肺癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在众多恶性肿瘤中增长最快,并对人群健康及生命产生了巨大威胁[1],其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）在我国发病率和死亡率最高[2-4],且发病率逐年增高。目前,化疗是临床肺癌综合治疗的重要手段之一[5]。顺铂（cisplatin,DDP）作为广谱抗肿瘤药物,能与肿瘤细胞中DNA发生交叉联结,破坏DNA功能,从而能激活肿瘤细胞的凋亡途径。对于晚期NSCLC,最常用的化疗方案是以铂类为基础的双药联合治疗,但由于肺癌对化疗药物极易产生耐药性,且DDP的长期大剂量使用会造成患者强烈的不良反应,降低了临床化疗的效率[6]。因此,肺癌的化疗耐药性已成为临床治疗的热点问题。
枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides,LBP）是枸杞的主要有效成分之一,具有抗衰老、降血糖、降血脂和增强机体免疫功能的作用及抗肿瘤功效[7-8]。崔晓燕等[9]通过实验观察发现LBP对HeLa细胞有明显的抑制作用,并呈现剂量依赖性。研究表明,LBP对人前列腺癌DU145细胞、小鼠肝癌细胞H22瘤株均有不同程度抑制和促凋亡作用[10-12]。
前期研究结果显示,LBP对DDP引起的肾毒性、生殖毒性均有良好的保护作用[13-14],而LBP对DDP抗癌作用的影响鲜见报道。本实验建立了A549 DDP损伤细胞模型并通过LBP-DDP联合处理,探讨LBP联合DDP对人肺腺癌细胞A549损伤的影响及可能的作用机制,为LBP在临床发挥其抗癌作用并辅助DDP化疗增敏作用提供理论依据,以期提高癌症患者的治疗效果。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人肺腺癌细胞A549 北京协和医院基础学院细胞中心。
DDP（注射用冻干粉剂） 山东齐鲁制药有限公司；LBP（纯度≥99%） 南京泽朗医药科技有限公司；DMEM/F12培养基、胰酶、CCK-8试剂盒、细胞凋亡试剂盒 美国Genview公司；胎牛血清 美国HyClone公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、Bax抗体、Bcl-2抗体、caspase-3抗体 博士德生物技术有限公司；β-肌动蛋白（β-actin）抗体、HRP标记山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）抗体、山羊抗兔IgG抗体、高效化学发光（efficient chemiluminescence,ECL）试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限公司；丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；活性氧（reaction oxygen species,ROS）检测试剂盒 碧云天生物技术研究所。
1.2 仪器与设备
FACS Calibar流式细胞仪 美国BD公司；多功能酶标仪 美国Thermo公司；WFZ UV-4802H紫外-可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；TE2000-M倒置显微镜 日本Nikon公司。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
A549细胞采用10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养基,置于37 ℃、CO2体积分数5%、饱和湿度培养箱中培养。待细胞汇合度至80%～90%时,胰酶消化,按1∶3进行传代培养,取对数生长期细胞用于后续实验。
1.3.2 A549细胞增殖和CCK-8法测定
取100 μL（1×105 个/mL）处于对数生长期的A549细胞接种到96 孔板中孵育,待细胞至融合状态时,弃原培养液,每孔加入含100 μL不同质量浓度DDP（0、1、2、4、8、16、32、64、128 mg/L）的无血清培养基,每组设6 个复孔,在37 ℃、含5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h,弃培养液,各孔加入100 μL含10% CCK-8的培养基,继续孵育4 h,450 nm波长处检测吸光度A,按式（1）计算细胞存活率。
