香蕉（Musa acuminate）含有人体需要的多种微量元素和丰富的营养物质,而且口感良好,因此很受消费者的青睐,目前香蕉种植产业已经迅速发展到了世界各地[1]。香蕉是典型的呼吸跃变型水果,为便于运输和贮藏,一般在种植地对六七成熟青果就进行采收,然后运到销售地；此时在销售地的香蕉质地坚硬,需要经过一段时间的贮藏与后熟作用才能销售和食用。因此为了使香蕉后熟程度一致,在短时间内供应黄熟可食香蕉上市,就必须进行后期人工催熟[2]。国内现有的催熟方法主要有乙烯催熟、乙烯利催熟、熏香催熟、混果催熟等方法[3],目前使用最多的催熟方法是乙烯利催熟。
乙烯利为人工合成的有机磷植物生长调节剂,使用时释放有机成分是乙烯。它能诱导植物的多个组织释放出乙烯,以调节植物生长、发育和代谢,起到加速成熟、衰老、脱落以及促进开花的生理效应[4]。乙烯利催熟果蔬的应用已经非常常见[5-7],有研究报道,乙烯利催熟猕猴桃时,不仅能加快果实的成熟,而且对果实的色泽和抗坏血酸含量等均无显著影响[8]。规范使用乙烯的方法有乙烯气体催熟、乙烯利液体催熟和乙烯利包装材料催熟。但乙烯气体催熟成本较高,乙烯利液体催熟则存在化学残留量高、催熟均匀度差等问题；而乙烯利包装材料通过缓慢释放乙烯催熟水果,乙烯利残留量较少[9],因此现在市场上对乙烯利材料的需求更加迫切。
目前,有许多针对乙烯利释放作用的研究,这些研究可以使乙烯利合理释放乙烯而不直接喷洒或浸泡农作物或果蔬,虽然能够做到有效降低果蔬的乙烯利残留量,但同时也存在着诸多缺陷,比如能够释放乙烯的药包存在释放不规律的缺点,释放乙烯气体的凝胶剂则存在安全隐患及分装、加工困难等缺陷[10]。如何提升乙烯利缓释材料的性能是目前亟需解决的问题。低密度聚乙烯薄膜具有良好的防潮性、低熔点、热密封、化学惰性和易分装加工等特性,而且比大多数热塑性聚合物薄膜便宜,在食品包装应用中得到广泛应用[11-12],本实验通过将乙烯利与低密度聚乙烯结合,期望研制出能够有效释放乙烯及易分装加工的乙烯复合薄膜,从而改善香蕉催熟过程中存在的化学残留、乙烯释放不规律及包装分装加工困难等问题。本实验采用乙烯利薄膜包装对青香蕉进行催熟处理,研究催熟期间香蕉的后熟过程及理化性质,以期实现果蔬的有效催熟,并有望用于家庭果蔬的催熟。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
‘威廉斯B6’香蕉果实饱满但仍现棱角,为八成熟,购于南京市江宁区众彩水果批发城。将香蕉运回实验室去轴落梳,再分切成单个蕉指,挑选大小均匀、无病虫害和机械伤的个体饱满的香蕉进行包装处理。
乙烯利粉剂（有效成分的质量分数为20%）、葡萄糖标准液（1 mg/mL）、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid,DNS）、磷酸盐缓冲液、2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid,TBA）、考马斯亮蓝溶液、福林-酚试剂、碳酸钠溶液、低密度聚乙烯、线性低密度聚乙烯、无水硅胶、硅烷偶联剂、芥酸酰胺（润滑剂）、N,N'-乙撑双硬脂酰胺（分散剂） 国药集团化学试剂有限公司；过氧化物酶（peroxidase,POD）测定试剂盒、多酚氧化酶（polyphenoloxidase,PPO）测定试剂盒 南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
