亚硝胺是一类含氮的化学物质,是最重要的化学致癌物质和四大食品污染物之一。亚硝胺的摄入会导致急性中毒、慢性中毒,严重时会有引发肿瘤和致癌的风险[1-3]。人体内的亚硝胺主要通过外源性摄入和内源性生成2 个途径形成。其中外源性主要来源于加工食品自身存在的亚硝胺及其前体物质,而内源性主要是由于亚硝胺在体内的合成[4]。亚硝胺的生成受众多因素的影响,主要有烹饪方式、烹饪温度、时间、脂肪含量、蛋白质含量及变化和亚硝酸盐用量等[5-6]。近年来,国外有学者研究探讨氨基酸对肉制品中亚硝胺形成作用及其品质影响,但国内相关研究较少。蛋白质氧化可以产生游离氨基酸和生物胺等亚硝胺的前体物质。蛋白质氧化产生的易亚硝化游离氨基酸,如脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸等在微生物的作用下均可发生脱羧反应,继续反应生成亚硝胺[7-8]。Warthesen等[9]认为甘氨酸、缬氨酸是形成N-亚硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine,NDMA)的前体氨基酸,L-丙氨酸可形成N-亚硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine,NDEA);Cosson等[10]认为作为脱羧底物的游离氨基酸与生物胺的存在部分相关,在一定条件下,生物胺可以生成亚硝胺;Drabik等[11]认为赖氨酸是NDMA的前体物质。此外,氨基酸对改善产品的品质也有一定作用,赖氨酸、精氨酸和其他外源氨基酸能够改善产品的风味,抑制脂肪氧化,提高产品的保水性、质构和乳化能力[12-15]。
本研究将3 种常见氨基酸(精氨酸、丙氨酸、脯氨酸)和不同含量亚硝酸钠加在西式熏煮火腿配料中,研究几种氨基酸对制成西式熏煮火腿的质构、色差、pH值、硫代巴比妥酸反应产物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)值、水分和蒸煮损失等品质及亚硝酸盐残留量、N-亚硝胺形成的影响规律,旨在为肉制品中N-亚硝胺的抑制和产品品质的提高提供理论依据和借鉴参考。
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复合磷酸盐 滕州市香凝生物工程有限公司;亚硝酸钠(食品级) 杭州龙山化工有限公司;卡拉胶(食品级) 河南千志商贸有限公司;亚硝胺混合标准品(N D M A、N-亚硝基乙胺(N-nitrosomethylethylamine,NMEA)、NDEA、N-亚硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine,NPYR)、N-亚硝基-二正丙胺(N-nitrosodi-npropylamine,NDPA)、N-亚硝基哌啶(N-nitrosopiperidine,NPIP)、N-亚硝基吗啡胆碱(N-nitrosomorpholine,NMOR)、N-亚硝基二苯胺(N-nitrosodiphenylamine,NDpheA),均为色谱纯)美国Sigma公司;二氯甲烷、甲醇(均为色谱纯)山东禹王和天下新材料有限公司;精氨酸、脯氨酸、丙氨酸标准品(均为分析纯) 北京北方伟业计量研究所;亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、三氯甲烷(均为分析纯) 北京化工厂;冰醋酸、乙二胺四乙酸、硫代巴比妥酸、无水硫酸钠(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。
手动灌肠机 鑫腾峰五金公司;多管旋涡混合仪金坛区白塔金昌试验仪器厂;TGL-16gR型台式冷冻离心机 西陇化工股份有限公司;TU-1810紫外-可见分光光度计 上海惠世生化试剂有限公司;JC-WD-12型圆形水浴氮吹仪 青岛聚创环保设备有限公司;WFS分光测色仪 上海仪电物理光学仪器有限公司;CT3质构仪 美国Brookfie公司;RYX-DY-25-D-M-15烟熏炉嘉兴瑞邦机械工程有限公司;MZS-小型实验均质机器江苏无锡市永和轻化设备厂;G R 3 0真空滚揉机诸城市瑞洋机械有限公司;斩拌机 诸城市强大机械厂;XO-SM50超声波-微波联合装置 南京仪器有限公司;5977A气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)仪 美国Agilent公司。
1.3.1 西式熏煮火腿样品制备
基本配方:猪精肉100 g,食盐2.5 g,糖1 g,水28 g,复合磷酸盐0.3 g,味精0.3 g,马铃薯淀粉3 g,卡拉胶0.6 g。