1.3.3 LBP对A549细胞存活率的影响
同1.3.1节的方法,将DDP换成不同质量浓度的LBP（0、2、4、8、16、32、64、128 mg/L）,并按照式（1）计算细胞存活率。
1.3.4 LBP联合DDP用药对A549细胞存活率的影响
根据1.3.2节和1.3.3节计算所得DDP和LBP两种药对A549细胞的半抑制浓度（half-inhibitory concentration,IC50）,并基于两者的IC50值,将DDP和LBP分别以两种不同质量浓度（6、12 mg/L DDP,8、16 mg/L LBP）组合。再用CCK-8法检测存活率。另设不加药对照组及LBP和DDP单独用药组,将100 μL（1×105 个/mL）处于对数生长期的细胞接种于96 孔板中,待细胞生长至融合状态时,按照上述分组,每组设6 个复孔,在37℃、含5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h后,弃培养液,各孔加入100 μL含10% CCK-8的培养基,继续孵育4 h,450 nm波长处检测吸光度A。按照式（1）计算细胞存活率。
1.3.5 A549细胞内蛋白浓度及抗氧化指标的测定
将2 mL（5×104 个/mL）处于对数生长期的细胞接种至6 孔板,待细胞生长至融合状态时,对各组进行药物处理。根据1.3.4节所得各组的最佳浓度,在37 ℃、含5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h后,在培养瓶中加入适量冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）,冰浴条件下用细胞刮收集细胞,制成细胞悬液,1 000 r/min离心10 min,弃上清液留细胞沉淀。用1 mL PBS洗涤细胞2 次。PBS重悬后,于细胞破碎仪上30 Hz,10 s破碎。取出离心管,12 000 r/min离心10 min,收集上清液用于后续检测。按照试剂盒说明进行细胞蛋白浓度和MDA、GSH含量以及SOD活力测定。
1.3.6 流式细胞术检测A549细胞内ROS相对含量
按照1∶1 000用无血清DMEM/F12培养液稀释DCFHDA,使终浓度为10 μmol/L。按1.3.5节分组将生长状态良好的A549细胞接种至6 孔板培养24 h,弃旧细胞培养液,PBS洗涤,加入1 mL稀释好的DCFH-DA。37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。无血清细胞培养液洗涤细胞3 次除去未进入细胞的探针DCFH-DA,0.25%不含EDTA胰酶消化各孔细胞,轻轻吹打,制成单细胞悬液,1 000 r/min离心5 min,收集细胞,500 μL PBS重悬细胞。200 目滤网过筛收集细胞于流式管内,采用激发光波长480 nm,发射光波长530 nm,上机检测。Cell Quest Pro软件测定ROS平均荧光强度,以其表示ROS相对含量。
1.3.7 流式细胞术检测细胞凋亡率
按1.3.5节分组,将生长状态良好的A549细胞接种至6 孔板,于37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中培养24 h。按照实验分组用药处理各组细胞,继续培养24 h,胰酶消化细胞,含血清培养基终止消化并重悬,1 000 r/min、4 ℃离心10 min,弃上清液；1 mL PBS重悬；离心10 min,弃上清液；重复洗涤2 次；然后用Annexin V-FITC双染法测定A549细胞凋亡率。
1.3.8 Western blot法检测细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的相对表达量
