抑菌肽是广泛存在于自然界生物体中的一类小分子肽，是人或动物先天免疫系统的重要组成部分[1]。抑菌肽具有抑菌活性强、抑菌谱广、稳定性高、种类繁多、不产生抗药性，对动物、人体的正常细胞无毒无害等优点[2]，近年来成为动物饲料加工、食品防腐剂、生物防治、医药研发等领域研究的热点。抗菌肽主要来源于微生物、植物、动物[3-4]，其中微生物来源的抗菌肽因资源丰富、生长周期短、代谢快等优点，为目前研究开发的重点。
属于生防菌株的解淀粉芽孢杆菌（B a c i l l u s amyloliquefaciens），可强烈抑制多种病原真菌，如番茄青枯病菌[5]、芦笋茎枯病菌[6]、水稻纹枯病菌[7]，及多种细菌的生长，目前被广泛用于饲料添加[8]、食品防腐[9]、生物防治、污水治理[10-11]等领域。近年来，已有许多学者对B. amyloliquefaciens发酵产物中抑菌活性成分进行分离分析研究。Wong[12]和Arrebola[13]等分别从B. amyloliquefaciens发酵产物中分离出可抑制肝癌、结肠癌细胞生长的蛋白质及具有抑制病原真菌作用的IturinA脂肽。An Junying等[14]从B. amyloliquefaciens ZJHD3-06发酵产物中分离出分子质量为20 kDa、对食物腐败菌有抑制作用的细菌素CAMT2。桑建伟等[15]用聚合酶链式反应技术判断B. amyloliquefaciens BEB17是否含有脂肽类和聚酮类物质的合成基因，结合质谱法分析，已明确证明菌株可分泌Surfactin、Fengycin和Iturin三类脂肽，及Bacillibactin、Difficidin和Bacillaene三类聚酮类物质。目前分离得到的抑菌肽大多具有分子质量小、带正电、两性亲和等特点[16]，如何高效的分离、纯化微生物产生的具有高抑菌活性的物质已成为研究热点。
前期通过诱变及培养基配方优化，使B. amyloliquefaciens发酵液的抑菌物质活性大幅度提高[17]。在此基础上，本实验以B. amyloliquefaciens发酵液作为原料，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，对发酵液中抑菌活性成分进行多步分离纯化，并对抑菌活性较高的成分进行鉴定及抑菌谱的表征，以期为新型抗菌肽的不断开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
B. amyloliquefaciens、大肠杆菌（E. coli）JM 109、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）WB 600均为本实验室保存；肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）BNCC 103134、单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）CICC 336877 北纳生物菌种保藏管理中心；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213 中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 培养基
种子培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖40 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCO3 10 g/L，pH 7； 发酵培养基：麦芽糖10 g/L、蛋白胨15 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、CaCO3 10 g/L、琼脂20 g/L（固体培养基添加），pH 7；LB培养基：酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、琼脂20 g/L（固体培养基添加），pH 7。
1.1.3 试剂
流动相试剂均为色谱纯。
1.2 仪器与设备
ÄKTA avant蛋白纯化系统 美国GE公司；1525 EF半制备型反相高效液相色谱（reverse phasehigh performance liquid chromatography，RP-HPLC）系统、MALDI SYNAPT MS液相色谱-质谱（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS）系统美国Waters公司；CF15RN立式冷冻离心机 日本Hitachi公司；0.22 μm水相滤膜 上海弗立特实业有限公司；Enspire 2300多功能酶标仪 珀金埃尔默有限公司。
1.3 方法
1.3.1 蛋白质质量浓度测定
用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒测定多肽及蛋白质质量浓度，以牛血清白蛋白为标准蛋白，测定并绘制标准曲线，测定范围为25～2 500 μg/mL。
1.3.2 抑菌圈测定
参考石慧等[18]对放线菌抑菌活性的检测方法，对其进行改良。无菌平板内放置3 枚内径为7 mm的无菌牛津杯，取生长对数期的指示菌菌液，加入预冷至40 ℃的固体LB培养基中，使指示菌的终浓度为107 CFU/mL，倒平板，冷却后，取出牛津杯，每孔加入100 μL，BCA质量浓度为1 mg/mL的抑菌剂。4 ℃扩散1 h后，37 ℃培养24 h，用游标卡尺测抑菌圈直径，求平均值。
1.3.3 抑菌率测定
取100 μL BCA质量浓度为1 mg/mL的抑菌剂与100 μL菌浓度为108 CFU/mL的指示菌菌悬液混合均匀，37 ℃培养24 h，用酶标仪在600 nm波长处测定吸光度。等量无菌LB液体培养基代替抑菌剂作对照，抑菌率计算公式如下：