制备工艺流程:原料肉预处理→滚揉腌制→斩拌→灌肠→煮制→烟熏→冷却。
工艺操作要点:
1)原料预处理:选新鲜的猪后腿肉修整,去皮、骨、结缔组织、筋键、淋巴、脂肪,使其成为纯精肉,10%用料理机绞成肉糜,90%切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肉丁,混合均匀,每个样品质量为100 g;2)腌制:按照基本配方配制腌制液。将肉放入腌制液中,顺时针搅拌均匀,装入滚揉袋中密封,滚揉后置于冰箱中4 ℃腌制48 h;3)滚揉:真空度0.04 MPa下滚揉4 h,滚揉10 min,间歇20 min;4)灌肠:将滚揉腌制混合好的肉馅用简易手动灌肠机灌制,灌装时要松紧适度,灌好的火腿应扎孔排气;5)煮制:本实验采用水煮的方法,水煮时将蒸煮锅水温控制在80 ℃煮制40 min;6)熏制:将煮好的火腿置于烟熏炉中75 ℃烟熏60 min,冷却后制得实验样品,供后续实验使用。
1.3.2 实验设计
参照Drabik等[16]的方法。在亚硝酸钠用量分别为0、150、480 mg/kg条件下,研究分别添加1 000 mg/kg精氨酸、丙氨酸和脯氨酸对西式熏煮火腿质构、色差、pH值、TBARS值、水分含量、蒸煮损失、亚硝酸盐残留量和亚硝胺含量的影响。其中,空白组是指不加氨基酸和亚硝酸钠样品组。
1.3.3 质构测定
通过CT3质构仪进行测定。设置参数为:测试类型TPA,探头TA-44,形变50%,触发点荷载50 g,测试速度1 mm/s。每个样本重复测定3 次,取平均值。
1.3.4 色差测定
通过测色仪进行测定。指标用L*(亮度)值,a*(红度)值和b*(黄度)值表示。每个样本重复测定3 次,取平均值。
1.3.5 pH值测定
依据GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》方法测定。
1.3.6 TBARS值测定
依据Du等[17]的方法测定。
1.3.7 水分含量测定
依据GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中的直接干燥法测定。
1.3.8 蒸煮损失计算
蒸煮损失按式(1)计算:
式中:W1为灌制后煮制前的火腿质量/g;W2为熏制后冷却到室温的火腿质量/g。
1.3.9 亚硝酸盐残留量
依据GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法测定。
1.3.10 N-亚硝胺含量测定
样品处理:使用超声溶剂萃取法,依据Yuan Yuan等[18]的方法,适当修改。将10 g切碎的样品放入绞肉机中搅碎,放入100 mL烧杯中,加20 mL二氯甲烷。用超声波细胞破碎器超声提取15 min。再加入20 mL二氯甲烷重复提取15 min,以便完全收集挥发性亚硝胺。过滤后,用无水硫酸钠吸水再过滤。随后在40 ℃下使用氮吹仪将液体吹近干。加入1 mL甲醇,在多管涡旋混合仪中搅拌1 min使溶液复溶。最后,甲醇水溶液通过尼龙0.45 μm注射过滤器过滤,用于气相色谱-质谱分析。
使用GC-MS测定亚硝胺含量,质谱仪配备惰性离子源和无分流进样口。HP-INNOWax毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)用于优化方法。氦气载气保持在1 mL/min的恒定流量。注射端口保持在250 ℃,并在无分流模式下使用,施加8.19 psi的压力脉冲。气相色谱烘箱温度设定如下:起始温度为60 ℃(保持3 min),以10 ℃/min的速度升至180 ℃,然后20 ℃/min升至240 ℃,保持7 min。电离在电子碰撞模式(70 eV)下进行。离子源和传输线的温度分别为230 ℃和250 ℃。溶剂切割时间为4 min。为了确定每种分析物的保留时间,之前以扫描模式在m/z 30~200范围内注射储备溶液。然后在选定的离子监测模式下,使用目标离子和限定离子对分析物进行定量。为每种化合物选择的离子为NDMA(74)、NMEA(88)、NDEA(102)、NPYR(100)、NDPA(130)、NPIP(114)、NMOR(116)和NDpheA(169)。
采用Origin 8.0和SPSS 17.0统计软件进行数据处理,所有实验重复进行3 次。