将1.3.5节中各药物组处理的细胞蛋白上清液,分别按5×上样缓冲液与蛋白样品1∶4（V/V）比例混匀煮沸。以每孔50 μg蛋白上样量对蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）,转膜,质量分数5%脱脂奶粉温室封闭1 h,三羟甲基氨基甲烷-盐酸-吐温20缓冲液（Tris buffered saline and tween 20,TBST）洗3 次,分别加入Bcl-2（1∶200）、Bax（1∶200）、Caspase-3（1∶200）及β-actin（1∶500）一抗,4 ℃孵育过夜；TBST洗3 次,加入对应二抗（1∶10 000）37 ℃孵育1 h,TBST洗3 次,化学发光成像系统曝光,Quantity One4.4.0软件测定蛋白条带灰度值,并按式（2）计算蛋白相对表达量。
1.4 数据统计分析
使用SPSS 22.0软件进行数据统计分析,结果以
±s表示,多组间数据比较使用单因素方差分析,P＜0.05为显著差异,P＜0.01为极显著差异。用Origin 9.1软件作图。
2 结果与分析
2.1 DDP对A549细胞的抑制作用
图1 不同质量浓度DDP对A549细胞存活率的影响（n＝3）
Fig.1 Effect of different concentrations of DDP on the viability of A549 cells (n = 3)
如图1所示,用不同质量浓度的DDP处理A549细胞24 h后,细胞生长受到不同程度的抑制,随着DDP质量浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,且呈现剂量依赖性。与对照组相比,各用药组细胞存活率具有极显著差异（P＜0.01）。通过SPSS软件计算,DDP对细胞的IC50为11.90 mg/L。
2.2 LBP对A549细胞的抑制作用
如图2所示,当LBP质量浓度大于8 mg/L时,对A549细胞增殖具有明显的抑制作用,且呈现一定的剂量依赖性,提示一定质量浓度的LBP可以抑制A549细胞活力,由SPSS软件计算得到LBP对A549细胞的IC50为16.27 mg/L。
图2 不同质量浓度LBP对A549细胞存活率的影响（n＝3）
Fig.2 Effect of different concentrations of LBP on the viability of A549 cells (n = 3)
2.3 LBP联合DDP对A549细胞存活率的影响
对于后续的实验,加药后细胞存活率太低,后期细胞进行流式检测时,细胞碎片太多,影响检测结果；细胞存活率太高,则较难检测出细胞损伤。如表1所示,基于各药物组对A549细胞的半抑制率IC50值,DDP对A549细胞的1/2 IC50约为6 mg/L,且LBP质量浓度不小于8 mg/L时,A549细胞存活率为（50.1±5.2）%,最接近50%。因此选用DDP质量浓度为6 mg/L,LBP质量浓度为8 mg/L进行后续实验。
表1 LBP与DDP联合作用对A549细胞存活率的影响（n＝3）
Table 1 Effect of LBP combined with DDP on the survival rate of A549 cells (n= 3)
%
LBP质量浓度/（mg/L）DDP质量浓度/（mg/L）0 6 12 0 100.000±1.275 68.830±2.550 49.020±0.986 8 76.700±1.402 50.100±1.942 39.990±1.485 16 58.400±1.739 47.020±1.248 30.560±1.667
2.4 LBP联合DDP对A549细胞内抗氧化指标的影响
2.4.1 LBP联合DDP对A549细胞中SOD活力、GSH和MDA含量的影响
图4 LBP联合DDP对A549细胞内抗氧化指标的影响（n＝3）
Fig.4 Effects of LBP combined with DDP on GSH and MDA contents in A549 cells (n = 3)
由图4可知,与对照组相比,DDP导致细胞内SOD活力和GSH含量极显著降低,MDA含量极显著升高（P＜0.01）；LBP单独作用与对照组比较对细胞内SOD活力和GSH、MDA含量无明显变化。LBP+DDP组SOD活力、GSH和MDA含量与对照组比较有极显著差异（P＜0.01）,但与DDP组相比无显著性差异。
2.4.2 LBP联合DDP对A549细胞内ROS含量的影响
由图5和表2可知,与对照组相比,DDP单独处理极显著增加了A549细胞内ROS含量（P＜0.01）,而LBP单独处理可极显著降低A549细胞内ROS含量（P＜0.01）,且LBP和DDP联合处理后,细胞内ROS含量与对照组相比无显著性变化。
