展,具有高选择性和高灵敏度,且定量准确,操作简便的高效液相色谱-串联质谱法得到广泛应用[27-28],己成为那非类物质的主要检测方法[29-31]。目前,基于高效液相色谱-串联质谱法检测那非类物质的种类较少(30 种以下),不够全面,检测30 种以上那非类物质均采用高分辨质谱法,侧重于定性筛查[32]。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法,建立可能被添加的90 种那非类物质的测定方法,该方法前处理简单、灵敏度高、准确性好,适合大批量样品中那非类物质的快速测定,不仅为开展食品检验工作提供技术支撑,也对打击制、售假冒伪劣保健食品,净化保健食品市场产生重要影响。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
固态和液态保健食品 市售。
甲醇、乙腈、甲酸(均为色谱纯) 德国默克公司;超纯水 广州屈臣氏公司;90 种那非类药物混标(20 μg/mL) 北京曼哈格生物科技有限公司。
Triple Quad 6500+液相色谱-质谱联用仪(配有电喷雾离子源及MultiQuant3.0.2数据处理系统) 美国Sciex公司;3K13离心机 德国Sigma公司;Vortex Genius 3涡旋仪 德国IKA公司;Elmasonic P300H超声波清洗器德国Elma公司。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理
固态试样混匀研细,液态试样摇匀后,准确称取1.00 g样品于25 mL容量瓶中,加入20 mL甲醇,超声提取15 min,放置室温后,用甲醇定容,转移至50 mL离心管中,9 500 r/min离心2 min,上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤,取滤液,根据实际浓度用甲醇适当稀释至线性范围内,待测。
1.2.2 色谱条件
XBridge BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.5 μm);流动相A为0.1%甲酸溶液,B为乙腈;进样体积5.0 μL;柱温40 ℃;流速0.3 mL/min;梯度洗脱程序:0～2.00 min,90% A,10% B;2.00～16.00 min,90%～35% A,10%～65% B;16.00～19.00 min,35%～2% A,65%～98% B;19.00～22.00 min,2% A,98% B;22.00～22.10 min,2%～90% A,98%～10% B;22.10～25.00 min,90% A,10% B。
1.2.3 质谱条件
电喷雾离子源;扫描方式:多反应监测;离子喷雾电压4 500 V/-4 500 V;雾化器压力50 psi;辅助气压力50 psi;气帘气压力30 psi;碰撞气压力9 psi;离子源温度500 ℃。监测离子及质谱参数见表1。
表1 分析物的质谱信息
Table 1 Mass spectrometry parameters of analytes
离子化模式西地那非 475.2 170 100.1*,283.1 30,46 +他达拉非 390.2 120 268.0*,135.0 10,26 +脱硫伐地那非 313.2 145 285.0*,256.0 26,34 +庆地那非 355.2 160 327.1*,285.0 26,34 +那非乙酰酸 357.2 170 329.1*,285.1 26,34 +苯酰胺那非 390.2 105 151.0*,107.0 10,74 +氨基他达拉非 391.1 130 269.0*,204.0 10,66 +他达拉非甲基氯化物 427.1 145 135.0*,274.0 18,34 +苯噻啶红地那非 438.2 165 98.1*,297.1 34,42 +那红地那非 453.3 210 97.1*,166.0 34,58 +卡巴地那非 453.3 160 339.1*,311.1 26,38 +伪伐地那非 460.2 215 151.0*,312.1 50,42 +那莫西地那非 460.2 210 282.9*,299.1 42,42 +N-去乙基伐地那非 461.2 195 151.0*,212.1 58,38 +N-去甲基西地那非 461.2 180 283.0*,311.1 42,34 +红地那非 467.3 190 111.1*,127.1 34,34 +羟基红地那非 483.3 205 127.1*,143.1 34,38 +阿伐那非 484.2 175 375.1*,155.0 30,46 +艾地那非 489.2 190 113.1*,99.1 34,38 +豪莫西地那非 489.2 180 113.1*,72.2 30,50 +伐地那非 489.2 200 151.0*,312.1 54,46 +硫代西地那非 491.2 180 100.1*,299.0 34,50 +硫代豪莫西地那非 505.2 170 113.1*,299.0 34,46 +羟基伐地那非 505.2 190 151.0*,312.1 54,46 +羟基豪莫西地那非 505.2 190 99.1*,129.1 37,41 +乌地那非 517.3 200 283.0*,112.1 50,38 +羟基硫代豪莫西地那非 521.2 190 99.1*,129.1 41,40 +那莫伐地那非 357.2 175 151.0*,329.1 34,26 +硝地那非 358.2 160 330.1*,284.1 26,34 +去甲基他达拉非 376.1 105 204.0*,254.0 70,10 +氯地那非 389.1 170 361.1*,285.0 30,38 +化合物 母离子m/z 电压/V子离子m/z碰撞能量/eV去簇
续表1
注:*.定量离子。