由表1可知,在不同亚硝酸钠用量下,添加精氨酸、丙氨酸和脯氨酸的产品硬度分别增加了5.00%~6.70%、1.84%~2.11%、1.20%~2.50%(P<0.05),加精氨酸产品的硬度值大于其他氨基酸组;添加精氨酸、丙氨酸和脯氨酸使产品的内聚性和胶着性分别提高了10.42%~46.15%、4.17%~34.62%、46.15%~72.97%;2.81%~6.47%、3.02%~7.19%、13.46%~30.94%(P<0.05),且随亚硝酸钠用量的增加逐渐增大;氨基酸的加入显著改变了产品的弹性(P<0.05),其中添加精氨酸产品的弹性增加了2.36%~2.89%,添加丙氨酸产品的弹性减小了6.54%~16.67%,添加脯氨酸组产品的弹性减小了0.73%~9.70%。精氨酸和丙氨酸的添加分别使产品的咀嚼性增大了5.70%~27.37%、13.92%~14.89%(P<0.05),但脯氨酸的加入对咀嚼性的影响不显著(P>0.05)。
表1 氨基酸对西式熏煮火腿质构的影响
Table 1 Effect of amino acids on texture of western-style smoked sausage
注:字母不同表示同行差异显著(P<0.05)。下同。
指标 亚硝酸钠/(mg/kg)组别不添加氨基酸 精氨酸 丙氨酸 脯氨酸硬度/g 0 581.00±3.00d 610.00±7.00a593.00±8.00b588.00±3.00c 150 543.00±4.00d575.00±8.00a553.00±5.00b551.00±2.00c 480 520.00±6.00c555.00±1.00a531.00±2.00b533.00±4.00b内聚性0 0.26±0.08c 0.38±0.11a 0.35±0.10b 0.38±0.14a 150 0.37±0.11c 0.41±0.13b 0.42±0.09b 0.64±0.10a 480 0.48±0.09c 0.53±0.04b 0.50±0.12b 0.73±0.15a弹性/mm 0 2.77±0.45b 2.85±0.53a 2.60±0.47c 2.75±1.01b 150 3.89±0.58b 3.98±0.78a 3.36±1.21d 3.62±0.97c 480 4.41±1.01b 4.52±0.99a 3.78±1.05d 4.02±1.43c胶着性/g 0 139.00±5.00c148.00±3.00b149.00±5.00b 182±3.00a 150 249.00±7.00d256.00±4.00c264.00±3.00b 291±5.00a 480 364.00±5.00c377.00±6.00b375.00±4.00b 413±5.00a 0 4.70±1.10c 5.90±1.90a 5.40±2.00b 4.80±1.50c 150 9.50±2.00c 10.30±1.20b 12.10±1.90a 9.80±1.90c 480 15.80±1.80c 16.70±2.20b 18.00±2.70a 15.70±2.30c咀嚼性/mJ
表2 氨基酸对西式熏煮火腿色差的影响
Table 2 Effect of amino acids on color of western-style smoked sausage
指标 亚硝酸钠/(mg/kg)组别不添加氨基酸 精氨酸 丙氨酸 脯氨酸L*0 75.77±0.55a75.35±0.50a74.98±0.21b75.74±0.15a 150 73.13±0.17a72.82±0.19b72.76±0.21b73.61±0.30a 480 72.55±0.09a71.69±0.14b71.97±0.12b72.72±0.26a a*0 4.43±0.08b4.95±0.02a5.02±0.01a4.37±0.01c 150 6.09±0.10b6.60±0.05a6.54±0.03a5.96±0.02b 480 7.58±0.10b8.09±0.09a8.11±0.08a7.46±0.03b b*0 30.06±0.12a29.97±0.35ab29.51±0.39b30.03±0.09a 150 27.75±0.23a27.26±0.21a27.42±0.17a27.74±0.06a 480 26.46±0.11a26.01±0.18b26.20±0.09a26.42±0.07a
由表2可知,添加精氨酸和丙氨酸使产品的L*值分别降低了0.42%~1.20%、0.50%~1.05%(P<0.05)。脯氨酸的加入对产品L*值的影响不显著(P>0.05)。精氨酸和丙氨酸的添加使产品的a*值分别增加了6.73%~11.74%、6.99%~13.32%(P<0.05),但脯氨酸对a*值的影响不显著(P>0.05),且随着亚硝酸钠用量的增加a*值逐渐增大。精氨酸、丙氨酸和脯氨酸的加入对产品b*值的影响不显著(P>0.05),且随着亚硝酸钠添加量的增加,产品的b*值逐渐减小。
图1 氨基酸对西式熏煮火腿pH值的影响
Fig. 1 Effect of amino acids on pH of western-style smoked sausage
