包装充氧量对无水活运花鲈鳃组织结构及相关酶活性的影响

花鲈（Lateolabrax maculatus）,属鲈形目、鮨科、花鲈属,栖息于河口咸淡水处,为广盐性鱼类[1]。花鲈可以通过低温诱导休眠的方式进行无水保活（临界冰温4 ℃,无水保活时间8 h）,常温恢复后鱼体可回到正常状态并存活一段时间[2]。

鱼鳃几乎同时担负了相当于哺乳动物肺和肾脏的主要功能,内有密集的血管、高度特化的上皮细胞,可直接进行物质、气体交换,结构极其精妙、复杂。虽然鱼类也有头、肾和皮肤等辅助呼吸器官,但鳃仍是鱼类最主要的呼吸器官。无水活运过程中使用高浓度O2包装花鲈,是为了提高鱼呼吸器官效率,此时鱼表皮黏液和鱼鳃上皮细胞同时接触高浓度O2,而与O2直接接触会加速鳃组织上皮细胞膜中的脂质氧化,形成膜脂过氧化物和丙二醛（malondialdehyde,MDA）,而MDA会引起蛋白分子内和分子间的交联,这进一步破坏了鱼鳃上皮细胞膜的流动性、通透性和完整性,使得鱼鳃上皮细胞膜的主动运输与渗透压调节等功能出现障碍[3-4]。过高浓度的O2包装也会导致鱼体产生出过多的氧自由基,细胞内的自由基不能被及时清除则会攻击生物的蛋白质、脂肪和核酸等细胞成分,为抵御这些攻击,机体的抗氧化防御体系被激活,超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）可以阻断自由基对细胞的损害,保护机体免受损伤[5-6]。在生理状态下细胞内同时存在以SOD介导的氧自由基反应和MDA介导的脂质过氧化反应,这两种反应对机体新陈代谢起着重要作用[7-8]。溶菌酶自身较稳定,但包装中潮湿的木屑易引起鱼体表皮溶菌酶分泌功能不正常,进而导致其浓度改变。对黑鲷[9]、鲫鱼[10]、黄颡鱼[11]的无水保活研究发现,纯氧包装供氧相比空气包装能延长无水保活时间。本实验研究不同充氧量（体积分数分别60%、80%、98%）包装对花鲈血清MDA浓度、SOD活力、表皮黏液溶菌酶活力和鳃组织形态学变化的影响,缩小无水保活运输包装充氧量的范围。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花鲈购自上海当地水产品市场。挑选体质健康、无外伤、鳞片完整、大小基本一致（体长约40 cm）的活花鲈作为实验材料。实验用水：由经颗粒活性炭过滤后曝气的自来水和海盐配制而成,实验开始前1 d配制,连续曝气24 h后用于实验。水温22～23℃、盐度16‰～17‰、溶解氧4～6 mg/L、pH 7.5～8.5。

MDA检测试剂盒、溶菌酶检测试剂盒、SOD检测试剂盒南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

全自动循环冷水机广东海利集团；LX-100VTR模拟运输振动台上海鲁轩仪器设备厂；SH-1000Lab-全波长酶标仪北京宏昌信科技有限公司；5810R高速冷冻离心机上海艾测电子科技有限公司；Axio Scope A1光学显微镜德国卡尔蔡司公司；切片机德国Leica公司；K-600泵吸式气体检测仪河南凯陆电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花鲈鱼的暂养

暂养箱中鱼密度1 尾/50 L,禁食暂养时间12 h；先暂养后冷驯化,设置冷水机以3 ℃/h降温速率将暂养箱中水温从22～23 ℃历时6 h降至冰温4 ℃；此时,鱼体呼吸频率（24±3）次/min,鱼体失去平衡、鱼腹朝上,裂鳃,刺激反应迟钝,进入休眠状态。

1.3.2 花鲈鱼的包装与分组

实验共分为4 组,即对照组（CK组）和O2体积分数60%、80%、98%包装处理组,每组样品15 条,CK组正常养在水池内样品5 条,实验总数为50 条。将暂养箱中的花鲈捞出,放于泡沫箱（36 cm×45 cm×13 cm）内的湿木屑上（4 ℃、盐度16‰～17‰水润湿1 h后沥干）,然后装入塑料袋内（1 箱/袋）,冰袋放进塑料袋内的湿木屑上不与鱼接触,充入O2（泵吸式气体检测仪检测气体体积分数,O2体积分数分别为60%、80%、98%）后扎紧袋口；再放入振动台上的4 ℃保温箱内。在振动台上进行模拟运输实验,运输总时间8 h[12]。模拟运输8 h后,打开包装,取出鱼放入4 ℃水中,使用冷水机及冰袋以5 ℃/h升温速率将水温升至22～23 ℃唤醒。在运输0（降温后未包装运输）、1、2、8 h和唤醒后随机选取5 条鱼进行指标测定。