图5 流式细胞术检测LBP联合DDP对A549细胞ROS含量的影响（n＝ 3）
Fig.5 Effect of LBP combined with DDP on ROS content in A549 cells (n = 3)
表2 LBP联合DDP对A549细胞ROS相对含量的影响（n＝ 3）
Table 2 Effect of LBP combined with DDP on ROS content in A549 cells (n= 3)
注：同行肩标小写字母不同表示差异极显著（P＜0.01）,表3同。
组别 对照 DDP LBP DDP+LBP ROS相对含量 1.000±0.032a 1.257±0.018b 0.854±0.063c 1.019±0.142a
2.5 LBP联合DDP对A549细胞凋亡率的影响
用Annexin V-FITC双染法检测A549细胞凋亡率,由表3可知,DDP能极显著增加A549细胞凋亡率（P＜0.01）,且LBP联合DDP处理后,细胞凋亡率极显著高于DDP组（P＜0.01）,表明LBP可促进DDP诱导的细胞凋亡,提示两者具有联合作用。
表3 LBP联合DDP对A549细胞凋亡率的影响（n ＝3）
Table 3 Effect of LBP combined with DDP on the apoptosis rate of A549 cells (n= 3)
组别 对照 DDP LBP DDP+LBP细胞凋亡率/% 3.57±1.30a28.36±3.47b 5.25±0.93a45.55±6.04d
2.6 LBP联合DDP对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响
图6 LBP联合DDP对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响（n＝ 3）
Fig.6 Effect of LBP combined with ciplatin on apoptosis-related protein expression in A549 cells (n = 3)
为了进一步探讨LBP联合DDP对A549细胞凋亡的影响,本实验采用Western blot 检测了不同药物组细胞内Bcl-2、Bax和活性Caspase-3的相关蛋白表达。结果如图6和表4所示,与对照组相比,DDP和LBP均能极显著上调Bax及Bax/Bcl-2,且DDP能极显著降低Bcl-2的表达量并上调活性Caspase-3（P＜0.01）,而LBP单独用药组Bcl-2和活性Caspase-3表达量与对照组相比无明显差异。LBP和DDP联合处理组细胞内凋亡相关蛋白的表达与对照组及LBP组均有极显著性差异（P＜0.01）,与DDP相比,除Bcl-2外,其他蛋白表达水平均极显著性升高（P＜0.01）。结果表明,LBP联合DDP可能通过上调Bax、活性Caspase-3表达及Bax/Bcl-2水平来调控A549细胞凋亡。
表4 不同药物处理组细胞相关蛋白的相对表达量（n＝3）
Table 4 Relative expression of apoptosis-associated proteins in different drug treatment groups (n= 3)
注：同列肩标小写字母不同表示差异极显著（P＜0.01）。
组别 蛋白相对表达量Bcl-2 Bax Bax/Bcl-2 活性Caspase-3对照 0.515±0.044a 0.263±0.005a 0.482±0.002a 0.553±0.036a DDP 0.378±0.023b 0.454±0.002b 1.201±0.029b 0.782±0.137b LBP 0.540±0.026a 0.369±0.012c 1.311±0.015c 0.592±0.053a DDP+LBP 0.328±0.290b 0.706±0.007d 2.153±0.018d 1.141±0.127c
3 讨 论