KTE 20/500双螺杆挤压机 南京科尔克挤出装备有限公司；JFYC-28吹膜机 广州市金方圆机械制造有限公司；人工气候箱 宁波江南仪器设备有限公司；OXYBABY M+O2/CO2便携式气体分析仪 上海众林机电设备有限公司；TA-XT plus型食品物性测定仪 英国Stable Micro Systems公司；CM-5色差仪 日本柯尼卡美能达公司；Spectra Max 190全波长酶标仪 南京百奥生物科技有限公司；2014气相色谱仪 日本岛津公司；Allegra 64R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；AJ-320智能真空保鲜机 广东省东莞市益健包装机械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 乙烯利复合包装材料的制备
预实验中,含有质量分数0.5%、1.0%、1.5%、2.0%乙烯利粉剂的包装材料对香蕉的催熟速率随着乙烯利质量分数的增加而加快,而2.0%乙烯利包装材料拉伸强度小、易破裂,因此本实验选择含1.5%乙烯利的包装材料。将0.1%（乙烯母粒中的质量分数,下同）无水硅胶、1.5%乙烯利粉剂、2%硅烷偶联剂、1%润滑剂（芥酸酰胺）、9%分散剂（N,N'-乙撑双硬脂酰胺）、43.2%低密度聚乙烯与43.2%线性低密度聚乙烯制备成乙烯利母粒,用造粒机混合造粒过程中,母粒不经过水槽降温,然后将制成的乙烯利母粒用吹模机吹塑成乙烯利复合包装材料。包装袋的规格为30 cm×10 cm,厚度为100 μm。
1.3.2 原料处理
分别将大小均一、无损伤的香蕉包装进普通聚乙烯包装袋（对照）和乙烯利复合包装袋,两种包装袋的规格及厚度相同,以1 根/袋各包装15 袋,放入人工气候箱（温度为25 ℃、相对湿度为70%）贮藏8 d,每天测定包装袋的乙烯含量,其他指标每隔2 d取样测定。
1.3.3 指标测定
1.3.3.1 乙烯含量的测定
参照张忠等[5]的方法,将质量为17.2 g的乙烯利复合包装袋放入带橡胶塞的2 L密闭干燥器中,然后每天从中抽取1 mL气体,采用气相色谱仪测定乙烯利复合包装袋释放的乙烯含量。同时从包装香蕉的普通包装袋和乙烯利复合包装袋中抽取1 mL气体,测定乙烯含量。
1.3.3.2 质量损失率、呼吸强度的测定
质量损失率按公式（1）进行计算。
使用便携式气体分析仪测定密闭干燥器内CO2的体积分数（φ1/%）,然后将香蕉置于同等容量的带活塞的干燥器内置于室温下1 h,然后使用便携式分析仪记录干燥器内CO2的体积分数（φ2/%）,将样品称量后记下质量（ms/g）,呼吸强度按公式（2）计算[13]。
式中：V表示密闭干燥器总体积/mL；M表示CO2的摩尔质量（44 g/mol）；V0表示摩尔体积（22.4 L/mol）；t表示测定时间（1 h）。
1.3.3.3 硬度的测定
用物性测定仪测定香蕉果肉硬度,去皮后将果实从中部横切,每个切面测定4 个点,4 个点的平均值为该果实的硬度,硬度测定条件：探头6 mm,力量感应元1 000 N,回升高度45 mm,形变量40%,起始力0.3 N,两次压缩间隔时间2 s,测前速率1 mm/s,测试速率0.9 mm/s,测后速率2 mm/s[14]。
1.3.3.4 果皮色泽测定
每指香蕉分别选取3 个不同的点用色差仪进行测定a*值,结果取平均值。a*值表示有色物质的红绿偏向,正值越大,偏向红色的程度越大,负值越小,偏向绿色的程度越大。
1.3.3.5 还原糖含量的测定
香蕉果肉中的还原糖含量采用DNS比色法[15]测定,并稍加修改。取12.0 g香蕉果肉加120.0 g蒸馏水,用搅拌机搅碎均匀,装入250 mL锥形瓶中,于80 ℃水浴40 min,取出后用玻璃棒搅匀,取适量匀浆液于4 mL离心管中8 000 r/min离心10 min,取上清液0.2 mL加入至4 mL离心管中,再加入0.4 mL蒸馏水和0.6 mL DNS,80 ℃水浴5 min后冷却,用酶标仪测定540 nm波长处的吸光度。葡萄糖标准曲线为：y＝0.825 7x+0.030 4,y为吸光度,x为葡萄糖质量浓度/（mg/mL）。还原糖含量以每克香蕉果肉中所含葡萄糖质量计。