参考张玉晗等[13]的方法进行花鲈取血操作,采用相关检测试剂盒测定血清中花鲈SOD活力、MDA浓度。

参考王晓雯等[14]的方法制备花鲈体表黏液样品,采用溶菌酶检测试剂盒测定体表黏液中溶菌酶活力。

参考阮成旭[15]、区又君[16]等的方法进行鱼鳃光学显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜制片和观察。为确保本研究图片的代表性,实验过程中每组至少观察4 个切片,所选观察组为鳃表面氧化变化最明显的实验组。

1.4 数据处理与分析

应用SPSS19.0软件对实验数据进行统计分析,采用Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 包装充氧量对无水活运花鲈血清SOD活力、MDA浓度的影响

SOD为内源性抗氧化因子,是率先起作用的抗氧化酶之一,来源于线粒体及过氧化物酶体,广泛存在于细胞浆中,具有消耗自由基的作用,可减少细胞损害,与机体的抗外源胁迫密切相关[17]。在外源环境因子胁迫下,SOD活力通常表现为显著升高,SOD活力高低能间接反映机体清除氧自由基的能力[18]。脂质发生过氧化反应便可产生MDA,鱼鳃上皮细胞膜上存在的大量多不饱和脂肪酸,对氧化应激较敏感,是氧化应激攻击的目标。血清中MDA浓度可反映细胞脂质过氧化的程度,并间接反映自由基的水平。MDA浓度也可与蛋白质的游离氨基作用,引起蛋白质分子内和分子间交联,直接导致细胞损伤[19-20]。鱼体正常情况下上述两种反应处于协调与动态平衡的状态,而鱼体在无水活运过程中,会产生过量的氧自由基,进而引起脂类、蛋白质和核酸等大分子过氧化,鱼体抗氧化应激表现为SOD、MDA水平呈上升趋势。

由图1可知,包装充氧量对花鲈血清中SOD、MDA水平影响较大。CK组SOD活力为（5.38±0.29）U/mL,MDA浓度为（14.93±1.54）nmol/mL,运输0 h（降温未包装运输）,不同O2包装组SOD、MDA水平与CK组相比升高,表明降温过程刺激鱼体产生氧自由基,SOD活力升高以清除自由基,从而减轻运输应激对机体的损伤。潘桂平等[21]研究的低温（9 ℃）胁迫云纹石斑幼鱼7 d,其血清中SOD活力较胁迫前显著上升。由图1A可知,包装运输1 h,花鲈血清SOD活力下降,可能是运输胁迫鱼体产生的大量自由基消耗了SOD；也可能是SOD处于应激适应阶段,其浓度有所降低。结合图1A、B可知,在运输2～8 h,60% O2包装组的MDA浓度最低,SOD活力最高,这可能是由于因为运输因素迫使鱼体SOD活力升高,抗氧化酶清除自由基的能力较强,故而氧化产物浓度低；98% O2包装组MDA浓度下降,SOD活力则较稳定；而80%组MDA浓度较稳定。唤醒后各组花鲈血清SOD活力与运输过程中相比降低并恢复至正常水平。

2.2 包装充氧量对无水活运花鲈体表黏液溶菌酶活力的影响

健康的鱼体表包裹着一层黏液,这种黏液在鱼类生活中直接接触不同的环境应激物,是防御的第一道防线。黏液中含有的溶菌酶具有水解致病菌黏多糖的功能,是鱼类的非特异性免疫物质之一[22-23]。

CK组花鲈体表黏液溶菌酶活力为（9.58±2.84）U/mL。如图2所示,运输0 h,溶菌酶活力降低,说明花鲈黏液溶菌酶活性在经降温处理后受到低温抑制,一方面可能是因为低温导致嗜中性粒细胞和单核细胞分泌的溶菌酶减少；另一方面也可能是由于低温导致血流缓慢,造成了溶菌酶分布范围缩小[24]。运输1 h,花鲈体表黏液溶菌酶活力未见回升,运输1～2 h,60%、80% O2包装组花鲈体表黏液溶菌酶活力升高,运输2～8 h,60%、80% O2包装组溶菌酶活力依旧处于较高水平,甚至接近CK组,溶菌酶水平回升有利于保护鱼体免受病原侵害。98% O2包装组在整个运输过程中花鲈体表黏液溶菌酶活力均处于最低水平,可能是O2刺激超出花鲈的适应范围,导致溶菌酶活力下降,也可能是包装环境中微生物数量引起的溶菌酶活力变化[25]。唤醒后花鲈体表黏液溶菌酶活力接近运输0 h,暂养水可能降低溶菌酶活力。可见外部因素（温度、O2体积分数、微生物数量等）可直接引起花鲈体表溶菌酶活力变化。