离子化模式化合物 母离子m/z 电压/V子离子m/z碰撞能量/eV去簇羟基氯地那非 391.2 180 313.1*,285.1 38,34 +N-丁基他达拉非 432.2 130 310.1*,135.0 14,30 +去甲基卡巴地那非 439.2 165 339.1*,311.1 22,34 +去碳西地那非 463.2 165 283.1*,311.1 42,34 +二甲基红地那非 467.3 195 127.1*,166.0 34,58 +二硫代去甲基卡巴地那非 471.2 165 371.1*,343.1 22,38 +酮红地那非 481.3 165 410.2*,297.1 34,50 +N-辛基去甲他达拉非 488.3 135 366.2*,169.0 14,50 +双酮红地那非 495.2 190 127.1*,377.1 42,46 +羟基硫代伐地那非 521.2 215 167.0*,99.1 65,42 +环戊那非 529.3 175 461.2*,98.1 43,43 +丙氧苯基硫代羟基豪莫西地那非 535.2 185 99.1*,299.1 42,47 +苄西地那非 551.2 185 377.1*,134.1 30,42 +桂地那非 555.3 175 117.0*,115.1 30,80 +罗地那非碳酸酯 518.3 120 230.2*,112.2 43,39 +丙氧苯基西地那非 489.2 170 166.2*,283.1 70,48 +乙酰胺基他达拉非 433.2 135 204.0*,135.0 74,22 +2-羟丙基去甲他达拉非 434.2 150 312.1*,135.0 14,26 +乙酰伐地那非 467.3 195 111.1*,151.0 34,54 +丙氧苯基羟基豪莫西地那非 519.2 175 99.1*,283.0 42,46 +丙氧苯基硫代艾地那非 519.2 160 299.0*,113.1 38,34 +育亨宾 355.2 155 144.0*,212.0 34,26 +达泊西汀 306.2 105 157.0*,127.0 26,62 +N-去乙基红地那非 439.2 180 99.1*,166.0 38,61 +去甲基硫代西地那非 477.2 175 299.1*,327.1 42,30 +N-叔丁氧羰基-N-去乙基红地那非 539.3 125 439.2*,99.1 18,46 +N-乙基他达拉非 404.2 120 282.1*,135.0 10,26 +O-去乙基西地那非 447.2 155 283.0*,299.1 30,34 +吡唑-N-去甲基西地那非 461.2 165 100.1*,269.0 30,42 +异丁基西地那非 489.2 170 297.1*,100.1 46,34 +西地那非二聚体杂质 835.2 225 283.1*,299.0 78,66 +伐地那非哌嗪酮 475.2 160 151.0*,312.1 58,42 +西地那非N-氧化物 491.2 185 99.1*,404.1 38,30 +伐地那非N-氧化物 505.2 130 151.0*,477.2 74,22 +2-羟乙基去甲他达拉非 420.2 120 298.1*,169.0 10,46 +伐地那非乙酰基类似物 438.2 190 98.1*,151.0 34,54 +米罗那非 532.3 200 296.1*,99.1 49,78 +亚硝地那非 630.2 160 141.9*,312.1 30,46 +硫喹哌非 449.2 145 204.0*,186.0 22,42 +氨基西地那非 406.2 165 364.1*,299.1 36,38 +去乙基卡巴地那非 425.2 135 339.1*,311.1 22,34 +双去碳西地那非 449.2 170 283.1*,311.1 42,30 +N-苯丙烯基他达拉非 505.2 145 383.0*,261.9 15,30 +N-去乙基-N-甲基伐地那非 475.2 200 151.0*,312.1 50,46 +硫代艾地那非 505.2 170 113.1*,99.1 34,42 +双氯地那非 407.1 185 379.0*,350.0 30,34 +哌唑那非 483.2 166 436.2*,166.0 34,58 +丙氧苯基硫代西地那非 505.2 200 299.0*,313.1 53,44 +丙氧苯基硫代豪莫西地那非 519.2 175 299.0*,113.1 42,34 +二硫代去乙基卡巴地那非 457.2 165 371.1*,343.0 26,38 +羟基硫代红地那非 499.2 220 143.1*,127.1 42,38 +他达拉非二氯代杂质 461.1 150 204.0*,135.0 78,22 +西地那非杂质12 499.2 160 343.0*,371.1 42,26 +去甲基哌嗪基西地那非磺酸 393.1 175 365.1*,256.0 30,42 +丙氧苯基艾地那非 503.2 185 283.0*,113.2 38,34 +西地那非杂质14 485.2 165 371.1*,343.0 26,38 +丙氧苯基异丁基艾地那非 517.3 200 297.3*,113.1 42,34 +脱哌嗪基硫代西地那非 407.1 -155 314.0*,378.1 -34,-22 —伐地那非二聚体 833.3 -165 282.0*,805.1 -60,-42 —
2 结果与分析
2.1 质谱条件优化
以针泵进样的方式,以5 μL/min的流速向质谱仪中注入100 ng/mL那非类物质标准溶液,确定其最佳质谱条件。分别在正、负离子模式下进行一级全扫描,确定目标化合物的母离子质量数。实验中发现,除脱哌嗪基硫代西地那非和伐地那非二聚体在负离子模式下的灵敏度远高于正离子模式外,其余88 种那非类物质均在正模式下的响应更高,这是由于这些物质的分子结构中均含有仲胺或叔胺等基团,适合正电离模式。确定目标化合物的母离子后,对母离子进行子离子全扫描,确定其定性和定量离子。优化子离子的去簇电压,碰撞能量等参数。目标化合物的定性和定量离子对的质谱检测参数见表1。
2.2 色谱条件优化
2.2.1 流动相的选择