DDP是目前广泛采用且效果较好的治疗肺癌的化疗药物,DDP的抗癌活性是由环境中氯离子浓度决定的。在血液及细胞外组织液中,氯离子浓度高,DDP相对稳定。而当其进入细胞液后,氯离子浓度很低,DDP中的两个氯离子会被水所取代,形成水合物。这种水合物很容易与DNA发生加成反应,形成交联,从而使DNA的复制转录遭到破坏,细胞周期停滞,导致细胞凋亡。由于肿瘤细胞分裂旺盛,所以肿瘤细胞较正常细胞对DDP造成的DNA 损伤更加敏感,因而,DDP的抗癌活性主要是因为DNA加合物的形成[15]。此外,由于细胞中线粒体本身具有裸露的环状DNA,容易突变和受到攻击,DDP可直接损伤线粒体DNA,造成线粒体损伤；DDP含有的亲核氨基也能够与水分子作用产生大量的自由基,进一步造成线粒体的氧化损伤,线粒体损伤和氧化应激反应相互作用,最终导致细胞死亡[16]。有研究显示[17]：DDP生物利用度较低,约为10%～35%,按成人常用剂量10～20 mg/d,溶于200 mL生理盐水中计算,到达细胞时质量浓度为1.05～3.50 mg/L（生物利用度取35%）。本实验用DDP建立了A549损伤细胞模型,结果显示质量浓度为1 mg/L的DDP会明显抑制A549细胞的生长,且呈剂量依赖性,当DDP质量浓度为6 mg/L时,会导致细胞内抗氧化系统紊乱,诱导A549细胞凋亡。然而,DDP在表现高效抗癌活性的同时,又对正常组织产生严重的毒副作用（如肾毒性、血液毒性和耳毒性等）[18],从而限制了DDP对肿瘤患者的长期治疗。故寻找高效低毒的肿瘤化疗增敏剂以增强DDP的化疗效果,改善患者的生活质量成为重要课题。
近年来,天然药物在肿瘤治疗过程中发挥着重要作用,目前发现许多天然药物提取活性成分如黄芪多糖、灵芝多糖及苦参碱等都具有较好的抗肿瘤作用[19-21]。LBP是从枸杞果实中提取的活性多糖,研究显示LBP具有较好的抗肿瘤活性[22]。LBP作为一种具有多种抗肿瘤活性的中药,可以协同化疗药物更好地发挥抗肿瘤作用[23]。本实验结果表明一定质量浓度LBP（8 mg/L）单独用药对A549细胞生长和增殖有极显著抑制作用,且呈剂量依赖性,其生物利用度可达36.01%,按成人健康推荐摄入量1 600 mg/d、治疗推荐摄入量2 400 mg/d,到达细胞浓度约为12～18 mg/L。LBP联合DDP能极显著降低A549细胞的存活率,表明LBP能增强DDP对A549细胞生长的抑制作用。
ROS是细胞在代谢过程中产生的含氧活性化合物的总称,其可以参与调节细胞内多种分子和信号转导通路的活性。肿瘤细胞的ROS产生较正常细胞明显增多,主要是受肿瘤基因、线粒体功能变异等因素的影响,使细胞处于一种更高的氧化应激状态。Finkel等[24]研究结果表明,少量的ROS可以作为信号分子介导信号转导途径,参与炎症反应和免疫反应,对细胞起保护作用；但是一旦过量就会引起脂质过氧化,形成过氧化产物MDA,导致细胞的DNA损伤或凋亡。本实验结果表明DDP单独用药会降低A549细胞内GSH含量和SOD活力,且细胞内MDA含量和ROS含量均极显著增加（P＜0.01）。提示DDP引起A549细胞的氧化应激,进而诱导细胞凋亡。郑锐年等[25]研究表明ROS通过上调ROS-AKT1-JNK信号诱导人肝癌细胞株HEPG2细胞凋亡。正常生理条件下,细胞内的ROS由胞内抗氧化系统调节保持平衡状态[4],而DDP进入细胞后,通过损伤线粒体呼吸作用电子传递链,促进细胞的氧化应激反应,导致细胞内ROS的积累[26]。在机体内,抗氧化系统（SOD、GSH等）能清除多余的ROS维持氧化还原反应的平衡。SOD是一种高效氧自由基清除剂,几乎存在于所有生物细胞中,SOD通过与过氧化物酶和氧化物酶作用催化超氧阴离子自由基（O2-·）转化为无害的H2O,从而达到保护细胞的目的。GSH作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂,具有强大的解毒作用。因此,两者可作为细胞抗氧化能力的重要指标。本实验数据表明,LBP联合DDP与DDP单独作用相比,ROS含量极显著降低（P＜0.01）,而GSH、MDA含量和SOD活力均无显著变化（P＞0.05）。提示DDP能够抑制细胞内抗氧化酶的活力,导致细胞内氧化还原水平紊乱,促使脂质过氧化反应增强,从而引起细胞凋亡。另一方面,LBP联合DDP对DDP所致的细胞抗氧化系统紊乱无明显影响,却能有效地清除A549细胞产生的ROS。另外,曲仙智等[27]通过研究细胞糖代谢过程中相关抗氧化能力与DDP耐药之间的关系,发现升高细胞内ROS水平可以增加胆管细胞癌QBC939和肝细胞癌HepG2对DDP的敏感性。且He Guodong等[28]研究发现ROS抑制剂能够降低DDP的抗癌活性。本研究中凋亡结果显示,A549细胞在DDP单独处理后凋亡率从3.57%升高到了28.36%,两者联用后细胞凋亡率升高至45.55%,提示LBP能明显增强DDP对A549细胞的促凋亡作用,但此过程中氧化应激反应并不是LBP促进DDP诱导癌细胞凋亡的主要机制。