1.3.3.6 丙二醛含量的测定
香蕉果肉的丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量采用TBA法[16]测定,并稍加修改。取3.0 g香蕉果肉于50 mL离心管中,加入9 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.8）,8 000 r/min离心10 min,取上清液2 mL和质量浓度为0.6 g/100 mL TBA溶液（取0.6 g TBA,先用少量40 g/L NaOH溶液溶解,再用质量分数10%三氯乙酸溶液定容至100 mL）2 mL于10 mL离心管中,90 ℃水浴20 min后冷却。用酶标仪分别测450、532、600 nm波长处的吸光度。MDA含量按公式（3）计算。
1.3.3.7 果皮可溶性蛋白含量的测定
可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝染色法[17],并稍加修改,准确称取1.0 g果皮,加入5.0 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.8）研磨,4 000 r/min离心20 min后,取上清液0.2 mL,加入5 mL考马斯亮蓝溶液,混匀后静置5 min,在595 nm波长处测定吸光度,用蒸馏水作空白对照。
1.3.3.8 总酚含量的测定
总酚提取和含量测定均参考文献[18]。称取0.2 g样品于10 mL离心管中,加入在70 ℃中预热过的体积分数70%乙醇溶液5 mL,用玻璃棒充分搅拌均匀,立即进行70 ℃水浴,浸提30 min（隔10 min搅拌1 次）,浸提后冷却至室温,3 500 r/min离心10 min,将上清液转移至10 mL容量瓶。残渣用5 mL、体积分数70%乙醇溶液再浸提1 次,重复以上操作。合并提取液,定容至10 mL,摇匀,待用（4 ℃下保存,在24 h内测定）。
用移液器分别移取0.11 mg/mL没食子酸工作液、蒸馏水（空白对照）及测试液各1.0 mL于10 mL刻度试管内,每个试管分别加入5.0 mL的体积分数10%福林-酚试剂,摇匀,反应6 min。然后加入4.0 mL 7.5 g/100 mL Na2CO3溶液,摇匀,室温下反应1 h。用酶标仪测定溶液在765 nm波长处的吸光度。
1.3.3.9 PPO、POD活力的测定
PPO、POD活力分别采用其试剂盒测定。
1.4 数据统计与分析
使用SPSS Statistics 20.0统计软件进行实验数据分析,结果采用单因素方差分析中的Dunnett's检验进行显著性差异分析（P＜0.05）,使用OriginPro 8.5软件作图。
2 结果与分析
2.1 不同包装袋使用过程中乙烯含量的变化
如表1所示,在贮藏的8 d内,乙烯利复合包装袋中的乙烯含量整体平稳,同时,乙烯利复合包装袋在催熟香蕉的过程中包装袋内乙烯的含量略有上升,这可能与香蕉后熟过程中香蕉释放乙烯有关。对照组香蕉贮藏期间,包装袋内乙烯含量极低,可能是因为香蕉的后熟进程慢,乙烯释放量少；由此表明,乙烯利复合包装袋能够通过释放乙烯加快香蕉的后熟进程,从而达到催熟的目的。
表1 不同包装袋使用过程中乙烯的含量变化
Table 1 Release pattern of ethephon incorporated in packaging material when used or not used to package banana
注：—.未检测出（含量低于气相色谱的最低检出限）。