采用正、负2 种离子模式采集,实验对比了分别在乙腈-水、甲醇-水流动相体系中不添加与添加0.1%甲酸、氨水时,90 种那非类物质的色谱峰形和离子化程度。结果发现,采用0.1%甲酸-乙腈体系时,90 种那非类物质的离子化效果普遍较好且峰形最佳,这是由于90 种那非类物质中除脱哌嗪基硫代西地那非、伐地那非二聚体外,其余均采用正离子模式采集,加入适量的甲酸会促进胺的电离,从而提高离子化效率,后续实验选用0.1%甲酸-乙腈体系作为流动相。
2.2.2 色谱柱的选择
90 种那非类物质中,母离子相同二级子离子相同或部分相同的同分异构体共有8 组,分别为母离子m/z 357.2的那非乙酰酸和那莫伐地那非;母离子m/z 438.2的苯噻啶红地那非和伐地那非乙酰基类似物;母离子m/z 467.3的红地那非、二甲基红地那非和乙酰伐地那非;母离子m/z 475.2的伐地那非哌嗪酮和N-去乙基-N-甲基伐地那非;母离子m/z 489.2的艾地那非、豪莫西地那非、伐地那非、丙氧苯基西地那非和异丁基西地那非;母离子m/z 505.2的羟基伐地那非和伐地那非N-氧化物;母离子m/z 519.2的丙氧苯基羟基豪莫西地那非、丙氧苯基硫代艾地那非和丙氧苯基硫代豪莫西地那非;母离子m/z 521.2的羟基硫代豪莫西地那非和羟基硫代伐地那非。
为使每种目标物都有较好的峰形和分离效果,本实验选择质量浓度为20 ng/mL的90 种那非类物质标准溶液,在相同的流动相和洗脱程序下,分别采用Waters Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、XBridge BEH Shield RP18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.5 μ m) 、 T h e r m o A c c u c o r e a Q C1 8色 谱 柱(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)、Hypersil Gold C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.9 μm)进行分离实验。结果表明:使用Thermo Accucorea Q C18和Hypersil Gold C18色谱柱时,豪莫西地那非和伐地那非不能分离,使用XBridge BEH Shield RP18色谱柱时育亨宾出峰稍有拖尾,使用Waters Acquity BEH C18色谱柱时,色谱峰峰形良好,且8 组同分异构体(图1)分离效果较为理想,故实验选择Waters Acquity BEH C18色谱柱进行分离。
图18 组同分异构体的液相色谱-质谱图
Fig. 1 Extracted ion chromatograms of 8 sets of isomers
2.3 前处理条件优化
90 种那非类物质均难容或不溶于水,易溶于极性有机溶剂,实验对比目标物添加量为50 μg/kg时,甲醇、乙腈和乙醇3 种溶剂的提取效果。结果表明:采用甲醇和乙腈作为提取溶剂的效果优于乙醇,二者提取结果基本一致,综合考虑溶剂毒性、成本等问题,最终选用甲醇作为提取溶剂。
2.4 线性范围、检出限和定量限结果
用上述优化的条件对保健食品中90 种那非类物质进行定量分析,用甲醇稀释标准溶液储备液,得到系列标准工作溶液,以目标物定量离子的色谱峰峰面积为纵坐标(Y),目标物质量浓度为横坐标(X)作线性回归方程,以3 倍和10 倍信噪比对应的空白样品添加质量浓度作为检出限和定量限。如表2所示,90 种那非类物质在0.2～50 ng/mL质量浓度范围内相关系数(r2)大于0.995,线性关系良好。检出限为2.5～25.0 μg/kg,定量限为5.0～50.0 μg/kg,远低于现有文献方法与标准方法(BJS 201805)。
表2 90 种化合物的线性关系、检出限、定量限
Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of 90 compounds
定量限/(μg/kg)西地那非 1～50 Y=6 306.887 15x+16 933.842 81 0.995 55 12.5 25他达拉非 0.2～50 Y=29 487.990 27x+25 847.969 41 0.999 27 2.5 5脱硫伐地那非 0.2～50 Y=3.372 49×105x+9.086 34×105 0.997 80 2.5 5庆地那非 1～50 Y=1.576 29×105x+2.140 15×105 0.999 25 12.5 25化合物 线性范围/(ng/mL) 回归方程 相关系数r2检出限/(μg/kg)
续表2
化合物 线性范围/(ng/mL) 回归方程 相关系数r2检出限/(μg/kg)定量限/(μg/kg)那非乙酰酸 2～50 Y=1.080 72×105x+9.294 95×104 0.999 09 25 50苯酰胺那非 0.5～50 Y=3.107 45×104x+9.263 85 0.997 10 5 12.5氨基他达拉非 1～50 Y=4.513 74×104x+19 392.520 18 0.998 01 12.5 25他达拉非甲基氯化物 2～50 Y=22 757.700 86x+11 379.721 46 0.998 42 25 50苯噻啶红地那非 0.5～50 Y=1.094 47×105x+3.015 56×105 0.999 01 5 12.5那红地那非 0.5～50 Y=9 177.682 22x+3 597.197 89 0.995 95 5 12.5卡巴地那非 0.2～50 Y=1.165 88×105x+2.793 40×105 0.996 02 2.5 5伪伐地那非 0.2～50 Y=2.358 63×105x 0.995 82 2.5 5那莫西地那非 0.2～50 Y=4.634 83×104x+12 904.595 06 0.996 46 2.5 5 N-去乙基伐地那非 1～50 Y=21 062.153 78x+27 