细胞凋亡是一种程序性细胞死亡,通常伴有线粒体膜破裂,细胞色素c从线粒体释放到细胞质[29-30]。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白,通过改变线粒体膜的通透性,与Caspase家族蛋白在反馈回路系统中发挥调节细胞凋亡的功能[31-32]。Bax蛋白具有促凋亡作用,是细胞凋亡通路的重要组成部分。已有文献表明,Bcl-2表达的减少和Bax表达的增加均会增加线粒体膜通透性,从而促进细胞色素c等凋亡激活因子的释放,进而增强Caspase-3的活化诱导细胞凋亡[33]。Koraneekit等[34]研究表明咖啡酸和DDP的联合作用可上调Caspase-3和Bcl-2,进而促进人宫颈癌细胞凋亡。Liu Lei等[35]采用单细胞分析研究了DDP诱导人肺腺癌细胞凋亡过程中Bax的动力学分布,本实验结果也表明LBP和DDP单独用药组导致A549细胞内Bcl-2表达量减少,Bax和活性Caspase-3表达量增加,提示LBP和DDP可通过促线粒体释放因子途径诱导A549细胞凋亡。另外,Bax/Bcl-2的比值对于反映药物诱导的癌细胞凋亡至关重要,其意义优于Bcl-2的表达水平,LBP与DDP联合处理A549细胞后,活性Caspase-3表达极显著增加,且Bax/Bcl-2增大,线粒体的渗透性过渡孔隙打开,导致细胞色素c、Caspase-9等促凋亡蛋白流出,促进了细胞凋亡。提示LBP联合DDP促进A549细胞凋亡与其可以共同上调Bax、下调Bcl-2表达并同时激活Caspase-3的表达有关。
PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一,参与很多重要的生物学过程的调控,其通过影响下游多种效应分子的活化状态,在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用,与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关[36-37],该信号通路被认为是癌细胞存活的首要通路。本研究证实LBP联合DDP促进A549细胞凋亡与其可以共同上调Bax、下调Bcl-2表达并同时激活Caspase-3的表达有关,但其对PI3K/AKt信号通路、蛋白激酶B信号作用通道AKt等的影响有待于进一步研究。
综上所述,LBP对DDP抑制人肺腺癌细胞A549生长有联合促进作用,且LBP能够增强DDP诱导的A549细胞凋亡,这是由于LBP与DDP联合作用可以调节A549细胞内促凋亡相关蛋白的表达,而LBP的抗氧化能力对DDP的促细胞凋亡作用并没有显著影响。
[1]张用, 毕建平, 皮国良, 等.国际肺癌研究协会第八版国际肺癌TNM分期订稿解读[J].肿瘤防治研究, 2016, 43(4): 313-318.DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2016.04.016.
[2]胡毅, 陶海涛.晚期非小细胞肺癌的药物治疗进展[J].中国药物应用与监测, 2014, 11(6): 329-333.
[3]宋勇, 杨雯.2014年晚期非小细胞肺癌内科治疗进展[J].解放军医学杂志, 2015, 40(1): 10-15.DOI:10.11855/j.issn.0577-7402.2015.01.03.
[4]徐陆亭, 赵瑞景, 董增军, 等.非小细胞肺癌中ROS1基因重排及其临床意义[J].中国肺癌杂志, 2013, 16(12): 663-670.DOI:10.3779/j.issn.1009-3419.2013.12.09.
[5]SAIKA K, SOBUE T.Cancer statistics in the world[J].Gan to Kagaku Ryoho.Cancer & Chemotherapy, 2013, 40(13): 2475-2480.