2.3 包装充氧量对无水活运花鲈鳃的显微、超微结构影响

鱼类的鳃器官表面积大,具有呼吸、渗透压调节、排泄含氮废物、酸碱平衡功能,相比其他器官更易受到外界环境胁迫的影响,危及鱼体的正常生长[26-28]。取正常鱼鳃（CK）、运输0 h、运输8 h时花鲈鳃丝进行组织切片观察,花鲈鳃丝包括鳃小片、鳃丝血管和结缔组织等。图3为鳃丝横截面显微结构,CK组花鲈鳃丝形态对称、细长,血管饱满、内部充盈,具有发达的管囊系统（图3A）。经历降温处理后运输0 h的鳃丝明显肿胀、肥大、不对称、边缘模糊,可能是由于降温使鱼鳃消耗大量能量,导致变形（图3B）。60% O2包装组运输8 h后与CK组相比,鳃丝肿胀、鳃小片融合,边缘加厚（图3C）。80% O2包装组运输8 h后,其腮最接近CK组的正常形态,但由于运输原因,呈现不对称形态,表明鳃丝弯曲。98% O2包装组运输8 h后,花鲈鳃丝轻微肿胀,鳃小片融合,末端膨大。鳃丝结构极易受到外界环境影响,整个保活运输操作中降温处理对鳃丝的影响最大,包装运输过程中充氧量也对鳃丝形态有影响,在运输过程中保证鳃丝正常形态有利于运输结束后花鲈的恢复。

由图4可知,鳃小片上皮细胞表面着生有环形微嵴（circulars microridged,CM）、星点棒状（star point rodshaped,SPRS）和微绒毛（microvilli,MIC）,CM形成类似迷宫的纹路,具有较深的沟。CM轮廓直径范围为5.11～9.38 μm、SPRS轮廓直径范围为6.25～10.57 μm、MIC轮廓直径范围为6.89～9.57 μm。鳃小片上皮细胞表面凹陷,形成了类似丘陵的小山,增加了鳃小片的表面积,也可参与气体交换[29-30]。CK组鳃小片平整,CM沟壑清晰,SPRS分布均匀（图4A）；运输0 h后,鳃小片上皮细胞CM沟壑加深,SPRS、MIC分布密集,且与CM连成一片,可能是上皮细胞因为降温发生了皱缩（图4B）；60%、80%、98% O2包装组运输8 h后,CM、SPRS数量减少,MIC几乎不可见,可能是因为无水活运导致鳃小片缺水而发生皱起、不平,使其发生不可逆的形态变化。相比之下,80% O2包装组花鲈鳃小片微观形态更接近CK组。

由图5可知,花鲈鳃丝边缘有SPRS,内部微细囊管系统极为发达、分布密集,细胞内部线粒体数量多、体积大。线粒体是细胞代谢的能量来源,机体生命活动80%的能量来自线粒体,大体积的线粒体能更充分地利用包装中O2,黏液细胞发达可分泌含溶菌酶的黏液形成鱼鳃表面防线[31-32]。CK组花鲈鳃丝边缘SPRS突出明显,黏液细胞发达,并与外界直接相连（图5A）；运输0 h组与CK组相比,线粒体数量增多,体积增大,表明鱼体正需要大量能量；60%、80%、98% O2包装组运输8 h后,游离线粒体增多且趋于表皮,边缘微嵴变粗且数量减少,可能是由于这些花鲈直接暴露于O2中,这与图4中扫描电子显微镜观察的结果一致。对比发现,80% O2包装组运输8 h后,鱼鳃组织形态更接近CK组。

3 讨论

无水活运过程中使用高体积分数O2充注包装,目的是为了提高体表花鲈辅助呼吸器官效率,但这也增加了氧自由基的生成,造成鱼体细胞受损。已有关于无水活运研究多数采用纯氧包装,少数采用空气包装,关于无水运输包装中充氧体积分数使用范围过于宽泛,不利于实际应用中精确控制,且造成资源浪费。在相同运输时间下,60% O2包装组花鲈血清中MDA浓度最低,80% O2组花鲈血清中SOD活力未随运输时间延长升高,充氧包装会增加花鲈无水活运过程中的氧化应激反应。80% O2组溶菌酶活力维持在较高水平,98% O2包装组花鲈体表黏液溶菌酶活力在运输操作中较低,溶菌酶活力受环境刺激的影响,具体包括降温操作、充氧浓度、微生物数量等；鱼鳃组织形态因无水活运操作受到影响,不同O2体积分数包装运输8 h后,花鲈鱼鳃均出现不同了程度的鳃丝肿胀、鳃小片融合,边缘加厚,末端膨大现象,其中80% O2包装组运输8 h后最接近CK组正常形态,但由于运输原因,呈现不对称形态,表明鳃丝弯曲。超微结构显示鳃小片因无水操作造成皱起不平,表面上皮细胞CM、SPRS数量减少,MIC几乎不可见,鳃丝内部游离线粒体增多且趋于表皮,黏液细胞减少,表皮边缘微嵴变粗或脱落。充氧包装提高鱼呼吸器官效率,而与O2直接接触会导致鳃组织上皮细胞轻微变化；因而,接近纯氧的体积分数98% O2的包装运输花鲈并未显现优势。综上,降低包装中O2体积分数至60%～80%对运输中的花鲈保活更有益处。

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