组别乙烯含量/（µL/L）0 d 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d乙烯利复合包装 0.574±0.000 0.574 ±0.000 0.575±0.000 0.576±0.000 0.577±0.002 0.576±0.000 0.578±0.002 0.579±0.000 0.580±0.001乙烯利复合包装+香蕉 2.872±0.000 2.872±0.002 2.872±0.003 2.892±0.001 2.905±0.010 2.960±0.004 2.987±0.003 3.037±0.003 3.040±0.006普通包装+香蕉 — — — — — — — — —
2.2 乙烯利复合包装材料对香蕉质量损失率、呼吸强度的影响
图1 不同包装处理对香蕉质量损失率（A）和呼吸强度（B）的影响
Fig.1 Effects of different packaging treatments on mass loss rate (A)and respiration intensity (B) of banana
香蕉在采摘后会因为蒸腾作用而损失大量的水分,大大降低了香蕉的商品价值。从图1A可以看出,两种包装处理的香蕉果实的质量损失率随着贮藏时间的延长均呈现上升趋势,并且在贮藏期间,乙烯利复合包装材料包装的香蕉比对照组的香蕉水分流失速率快,香蕉果实质量损失率高,在贮藏末期,乙烯利复合包装组香蕉质量损失率为2.3%,对照组质量损失率为2.0%,但两组差异不显著（P＞0.05）,可能是因为乙烯利复合包装组香蕉果实后熟过程加快,果实内营养物质消耗变快,但果实有氧呼吸不断生成水分。
香蕉属典型的呼吸跃变型水果,呼吸作用是香蕉采后最主要的生理活动,是生命存在的重要标志。如图1B所示,乙烯利复合包装处理的香蕉在第6天呼吸强度达到最大,对照组的呼吸强度较乙烯利复合包装组升高幅度较小,在贮藏期4～8 d,对照组的呼吸强度始终显著低于乙烯利复合包装组（P＜0.05）,且对照组的呼吸强度还没有达到峰值。由此可见,乙烯利复合包装袋能够释放乙烯,加快香蕉的呼吸作用,促进香蕉的后熟。
2.3 乙烯利复合包装材料对香蕉硬度的影响
图2 不同包装处理对香蕉硬度的影响
Fig.2 Effects of different packaging treatments on hardness of banana
香蕉果实的硬度大小显示了其软化程度。香蕉在催熟过程中,果实的硬度会在短时间内很快下降。如图2所示,贮藏初期,香蕉的硬度为7.382 kg/cm2,随着贮藏时间的延长,两组香蕉硬度逐渐降低。在整个贮藏期间,乙烯利复合包装组香蕉的硬度下降速率远大于对照组,且贮藏末期时乙烯利复合包装组的香蕉硬度降低至0.625 kg/cm2,显著低于对照组香蕉在贮藏末期的硬度（4.351 kg/cm2）（P＜0.05）。由此可见,乙烯利复合包装袋能加快香蕉的软化进程,促进香蕉的后熟。
2.4 乙烯利复合包装材料对香蕉果皮a*值、可溶性蛋白含量的影响
图3 不同包装处理对香蕉果皮a*值（A）和可溶性蛋白含量（B）的影响
Fig.3 Effects of different packaging treatments on a* value (A) and soluble protein content (B) of banana
果皮色泽是香蕉感官品质的重要指标之一。如图3A所示,香蕉成熟过程中果皮色泽a*值逐渐增加,说明逐渐褪绿,乙烯利复合包装处理的香蕉从第4～6天褪绿速率加快,对照组香蕉褪绿速率较缓慢,在贮藏期间,其果皮a*值显著低于乙烯利复合包装处理的香蕉（P＜0.05）,在贮藏末期时,乙烯利复合包装中的香蕉果皮的a*值为-0.56,而普通包装的香蕉果皮a*值为-5.63,由此可以表明乙烯利复合包装可以有效加快香蕉的褪绿过程,对香蕉催熟起到积极作用。