[6]高传柱, 费凡, 王天帅, 等.经典顺铂类抗肿瘤药物耐药性研究综述[J].昆明理工大学学报(自然科学版), 2013, 38(6): 78-83.DOI:10.3969/j.issn.1007-855x.2013.06.013.
[7]代二庆, 张明华, 赵占考, 等.中药调控肿瘤细胞凋亡机制研究进展[J].武警医学院学报, 2008(11): 1009-1012; 1016.
[8]郭培培.枸杞多糖的抗肿瘤作用及其机理研究现状[J].北京联合大学学报(自然科学版), 2011, 25(4): 26-29; 40.DOI:10.16255/j.cnki.ldxbz.2011.04.015.
[9]崔晓燕, 罗琼, 王丽红.枸杞多糖对人宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用[J].环境肿瘤防治, 2007, 6(1): 53-59.
[10]向春燕, 罗琼, 李菁菁, 等.枸杞多糖对体外人前列腺癌DU-145细胞增殖和凋亡的影响[J].营养学报, 2013, 35(5): 489-491; 495.DOI:10.13325/j.cnki.acta.nutr.sin.2013.05.019.
[11]谭宇蕙, 王慧峰, 吴映雅, 等.枸杞多糖联合自杀基因tk/GCV系统对小鼠肝癌移植瘤的影响[J].中国现代医学杂志, 2006(6): 869-872.DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2006.06.019.
[12]崔晓燕, 罗琼, 杨明亮, 等.枸杞多糖对人宫颈癌细胞生长及细胞凋亡影响[J].中国公共卫生, 2006(12): 1411-1412.DOI:10.11847/zgggws2006-22-12-02.
[13]王海, 周游, 黄姗婉, 等.枸杞多糖对顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞TM4氧化损伤的影响[J].食品科学, 2017(17): 205-209.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717032.
[14]王海, 周游, 黄姗婉, 等.枸杞多糖对顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞TM4氧化损伤的影响[J].食品科学, 2017, 38(17): 205-209.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717032.
[15]HANIGAN M H, DEVARAIAN P.Cisplatin nephrotoxicity:molecular mechanisms[J].Cancer Therapy, 2003, 1: 47-61.
[16]TOHAMY A A, EL-GHOR A A, EL-NAHAS S M, et al.Betaglucan inhibits the genotoxicity of cyclophosphamide, adriamycin andcisplatin[J].Mutation Research, 2003, 541(1/2): 45-53.DOI:10.1016/S1383-5718(03)00184-0.
[17]赵磊超, 王萌, 郑令娜, 等.尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术研究牛血清白蛋白与顺铂的反应动力学[J].分析化学, 2012,40(8): 1289-1292.DOI:10.3724/SP.J.1096.2012.11344.
[18]刘磊, 卞卡.顺铂耐药的分子机制及中药干预的研究进展[J].中国中药杂志, 2014, 39(17): 3216-3220.DOI:10.4268/cjcmm20141702.
[19]翟秋丽, 胡向丹, 肖静, 等.黄芪多糖协同顺铂诱导宫颈癌siha细胞凋亡的作用机制[J].广东医学, 2018, 39(9): 1327-1331.DOI:10.13820/j.cnki.gdyx.20180523.023.
[20]郭鹏荣, 盛玉文, 刘奔, 等.灵芝多糖对顺铂抑制荷膀胱癌T24细胞裸鼠肿瘤生长及血管生成作用的影响[J].解放军医学杂志, 2014,39(6): 470-474.DOI:10.11855/j.issn.0577-7402.2014.06.09.
[21]郭启帅, 黄曦, 李少林.苦参碱诱导卵巢癌SKOV_3细胞凋亡的机制研究[J].中国药理学通报, 2010, 26(8): 1104-1107.
[22]陈忱, 唐华丽, 马月, 等.大鼠血浆中枸杞多糖荧光标记物定量分析方法的建立[J].食品科学, 2015, 36(2): 90-95.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201502017.