494.789 77 0.997 09 12.5 25 N-去甲基西地那非 1～50 Y=10 009.784 98x+875.855 68 0.995 71 12.5 25红地那非 1～50 Y=13 326.831 04x+28 263.812 00 0.996 16 12.5 25羟基红地那非 2～50 Y=5 122.897 86x+16 251.440 22 0.995 75 25 50阿伐那非 0.2～50 Y=2.807 49×105x+3.191 77×105 0.996 12 2.5 5艾地那非 0.5～50 Y=11 123.959 63x+19 710.744 21 0.997 73 5 12.5豪莫西地那非 2～50 Y=5 514.331 04x+6 595.539 53 0.996 98 25 50伐地那非 0.2～50 Y=4.945 27×104x+5.022 58×104 0.996 43 2.5 5硫代西地那非 2～50 Y=1 751.075 55x+988.847 06 0.999 03 25 50硫代豪莫西地那非 1～50 Y=6 864.222 41x-2 277.551 92 0.999 39 12.5 25羟基伐地那非 0.5～50 Y=20 525.155 04x+6.398 86×104 0.996 39 5 12.5羟基豪莫西地那非 2～50 Y=5 268.242 07x+15 930.932 05 0.997 04 25 50乌地那非 0.5～50 Y=5.011 24×104x+3.741 33×104 0.999 21 5 12.5羟基硫代豪莫西地那非 2～50 Y=3 120.363 89x+1 820.303 95 0.995 79 25 50那莫伐地那非 0.2～50 Y=1.422 64×105x+3.994 61×105 0.999 12 2.5 5硝地那非 2～50 Y=1.372 90×105x+1.828 41×105 0.998 04 25 50去甲基他达拉非 0.5～50 Y=27 621.719 62x+6.627 61×104 0.998 97 5 12.5氯地那非 1～50 Y=13 023.205 88x 0.999 20 12.5 25羟基氯地那非 0.2～50 Y=1.796 99×105x+5.384 79×105 0.999 54 2.5 5 N-丁基他达拉非 0.2～50 Y=8.014 60×104x 0.996 61 2.5 5去甲基卡巴地那非 1～50 Y=7.070 30×104x+1.573 81×105 0.996 25 12.5 25去碳西地那非 1～50 Y=23 095.840 34x+23 225.983 10 0.999 24 12.5 25二甲基红地那非 1～50 Y=9 979.523 32x+3.433 74×104 0.996 11 12.5 25二硫代去甲基卡巴地那非 1～50 Y=7 399.621 10x+2 061.419 20 0.999 50 12.5 25酮红地那非 1～50 Y=23 382.899 56x+3.062 81×104 0.997 91 12.5 25 N-辛基去甲他达拉非 0.2～50 Y=7.237 35×104x+8.266 96×104 0.998 30 2.5 5双酮红地那非 0.2～50 Y=5.103 62×104x+1.216 97×105 0.995 89 2.5 5羟基硫代伐地那非 1～50 Y=12 405.090 46x 0.998 38 12.5 25环戊那非 1～50 Y=22 338.238 63x+26 645.048 98 0.998 64 12.5 25丙氧苯基硫代羟基豪莫西地那非 2～50 Y=3 712.240 61x-3 219.783 24 0.998 02 25 50苄西地那非 2～50 Y=11 063.312 78x+22 755.666 27 0.999 18 25 50桂地那非 2～50 Y=29 695.200 87x+9.756 35×104 0.997 94 25 50罗地那非碳酸酯 1～50 Y=4 286.522 83x+7 075.285 04 0.997 30 12.5 25丙氧苯基西地那非 2～50 Y=2 111.371 44x+4 706.377 82 0.996 19 25 50乙酰胺基他达拉非 1～50 Y=4 473.820 06x+11 475.414 58 0.998 47 12.5 25 2-羟丙基去甲他达拉非 2～50 Y=3.185 06×104x+5.444 67×104 0.995 55 25 50乙酰伐地那非 2～50 Y=2 669.741 78x+6 973.840 85 0.996 78 25 50丙氧苯基羟基豪莫西地那非 2～50 Y=4 718.506 18x+12 646.967 05 0.995 92 25 50丙氧苯基硫代艾地那非 1～50 Y=24 862.771 03x-11 250.409 41 0.996 93 12.5 25育亨宾 0.2～50 Y=1.784 17×105x+2.389 07×105 0.998 67 2.5 5达泊西汀 0.5～50 Y=9.413 11×104x+1.692 18×105 0.995 41 5 12.5 N-去乙基红地那非 1～50 Y=22 726.351 19x+7 787.153 72 0.999 32 12.5 25去甲基硫代西地那非 1～50 Y=15 669.847 85x+17 390.408 24 0.998 05 12.5 25 N-叔丁氧羰基-N-去乙基红地那非 1～50 Y=4.522 93×104x+19 962.932 10 0.996 16 12.5 25 N-乙基他达拉非 0.2～50 Y=3.581 39×104x+5.522 09×104 0.997 65 2.5 5 O-去乙基西地那非 0.5～50 Y=3.155 73×104x+5.458 00×104 0.999 05 5 12.5吡唑N-去甲基西地那非 1～50 Y=7 136.728 52x+6 939.782 02 0.999 17 12.5 25异丁基西地那非 2～50 Y=10 372.272 09x+23 875.272 40 0.998 00 25 50