由图1可知,添加精氨酸、丙氨酸和脯氨酸分别使产品的pH值增大了8.55%~9.06%、1.90%~2.05%、3.39%~3.57%(P<0.05),其中,加精氨酸产品的pH值最大,这可能是因为精氨酸是碱性氨基酸。随着亚硝酸钠用量的增加,pH值并无显著性差异(P>0.05)。
图2 氨基酸对西式熏煮火腿TBARS值的影响
Fig. 2 Effect of amino acids on TBARS value of western-style smoked sausage
由图2可知,精氨酸、丙氨酸和脯氨酸的加入分别使产品的TBARS值减小了1.95%~4.63%、5.57%~12.43%、2.35%~19.35%(P<0.05),且随着亚硝酸钠用量的增加,产品的TBARS值显著减小(P<0.05)。
由图3可知,与不添加氨基酸组相比,精氨酸的产品的水分增加了2.65%~3.29%(P<0.05),而添加丙氨酸和脯氨酸组水分变化不显著(P>0.05)。
图3 氨基酸对西式熏煮火腿水分的影响
Fig. 3 Effect of amino acids on moisture of western-style smoked sausage
图4 氨基酸对西式熏煮火腿蒸煮损失的影响
Fig. 4 Effect of amino acids on cooking loss of western-style smoked sausage
由图4可知,在亚硝酸钠用量为0 mg/kg和150 mg/kg时,加氨基酸均可降低产品的蒸煮损失,但影响不显著(P>0.05),在亚硝酸钠用量为480 mg/kg时,氨基酸的加入能够显著减少产品的蒸煮损失(P<0.05),添加精氨酸、丙氨酸和脯氨酸的产品分别减少了6.07%、3.62%和5.11%,且添加精氨酸组的蒸煮损失最小。
图5 氨基酸对西式熏煮火腿亚硝酸盐残留量的影响
Fig. 5 Effect of amino acids on residual nitrite concentration of western-style smoked sausage
由图5可知,在不添加亚硝酸钠时,加氨基酸产品的亚硝酸盐残留量与不添加氨基酸组无显著性差异(P>0.05)。当亚硝酸钠用量为150 mg/kg时,加精氨酸和丙氨酸分别使产品的亚硝酸盐残留量减少了28.72%和17.22%(P<0.05);亚销酸钠添加量为480 mg/kg时,精氨酸和丙氨酸处理组亚硝酸盐残留量分别减少9.71%和9.41%;而脯氨酸产品则高于不添加氨基酸组。
图6 不同处理组样品的总离子流色谱图
Fig. 6 Total ion current chromatograms of N-nitrosamines in different treatment groups
表3 氨基酸对西式熏煮火腿-亚硝胺含量的影响
Table 3 Effect of amino acids on -nitrosamine contents of western-style smoked sausage
注:nd.未检出。
N-亚硝胺 亚硝酸钠/(mg/kg)含量/(μg/kg)不添加氨基酸组 精氨酸 丙氨酸 脯氨酸NDMA 0 5.582±0.534c7.349±0.442a6.004±1.113b 5.662±0.864c 150 17.462±3.145d19.903±4.241a18.125±3.123b17.995±2.436c 480 26.845±4.568d30.012±5.786a27.349±3.168b27.044±3.689c NDPA 0 0.150±0.008c 0.428±0.068a0.177±0.014b 0.435±0.035a 150 0.504±0.098b0.697±0.108a0.518±0.135b 0.461±0.091c 480 0.623±0.212c0.732±0.080a0.428±0.084d0.696±0.123b 0 NPYR nd 0.009±0.001b nd 0.874±0.136a 150 nd 0.062±0.005b nd 1.274±0.321a 480 0.059±0.009c0.093±0.005b0.009±0.001d 3.073±0.782a NDpheA 0 0.356±0.146a0.286±0.092b0.337±0.101a0.197±0.077c 150 0.363±0.102a0.224±0.099c0.247±0.085b 0.228±0.071c 480 0.416±0.146a0.217±0.870d0.286±0.121c0.350±0.098b 6.088 8.027 6.518 7.168 150 18.329 20.886 18.890 19.958 480 27.943 31.054 28.072 31.163 0总量