[23]黄文书, 杨海燕, 武运, 等.枸杞多糖的提取及其体外抗肿瘤作用研究[J].中国食物与营养, 2008(5): 38-40.DOI:10.3969/j.issn.1006-9577.2008.05.012.
[24]FINKEL T.Signal transduction by reactive oxygen species[J].Journal of Cell Biology, 2011, 194(1): 7-15.DOI:10.1083/jcb.201102095.
[25]郑锐年.姜黄素经由活化ROS-ASK1-JNK通路增效ABT-737诱导肝癌细胞凋亡作用机制研究[D].广州: 南方医科大学, 2016: 56-73.
[26]ZHAN Maocheng, LIU Xuyi, CAI Peng, et al.Resistant mechanisms of cisplatin in human lung adenocarcinoma cell line A 549 DDP[J].Chinese Journal of Cancer Research, 1997, 9(3): 178-182.DOI:10.1007/BF02953875.
[27]曲仙智.自噬抑制剂氯喹通过线粒体ROS增加顺铂诱导QBC939细胞死亡的敏感性[D].长春: 吉林大学, 2017: 26-68.
[28]HE Guodong, HE Guoliang, ZHOU Riyong, et al.Enhancement of cisplatin-induced coloncancer cells apoptosis by shikonin, a natural inducer of ROS in vitro and in vivo[J].Biochemical Biophysical Research Communications, 2016, 469(4): 1075-1082.DOI:10.1016/j.bbrc.2015.12.100.
[29]ZENG Rong, ZHOU Zhiwu, WU Cuifang, et al.Reversal effect of aloe emodin liposomes on cisplatin resistance line A549/DDP human lung adenocarcinoma cells[J].Chinese Journal of traditional Chinese Medicine, 2008, 33(12): 1443-1445.
[30]纪元, 龙建纲, 刘健康.自噬发生中的ROS调节机制[J].中国生物化学与分子生物学报, 2014, 30(4): 321-327.
[31]岑娟, 刘芳芳, 张峰.通过调控反应氧族防治耐药肿瘤的研究进展[J].中国癌症防治杂志, 2017, 9(3): 229-232.DOI:10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.16.
[32]LLAMBI F, GREEN D R.Apoptosis and oncogenesis: give and take in the BCL-2 family[J].Current Opinion in Genetics & Development,2011, 21(1): 12-20.DOI:10.1016/j.gde.2010.12.001.
[33]NEHRA R, RIGGINS R B, SHAJAHAN A N, et al.BCL2 and CASP8 regulation by NF-kappaB differentially affect mitochondrial function and cell fate in antiestrogen-sensitive and -resistant breast cancer cells[J].FASEB Journal, 2010, 24: 2040-2055.DOI:10.1096/fj.09-138305.
[34]KUMAR K, SABARWAL A, SINGH R P.Mancozeb selectively induces mitochondrial-mediated apoptosis in human gastric carcinoma cells through ROS generation[J].Mitochondrion, 2019, 48: 1-10.DOI:10.1016/j.mito.2018.06.003.
[35]LIU Lei, XING Da, CHEN Wei R, et al.Spatial and temporal changes in bid and bax subcellular localization durin cisplatin-induced apoptosis[C]// 2006 International Symposium on Biophotonics,Nanophotonics and Metamaterials.Hangzhou: IEEE, 2015.DOI:10.1109/METAMAT.2006.335027.
[36]MASSION P P, TAFLAN P M, SHYR Y, et al.Early involvement of the phosphatidylinositol3-kinase/Akt pathway in lung cancer progression[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2004, 170(10): 1088-1094.
[37]蒋立峰, 桑锋, 蒋士卿.基于PTEN-PI3K-AKT信号通路探讨非小细胞肺癌Treg细胞上调的分子机制[J].中医学报, 2017, 32(7): 1129-1133.DOI:10.16368/j.issn.1674-8999.2017.07.296.