续表2
定量限/(μg/kg)西地那非二聚体杂质 2～50 Y=5 909.500 27x-54.093 86 0.998 90 25 50伐地那非哌嗪酮 0.2～50 Y=5.882 27×104x+1.309 25×105 0.998 28 2.5 5西地那非N-氧化物 2～50 Y=4 897.222 91x 0.995 48 25 50伐地那非N-氧化物 2～50 Y=8 777.117 06x+3.470 89×104 0.998 17 25 50 2-羟乙基去甲他达拉非 0.5～50 Y=26 534.965 36x+15 502.910 95 0.999 33 5 12.5伐地那非乙酰基类似物 0.2～50 Y=22 408.110 16x+5.478 76×104 0.999 29 2.5 5米罗那非 0.5～50 Y=14 115.279 77x+23 389.521 76 0.998 21 5 12.5硫喹哌非 1～50 Y=4.174 92×104x+777.118 41 0.999 71 12.5 25氨基西地那非 0.2～50 Y=1.171 77×105x+2.409 58×105 0.996 40 2.5 5去乙基卡巴地那非 0.5～50 Y=3.489 80×104x 0.997 78 5 12.5双去碳西地那非 1～50 Y=193 75.390 88x+25 473.029 27 0.998 44 12.5 25 N-去乙基-N-甲基伐地那非 0.5～50 Y=4.644 73×104x+1.408 68×105 0.995 26 5 12.5硫代艾地那非 2～50 Y=5 926.769 40x+163.958 14 0.997 40 25 50双氯地那非 0.2～50 Y=1.965 59×105x+2.625 75×105 0.998 25 2.5 5哌唑那非 1～50 Y=20 528.513 27x+3.504 55×104 0.995 58 12.5 25丙氧苯基硫代西地那非 1～50 Y=6 406.395 64x+1 056.323 91 0.998 72 12.5 25丙氧苯基硫代豪莫西地那非 1～50 Y=9 926.676 41x-3 347.528 38 0.998 68 12.5 25二硫代去乙基卡巴地那非 2～50 Y=9 080.946 17x-5 273.869 21 0.998 55 25 50羟基硫代红地那非 2～50 Y=3 987.122 95x-2 972.721 77 0.995 26 25 50他达拉非二氯代杂质 0.2～50 Y=25 320.498 36x+10 314.015 77 0.995 79 2.5 5西地那非杂质12 1～50 Y=16 286.635 16x-16 427.275 39 0.998 49 12.5 25去甲基哌嗪基西地那非磺酸 1～50 Y=4.241 43×104x+5.612 80×104 0.997 26 12.5 25丙氧苯基艾地那非 1～50 Y=18 323.918 10x+3.207 70×104 0.997 70 12.5 25西地那非杂质14 0.5～50 Y=19 550.914 63x-9 526.927 60 0.998 66 5 12.5丙氧苯基异丁基艾地那非 0.5～50 Y=22 440.178 94x+5.650 68×104 0.996 19 5 12.5亚硝地那非 2～50 Y=706.220 58x+1 925.213 14 0.998 06 25 50 N-苯丙烯基他达拉非 2～50 Y=1 168.961 56x+4 780.720 38 0.995 27 25 50脱哌嗪基硫代西地那非 2～50 Y=924.810 42x+265.666 68 0.999 03 25 50伐地那非二聚体 2～50 Y=3 716.984 83x+6 587.736 96 0.998 62 25 50化合物 线性范围/(ng/mL) 回归方程 相关系数r2检出限/(μg/kg)
2.5 回收率和精密度结果
在固态、液态空白基质中添加90 种那非类物质标准溶液制成阳性样品,添加水平分别为1 倍定量限、3 倍定量限和10 倍定量限,每个添加水平进行6 次重复实验,计算回收率和相对标准偏差(relative standard deviations,RSD),回收率结果见表3。添加量为5.0～500 μg/kg时,90 种那非在固态样品中回收率为78.0%～109.9%,RSD为0.20%～9.96%,在液态样品中回收率为80.5%～109.8%,RSD为1.25%～7.34%,符合检验方法要求。
表3 90 种化合物的回收率
Table 3 Spiked recoveries of the 90 compounds%
化合物 固态样品 液态样品1 倍定量限 3 倍定量限 10 倍定量限 1 倍定量限 3 倍定量限 10 倍定量限西地那非 97.2 84.3 93.9 96.8 83.4 95.0他达拉非 109.6 84.5 94.7 99.7 86.6 89.6脱硫伐地那非 92.4 81.0 89.4 94.5 83.8 84.4庆地那非 105.4 82.5 85.0 102.4 85.6 91.7那非乙酰酸 107.2 92.2 96.1 106.4 98.8 95.5苯酰胺那非 78.0 87.2 98.6 84.3 86.2 97.5氨基他达拉非 109.9 85.7 86.3 94.5 98.7 90.3他达拉非甲基氯化物 107.8 88.0 94.4 95.3 96.8 93.5苯噻啶红地那非 87.5 92.3 92.1 97.4 92.3 91.6那红地那非 107.7 100.6 84.2 102.5 104.8 97.3卡巴地那非 98.6 101.4 108.7 98.1 87.6 97.5