由图6、表3可知,在不添加亚硝酸钠时,加氨基酸能够增加产品的NDMA含量,其中精氨酸和丙氨酸与不添加氨基酸组相比,NDMA含量分别增加了31.66%和7.56%(P<0.05);当亚硝酸钠用量为150 mg/kg和480 mg/kg时,添加氨基酸与不添加氨基酸组相比能够显著增加NDMA的含量(P<0.05),其中精氨酸产生更高的NDMA含量。在不同亚硝酸钠用量条件下,氨基酸的加入与不添加氨基酸组相比,均能显著增加NDPA的含量(P<0.05),当亚硝酸钠用量为0 mg/kg和150 mg/kg时,不添加氨基酸组和添加丙氨酸组均未检测到NPYR的存在,且添加脯氨酸组的NPYR含量显著高于添加精氨酸组;当亚硝酸钠含量为480 mg/kg时,均检测到NPYR的存在,且添加精氨酸和脯氨酸组的NPYR含量显著高于不添加氨基酸组(P<0.05),而添加丙氨酸组的NPYR含量显著低于不添加氨基酸组(P<0.05)。
精氨酸和脯氨酸属于碱性氨基酸,能够在一定程度上增大产品的pH值[13,19],使肌原纤维蛋白远离等电点,增大肌原纤维蛋白之间的静电斥力,从而增加了与水分子结合的位点,使得产品的保水性得到改善。脯氨酸与精氨酸增大了产品的pH值,且均提高了产品的蒸煮得率[14,19-20]。Lei Zhen等[21]研究表明,当精氨酸浓度增加时,肌球蛋白溶液的pH值显著增加。同时精氨酸的胍基能够提高猪肉肌球蛋白的溶解性,有利于蛋白质的溶出,增强乳化体系的稳定性,形成致密稳定的三维蛋白结构[22-24]。此外精氨酸的加入能够增加肌球蛋白表面疏水残基和活性巯基的含量[25],从而进一步改善产品的质地。Qin Hao等[26]研究表明,精氨酸的加入显著增大了内聚性、弹性和咀嚼性,这与本研究结果一致。氨基酸的加入在一定程度上具有抗氧化和发色的作用[27],能够抑制蛋白质和脂肪的氧化,从而降低产品的TBARS值,这与Xu Peng[28]和Hes[29]等的研究结果一致。产品色差值的变化,可能是由于氨基酸的加入导致产品的pH值发生变化,从而改变了产品的保水性,水分含量增加,导致产品的L*值减小[30],同时a*值在还原态肌红蛋白状态下为红色,在氧化态肌红蛋白下为棕色或褐色[31],氨基酸的加入会抑制血红蛋白氧化,增强血红蛋白浓缩物稳定性,从而产品具有更高的a*值,这与Zhou Cunliu等[32-33]的研究结果相一致。Ning Cheng等[12]研究表明,与不加亚硝酸钠和氨基酸的香肠相比,仅添加0.01%亚硝酸钠的香肠L*值下降,a*值显著增大,b*值显著降低。Zhou Cunliu等[19]研究表明,随精氨酸添加量增加,猪肉肠的L*值持续下降(P<0.05)。添加0.4%以上精氨酸显著增大了产品的a*值,显著降低了b*值,本研究结果一致。
产品亚硝酸盐残留受氨基酸的影响,精氨酸和丙氨酸可与亚硝酸钠反应,生成亚硝胺和其他物质,同时亚硝酸盐会与蛋白质分解产生的胺进行反应,生成亚硝胺,从而降低亚硝酸盐残留量[34]。Ning Cheng等[12]研究表明,加精氨酸后可显著降低亚硝酸钠处理后产品中亚硝酸盐的残留量,这与本研究结果一致。当亚硝酸钠用量为0 mg/kg和150 mg/kg时,不添加氨基酸组和添加丙氨酸组均未检测到NPYR的存在,这可能是由于丙氨酸不能促进NPYR的形成。在不同亚硝酸钠用量条件下,不同氨基酸添加组的NDpheA含量均显著低于不添加氨基酸组(P<0.05),这可能是由于这3 种氨基酸的加入不利于NDpheA的形成。加氨基酸产品的亚硝胺总量显著高于不添加氨基酸组,这可能是由于氨基酸的加入促进了亚硝胺的形成。Drabik等[11,16]研究表明,脯氨酸的加入不影响NDMA的形成,但对NPYR的形成有显著影响,与亚硝酸钠用量相比,脯氨酸对NPYR产量的影响较大,脯氨酸作为亚硝胺形成前体的重要性得到了证实。刘云等[35]研究表明,精氨酸提高了肉制品中NDMA的含量。Ender等[36]认为丙氨酸可以形成NDMA,与本实验结论一致。
3 种氨基酸可作为品质改良剂改善产品的质构和色泽、保水性,减少产品的氧化;精氨酸和丙氨酸能降低西式熏煮火腿中亚硝酸盐的残留量,但3 种氨基酸的加入均增加了N-亚硝胺的总量。因此,3 种氨基酸可作为前体氨基酸,能在一定程度上促进N-亚硝胺的生成,在加工过程中应尽量避免添加这3 种氨基酸达到抑制N-亚硝胺形成的目的。本研究为N-亚硝胺形成机理深入研究以及肉制品品质的提高提供理论依据。
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