植物细胞的保水能力与可溶性蛋白含量密切相关,可溶性蛋白含量越高,植物细胞的保水性越强,对细胞膜的保护性也越强,植物的抗性也越高[19]。如图3B所示,乙烯利复合包装处理的香蕉果皮可溶性蛋白含量在贮藏前2 d变化缓慢,2～4 d急剧增加,在第4天达到最大值3.29 mg/g,然后从第6天开始下降；对照组香蕉果皮可溶性蛋白质含量总体呈现上升趋势,并在贮藏前6 d显著低于相同贮藏时间的乙烯利复合包装处理组（P＜0.05）。以上结果表明,与普通包装袋相比,乙烯利复合包装处理能加速香蕉果皮蛋白质含量合成峰的到达。
2.5 乙烯利复合包装材料对香蕉还原糖、总酚含量的影响
图4 不同包装处理对香蕉还原糖（A）、总酚（B）含量的影响
Fig.4 Effects of different packaging treatments on contents of reducing sugar (A) and total phenols (B) in banana
香蕉后熟过程中,淀粉被分解成还原糖,还原糖含量越高,说明机体的代谢越旺盛。从图4A可以看出,乙烯利复合包装处理的香蕉还原糖含量呈现先上升后下降的趋势,并在第6天达到最大值（304.62 mg/g）；对照组香蕉还原糖含量呈现逐渐上升趋势,在第6天达到53.61 mg/g,在贮藏期间,对照组果实还原糖含量显著低于乙烯利复合包装处理组（P＜0.05）,表明乙烯利复合包装可以促进还原糖的生成,加快香蕉的后熟进程。
从图4B可以看出,两种包装袋香蕉果肉总酚含量在贮藏的前2 d同步下降,乙烯利复合包装处理的香蕉果肉总酚含量在贮藏的2～6 d基本保持稳定,在6～8 d急剧上升,并在第8天达到0.61 mg/g；对照组果肉总酚含量在前6 d持续下降,从第6天开始上升,并在第8天达到0.39 mg/g。在贮藏的4～8 d,乙烯利复合包装处理组的果肉总酚含量显著高于对照组（P＜0.05）。高鹏钊等[20]的研究结果表明,香蕉总酚含量随着成熟度的增加而增加,并且外源乙烯会促进多酚物质的积累,这与本实验中乙烯利复合包装袋中的香蕉果肉总酚含量远高于对照组的结果一致,说明乙烯利复合包装能有效释放乙烯催熟香蕉。
2.6 乙烯利复合包装材料对香蕉PPO、POD活力的影响
图5 不同包装材料对后熟过程中香蕉PPO（A）、POD（B）活力的影响
Fig.5 Effects of different packaging treatments on PPO (A) and POD (B) activity of banana during postharvest ripening
PPO是一种金属蛋白酶,可以催化多酚氧化生成黑色素沉淀,高等植物组织发生褐变主要是PPO作用的结果[16],PPO存在于大多数果蔬中。从图5A可以看出,乙烯利复合包装处理的香蕉PPO活力在贮藏的前4 d逐渐上升,并在第4天达到最大值42.72 U/g,4 d后开始下降；对照组香蕉PPO活力也是在贮藏的前4 d逐渐上升,并且PPO活力与乙烯利复合包装组差异不显著,4～6 d下降,6 d后急剧上升,并在第8天达到最大值86.89 U/g。对照组中香蕉PPO活力在贮藏末期显著高于此时乙烯利复合包装组（P＜0.05）,这可能是因为对照组香蕉果实在贮藏后期酶促褐变较严重,导致PPO活力显著上升。
在果蔬的生长发育、成熟与衰老过程、抗逆境胁迫、抗氧化过程中,POD活力不断发生变化,POD是植物体内清除过氧化氢等活性氧的主要氧化还原酶[21]。从图5B可以看出,两种包装袋处理的香蕉果实POD活力变化趋势基本相同,都是先上升再下降最后上升的趋势,其中,对照组香蕉POD活力在第8天为15.64 U/mg,显著高于乙烯利复合包装组的8.95 U/mg（P＜0.05）。
2.7 乙烯利复合包装材料对香蕉MDA含量的影响
图6 不同包装处理对香蕉MDA含量的影响