续表3%
化合物 固态样品 液态样品1 倍定量限 3 倍定量限 10 倍定量限 1 倍定量限 3 倍定量限 10 倍定量限伪伐地那非 106.8 96.6 89.3 104.6 95.2 97.3那莫西地那非 107.7 89.4 87.8 106.5 89.2 88.2 N-去乙基伐地那非 97.4 80.4 85.1 109.8 85.8 84.3 N-去甲基西地那非 102.1 94.2 95.7 91.6 92.0 94.8红地那非 109.8 83.5 96.8 102.6 81.5 89.3羟基红地那非 90.5 82.4 105.2 97.3 98.0 97.2阿伐那非 102.1 82.5 88.8 83.3 87.6 86.2艾地那非 101.9 81.1 92.1 96.7 97.3 97.9豪莫西地那非 105.4 84.1 90.2 96.1 84.7 88.0伐地那非 109.0 102.2 95.1 91.9 97.6 91.7硫代西地那非 87.9 84.9 92.3 89.0 85.7 91.1硫代豪莫西地那非 107.9 104.8 87.3 95.5 96.7 94.8羟基伐地那非 88.6 87.3 92.7 90.4 105.8 104.2羟基豪莫西地那非 87.7 84.4 102.9 91.8 107.2 101.4乌地那非 109.8 81.1 80.0 90.2 91.4 86.5羟基硫代豪莫西地那非 96.3 88.8 82.9 89.1 86.5 91.4那莫伐地那非 89.9 80.4 91.1 94.3 96.2 95.2硝地那非 106.2 80.2 88.1 91.1 107.6 105.2去甲基他达拉非 94.6 83.9 93.2 91.1 84.1 107.3氯地那非 106.2 94.8 93.0 95.7 98.0 97.5羟基氯地那非 82.1 83.4 84.6 91.3 92.2 91.5 N-丁基他达拉非 108.2 95.1 89.2 105.1 104.7 109.3去甲基卡巴地那非 106.4 105.2 106.3 108.2 103.0 97.9去碳西地那非 105.2 82.7 80.1 100.1 102.9 101.5二甲基红地那非 98.6 88.5 96.3 101.8 104.3 90.1二硫代去甲基卡巴地那非 87.1 83.6 102.3 83.2 91.0 84.7酮红地那非 108.1 107.1 108.0 100.2 107.2 99.8 N-辛基去甲他达拉非 105.9 80.7 91.7 89.1 91.4 98.2双酮红地那非 101.9 104.7 108.4 82.6 80.5 100.7羟基硫代伐地那非 109.5 103.3 106.4 90.4 91.3 96.5环戊那非 109.3 104.3 92.1 98.9 97.7 96.2丙氧苯基硫代羟基豪莫西地那非 107.6 98.1 81.7 94.5 104.2 108.4苄西地那非 106.1 92.1 93.3 105.7 109.2 87.9桂地那非 100.6 90.1 109.0 105.1 101.2 109.2罗地那非碳酸酯 95.9 80.2 95.4 90.3 98.7 102.6丙氧苯基西地那非 103.0 80.2 85.5 102.5 108.3 92.1乙酰胺基他达拉非 102.5 82.8 97.0 99.4 98.2 97.1 2-羟丙基去甲他达拉非 106.0 86.3 105.8 86.3 97.5 95.0乙酰伐地那非 104.5 109.4 108.6 91.1 90.3 92.6丙氧苯基羟基豪莫西地那非 100.8 80.7 105.2 95.8 92.7 88.8丙氧苯基硫代艾地那非 108.1 95.1 86.2 107.5 91.5 90.8育亨宾 107.4 81.0 98.4 96.3 96.2 97.7达泊西汀 107.0 95.8 97.9 99.4 101.1 90.3 N-去乙基红地那非 105.5 81.8 84.2 85.1 89.2 89.7去甲基硫代西地那非 95.2 94.0 109.5 104.0 95.8 108.4 N-叔丁氧羰基-N-去乙基红地那非 81.3 81.7 107.2 85.8 83.2 90.9 N-乙基他达拉非 80.5 94.1 103.0 81.7 89.8 92.4 O-去乙基西地那非 92.4 80.3 91.5 89.7 94.3 92.9吡唑N-去甲基西地那非 89.8 82.1 82.9 92.5 89.6 90.1异丁基西地那非 102.7 80.5 94.5 81.5 93.2 89.2西地那非二聚体杂质 98.0 84.7 98.2 100.7 98.0 99.3伐地那非哌嗪酮 83.2 87.3 88.7 81.3 82.6 89.1西地那非N-氧化物 108.4 101.0 98.8 93.3 88.7 81.4
续表3 %
化合物 固态样品 液态样品1 倍定量限 3 倍定量限 10 倍定量限 1 倍定量限 3 倍定量限 10 倍定量限伐地那非N-氧化物 95.9 97.9 102.6 89.2 90.2 102.8 2-羟乙基去甲他达拉非 83.1 89.5 108.7 82.1 93.7 90.2伐地那非乙酰基类似物 99.9 103.9 107.5 89.1 100.1 92.4米罗那非 95.6 93.2 106.2 106.0 98.5 99.4硫喹哌非 106.9 108.5 98.2 105.5 108.1 95.7氨基西地那非 88.0 84.4 96.5 89.3 90.5 92.4去乙基卡巴地那非 88.8 94.4 83.1 86.0 89.3 91.1双去碳西地那非 85.5 82.0 92.2 94.2 94.3 91.0 N-去乙基-N-甲基伐地那非 97.8 92.1 101.6 96.3 86.1 94.5硫代艾地那非 92.1 86.4 97.9 94.5 90.0 92.2双氯地那非 85.2 82.1 91.4 85.1 85.7 91.4哌唑那非 105.4 106.8 103.2 107.2 104.7 104.0丙氧苯基硫代西地那非 94.5 98.0 99.8 94.2 97.0 89.4丙氧苯基硫代豪莫西地那非 105.3 102.8 96.9 103.0 105.6 97.1二硫代去乙基卡巴地那非 107.2 107.6 105.4 109.2 108.2 99.7羟基硫代红地那非 86.0 84.8 92.8 85.1 95.5 92.6他达拉非二氯代杂质 84.3 84.8 85.2 83.6 88.9 87.5西地那非杂质12 108.2 107.8 108.4 106.6 105.8 99.2去甲基哌嗪基西地那非磺酸 105.4 91.8 103.2 102.4 95.3 107.1丙氧苯基艾地那非 90.4 82.6 90.2 95.5 92.4 100.2西地那非杂质14 96.6 93.8 104.3 96.3 92.1 89.0丙氧苯基异丁基艾地那非 93.7 80.0 95.9 81.2 92.5 94.3亚硝地那非 105.6 106.8 92.2 84.4 87.1 89.2 N-苯丙烯基他达拉非 101.8 100.5 107.4 99.8 102.4 101.4脱哌嗪基硫代西地那非 107.6 102.2 109.4 107.2 99.3 92.7伐地那非二聚体 105.3 91.1 109.9 98.4 95.6 99.7
2.6 实际样品检测结果
应用本研究建立的方法对市场以及网上购买的10 批次固态和液态保健食品进行检测,结果发现有1 批次保健酒样品检测出含有西地那非(2.83×105 μg/kg)、1 批次片剂样品检测出含有他达拉非(3.85×106 μg/kg)。
3 结 论
本研究建立超高效液相色谱-串联质谱检测保健食品中90 种那非类物质的分析方法,并进行方法学验证。该方法简单高效、选择性好、灵敏度高,满足大量保健品中那非类物质快速、准确定量的需要。可为基质中那非类物质的检测提供方法参考,也可为打击保健食品行业非法添加化学药物行为提供有利依据。
[1] 朱捷, 何微, 马桂娟. HPLC-MS/MS法同时测定补肾壮阳类保健食品中非法添加11 种化药成分[J]. 当代化工, 2015, 44(11): 2729-2732. DOI:10.3969/j.issn.1671-0460.2015.11.084.
[2] 张健, 丁涛, 刘芸, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定保健品中9 种非法添加的壮阳类化学药物[J]. 环境化学, 2016, 35(2): 415-418.
[3] 张圆, 闵春燕, 郝刚, 等. 保健食品中非法添加化学药物的检测方法[J]. 中国职业药师, 2014, 11(7): 35-39. DOI:10.3969/j.issn.1672-5433.2014.07.009.
[4] LEE E S, LEE J H, HAN K M, et al. Simultaneous determination of 38 phosphodiestrase-5 inhibitors in illicit erectile dysfunction products by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2013, 83(1): 171-178. DOI:10.1016/j.jpba.2013.05.009.
[5] LEE S, JI D, PARK M, et al. Development of a comprehensive spectral library of sildenafil and related active analogues using LC-QTOFMS and its application for screening counterfeit pharmaceuticals[J].Forensic Science International, 2015, 257: 182-188. DOI:10.1016/j.forsciint.2015.08.016.
[6] 来国防, 程宾, 王梅. 补肾壮阳类中药制剂中非法添加化学药物成分的检测[J]. 中国药业, 2010, 19(22): 32-33. DOI:10.3969/j.issn.1006-4931.2010.22.020.
[7] 李锐, 陈国彪. UPLC-Q-TOF-MS法快速检测补肾壮阳类中成药中11 个PDE5型抑制剂类药物[J]. 药物分析杂志, 2014(5): 879-884.DOI:10.16155/j.0254-1793.2014.05.021.
[8] 李航, 陈小泉, 杜钢, 等. 保健食品中11 种西地那非类药物的检测[J].生命科学仪器, 2014, 12(3): 39-44.
[9] 李萍, 杨金易, 张燕, 等. 保健食品中西地那非检测方法的研究进展[J].食品安全质量检测学报, 2012, 3(6): 705-709.
[10] 严爱花, 李贤良, 郗存显, 等. 液相色谱-串级质谱法同时检测中成药及保健食品中非法添加的22 种苯二氮卓类药物[J]. 分析化学,2013, 41(4): 509-516. DOI:10.3724/SP.J.1096.2013.20694.
[11] 王铁松, 全禹, 郑洁, 等. 薄层色谱法快速筛查降脂、降压、止咳平喘类中药制剂中的29 种添加化学药物[J]. 中国药学杂志, 2010,45(11): 857-861.
[12] 李启红. 中药及保健品中非法添加3 种PDE5抑制剂的TLC-SERS检测方法研究[J]. 中国当代医药, 2017, 24(21): 85-88. DOI:10.3969/j.issn.1674-4721.2017.21.028.