Fig.6 Effects of different packaging treatments on MDA content of banana
果蔬衰老时,细胞自由基代谢失调,组织或器官的膜脂质发生过氧化反应,MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一,MDA的积累程度与细胞膜受损害程度密不可分,MDA的过量积累会导致细胞膜受损进而导致电解质外渗,MDA含量增加同时也是植物对逆境胁迫时的表达[19]。从图6可以看出,乙烯利复合包装处理的香蕉MDA含量在贮藏的前2 d变化不明显,2 d后急剧增加,并在贮藏第8天达到0.43 mmol/g；对照组香蕉MDA含量在前6 d变化不大,6 d后快速增加,并在第8天达到0.14 mmol/g。乙烯利复合包装处理的香蕉MDA含量始终显著高于对照组香蕉（P＜0.05）,表明乙烯利复合包装袋可以促进香蕉的后熟。
3 讨 论
乙烯利是一种常用的催熟剂,在一定的温湿度条件下可生成乙烯气体,乙烯是果实成熟软化进程中参与调控果实成熟相关基因的转录和翻译的重要启动因子[22],其在果实成熟过程中通过提高酶的活性,促进一系列生物代谢,加速果实内部的生理变化[23]。香蕉后熟进程的调控直接影响其感官和营养品质,进而影响货架期和经济效益。果皮褪绿转黄和果肉软化是香蕉果实后熟过程中发生的最显著的变化[24]。果实的软化与细胞壁代谢酶相关,而乙烯在细胞壁降解相关酶基因的表达过程中起着重要作用[25]。本研究结果表明,与对照组相比,乙烯利复合包装可以通过有效释放乙烯,使香蕉在贮藏第6天达到呼吸高峰,促进香蕉的呼吸跃变过程,促进香蕉的后熟过程；同时,乙烯利复合包装材料可以提高香蕉还原糖和果皮可溶性蛋白含量,可溶性蛋白含量和细胞膜透性被作为植物抗逆性的重要指标,一般可以通过提高植物体内可溶性蛋白含量来提高植物抗逆性；此外,乙烯利对香蕉的质量损失率没有显著影响,说明乙烯利复合包装材料可以较好地促进香蕉的后熟。
色泽变化可以作为香蕉是否成熟的初步判断之一,本研究结果表明,乙烯利复合包装处理可以有效地加快香蕉果皮的褪绿过程,香蕉的褪绿转黄受多方面影响,例如当温度高于24 ℃时,香蕉不能正常转黄,影响香蕉的外观品质26],如果贮藏温度超过35 ℃,香蕉果皮会变黑,果肉逐渐糖化,从而失去商品的食用价值。同时,当包装内CO2浓度过高或过低时,也不利于果实的转黄过程,这可能是因为包装内的气体成分没有达到平衡状态,没有满足果实的正常后熟气体成分要求[27]。
褐变分为酶促褐变与非酶促褐变,果实中的褐变反应大部分为酶促褐变。苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷类物质代谢中第一个关键酶,主要负责合成酚类、木质素和花青素的前体物质,并且其中形成的酚类物质为果蔬酶促褐变反应提供底物[28]。PPO是引起果蔬酶促褐变最关键的酚酶之一[29],同时POD在H2O2存在的情况下,能催化酚类物质和类黄酮氧化聚合形成褐色物质参与果蔬酶促褐变。在贮藏末期时,乙烯利复合包装材料中的香蕉果实PPO和POD活力均显著低于对照组。可能是因为乙烯利复合包装释放的乙烯促进了香蕉的后熟进程,提高了香蕉的呼吸作用强度,使乙烯利复合包装中氧气消耗变快,二氧化碳含量不断增加,导致乙烯利复合包装中处于低O2、高CO2的环境,使酶促褐变所需O2减少,延缓了香蕉的酶促褐变慢,因此乙烯利复合包装中香蕉的POD、PPO活力在贮藏后期低于对照组。
乙烯利复合包装可以少量缓慢释放乙烯,比乙烯利直接浸泡喷洒果蔬等具有能够降低乙烯利残留的安全隐患问题。消费者对香蕉催熟的需求不一样,因此,乙烯利复合包装袋的可控催熟是接下来要研究的方向。
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