[13] 陈希, 吴鑫, 鄢雷娜, 等. 高效液相色谱法同时测定抗疲劳保健食品中的3 种违禁成分[J]. 现代预防医学, 2016, 43(19): 3499-3501.
[14] 林芳, 李涛, 耿庆光, 等. 超高效液相色谱-二极管阵列检测器法快速测定保健食品中违法添加的14 种性功能药物[J]. 食品科学, 2014,35(4): 163-169. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201404034.
[15] 廖瑜. HPLC快速筛查抗风湿类中成药及保健品中非法添加的10 种化学药[J]. 中国现代应用药, 2014, 31(7): 868-871. DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2014.07.026.
[16] MAHMOUDIAN M, FALAHATPISHE H, TAYEBI L, et al.Determination of pharmacokinetic parameters of sildenafil in iranian volunteers by an HPLC method[J]. Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences, 2010, 7(1): 69-74.
[17] 刘芸, 丁涛, 廖雪晴, 等. 高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱法快速筛查中成药和保健食品中非法添加的42 种化学药物[J]. 分析化学, 2016, 44(3): 423-429. DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.150726.
[18] DAMIANO F, SILVA C, GREGORI A, et al. Analysis of illicit dietary supplements sold in the Italian market: identification of a sildenafil thioderivative as adulterant using UPLC-TOF/MS and GC/MS[J].Science and Justice, 2014, 54(3): 228-237. DOI:10.1016/j.scijus.2014.02.009.
[19] LEE S, JI D, PARK M, et al. Development of a comprehensive spectral library of sildenafil and related active analogues using LC-QTOF-MS and its application for screening counterfeit pharmaceuticals[J].Forensic Science International, 2015, 257: 182-188. DOI:10.1016/j.forsciint.2015.08.016.
[20] KIM E H, SEO H S, KI N Y, et al. Reliable screening and confirmation of 156 multi-class illegal adulterants in dietary supplements based on extracted common ion chromatograms by ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole/time of flight-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A, 2017, 1491: 43-56.
[21] 于泓, 胡青, 张甦, 等. 补肾壮阳类中药及保健食品中31 种5型磷酸二酯酶抑制剂的高分辨四极杆飞行时间质谱定性定量检测方法[J]. 中国药学杂志, 2013, 48(15): 1312-1318. DOI:10.11669/cpj.2013.15.019.
[22] MUSTAZZA C, BORIONI A, RODOMONTE A L, et al.Characterization of sildenafil analogs by MS/MS and NMR:a guidance for detection and structure elucidation of phosphodiesterase-5 inhibitors[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014,96(6): 170-186. DOI:10.1016/j.jpba. 2014.03.038.
[23] 张翠英, 李振国, 徐金玲, 等. UPLC/MS/MS法检测补肾壮阳类中成药中非法添加枸橼酸西地那非的定性定量研究[J].中国卫生检验杂志, 2007, 17(10): 1741-1742. DOI:10.3969/j.issn.1004-8685.2007.10.006.
[24] 高咏莉, 邬晓鸥, 肖丽和, 等. HPLC-MS-MS法测定补肾壮阳类药品或保健品中非法添加羟基豪莫西地那非的研究[J]. 中成药, 2009,31(7): 1058-1061. DOI:10.3969/j.issn.1001-1528.2009.07.022.
[25] WANG L, ZHENG X, ZHONG W, et al. Validation and application of an LC-MS-MS method for the determination of ceftizoxime in human serum and urine[J]. Journal of Chromatographic Science, 2016, 54(5):713-719.
[26] SHAH P A, SHAH J V, SANYAL M, et al. LC-MS/MS analysis of metformin, saxagliptin and 5-hydroxy saxagliptin in human plasma and its pharmacokinetic study with a fixed-dose formulation in healthy Indian subjects[J]. Biomedical Chromatography, 2017, 31(3):c3809-c3819.
[27] 马俊美, 孙磊, 刘茁, 等. 在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉和羊肉中10 种β-受体激动剂[J]. 肉类研究, 2018, 32(5):19-25. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201805004.
[28] 白艳梅, 张立佳, 李翠枝, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定液态乳中的壬基酚[J]. 乳业科学与技术, 2018, 41(4): 11-15.DOI:10.15922/j.cnki.jdst.2018.04.003.
[29] 黄芳, 吴惠勤, 黄晓兰, 等. 高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健品及中成药中非法添加的17 种壮阳类化学药[J]. 色谱, 2016, 34(3):270-278. DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.11016.
[30] BITSIKA V, DUVEAU V, SIMON-ARECES J, et al. High-throughput LC-MS/MS proteomic analysis of a mouse model of mesiotemporal lobe epilepsy predicts microglial activation underlying disease development[J]. Journal of Proteome Research, 2016, 15(5): 1546-1562. DOI:10.1021/acs.jproteome.6b00003.
[31] LIEW K B, LOH G O, TAN Y T, et al. Simultaneous quantification of sildenafil and N-desmethyl sildenafil in human plasma by UFLC coupled with ESI-MS/MS and pharmacokinetic and bioequivalence studies in Malay population[J]. Biomedical Chromatography, 2015,29(6): 953-960. DOI:10.1002/bmc.3378.
[32] 孙健, 胡青, 张甦, 等. 超高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定保健食品中30 种非法添加壮阳类化合物[J]. 分析测试学报, 2018, 37(4):419-426. DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2018.04.006.