式中：A1为实验组的吸光度；A0为对照组的吸光度。
1.3.4 抑菌物质的纯化鉴定及抑菌谱表征
1.3.4.1 抑菌物质粗提液的制备
从B. amyloliquefaciens的固体平板上挑取单菌落，接种于种子培养基，37 ℃、150 r/min培养9 h后以接种量2%（体积分数）接种于发酵培养基，相同条件下培养24 h，4 ℃、8 000 r/min离心20 min，用0.22 μm无菌滤膜对上清液过滤除菌，缓慢滴加6 mol/L HCl溶液，不断搅拌至pH 2，4 ℃过夜保存，4 ℃、8 000 r/min离心20 min，弃上清液，用等量的无菌水重悬沉淀，用2 mol/L NaOH溶液调节pH 7。冷冻干燥后，用三氯甲烷-甲醇（3∶1，V/V）的多次萃取，40 ℃旋转蒸发仪蒸发有机溶剂，得到黄色晶体。测定BCA质量浓度并检测抑菌活性。
1.3.4.2 DEAE-Sepharose-Fast Flow阴离子交换层析
用少量甲醇溶解1.3.4.1节粗提样品，用滤膜除菌，色谱柱：DEAE-Sepharose-Fast Flow阴离子色谱柱，流动相：A为20 mmol/L，pH 8的Tris-HCl缓冲液；B为1 mol/L NH4HCO3的Tris-HCl缓冲液；进样量5 mL，检测波长2 20 nm。用3 倍柱体积的流动相A洗脱后，用0%、60%、80%、100%体积分数的流动相B进行梯度洗脱，按峰收集，浓缩除盐后测定每个收集液的蛋白浓度并检测抑菌活性。
1.3.4.3 RP-HPLC分析
取1.3.4.2节分离得到的样品溶于少量甲醇中，用滤膜除菌。色谱条件：Waters XBridge Prep C18色谱柱（10 mm×250 mm，5 μm），流动相A：含0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）的乙腈，流动相B：含0.1% TFA的超纯水，流速0.5 mL/min，检测波长220 nm，进样量0.5 mL。用流动相B平衡3 倍柱体积，选择线性洗脱方式，按峰收集，除去有机溶剂后，测定蛋白质量浓度并检测抑菌活性。
1.3.4.4 LC-MS检测
收集抑菌活性较高的分离峰，用滤膜过滤除菌。层析柱：BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相A：含0.1% TFA的乙腈，流动相B：含0.1% TFA的超纯水，流速0.3 mL/min，进样量5 μL，检测波长220 nm，柱温45 ℃，梯度洗脱程序：0～3 min，5% A、95% B；3～15 min，5%～95% A、95%～5% B；15～17 min，95%～100% A、5%～0% B；17.1 min，5% A、95% B。分离峰被注入MALDI SYNAPT MS LC-MS系统，采用电喷雾电离正离子模式，获得信号峰的质谱图。
1.3.4.5 Surfactin与6肽的抑菌谱测定
配制BCA质量浓度为1 mg/mL的Surfactin与6肽的抑菌液，选取枯草芽孢杆菌、单核细胞性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌，根据1.3.2节方法，测定抑菌圈。
1.4 数据处理
实验均重复3 次，采用Origin 8.5软件处理数据。
2 结果与分析
2.1 DEAE-Sepharose-Fast Flow阴离子交换层析分离
如图1a所示，收集得到A、B、C、D四个峰，测定每个峰的抑菌圈直径和抑菌率，由图1b可知，洗脱液中NH4HCO3浓度为0.6 mol/L时，所对应的洗脱峰B检测出抑菌圈，抑菌直径为（19.2±0.3）mm，抑菌率为61.25%，由此判断洗脱峰B为活性峰，对其进一步分离。
图1 DEAE阴离子交换层析图谱（a）及其抑菌效果（bb）
Fig. 1 Separation of bioactive substances by DEAE anion ion exchange chromatography (a) and their antibacterial activity (b)
2.2 RP-HPLC层析分离
图2 RP-HPLC层析图谱（a）及其抑菌效果（bb）
Fig. 2 RP-HPLC chromatogram of peak B as shown in Fig. 1 (a) and antibacterial activity of its components (b)
采用RP-HPLC对离子交换层析得到的活性峰进一步分离，结果如图2a所示，收集共10 个洗脱峰，编号为A～J，测定各个峰的抑菌活性，如图2b所示，当乙腈体积分数为30%～40%时，对应洗脱峰D的抑菌活性最高，抑菌直径为（18.0±0.2）mm，抑菌率为57.62%；当乙腈体积分数为45%～55%时，对应洗脱峰F的抑菌活性次之，抑菌直径（16.2±0.3）mm，其抑菌率为48.35%，其他收集峰未检测出抑菌圈。由此得到2 种纯化产物，对其进一步质谱分析。
2.3 多步分离纯化的抑菌活性比较
图3 分离纯化活性峰的抑菌直径
Fig. 3 Diameters of inhibition zone of S. aureus when exposed to the fermentation supernatant of B. amyloliquefaciens and antibacterial components puri fied from it
B. amyloliquefaciens菌株发酵上清液通过酸沉、有机溶剂萃取、DEAE阴离子交换层析、半制备型RP-HPLC，最终得到两个抑菌活性较高的分离峰。抑菌剂的多肽质量浓度都均为1 mg/mL，以纯甲醇为对照，对比抑菌圈直径，由图3可见，抑菌活性从大到小为：酸沉有机溶剂萃取（28.1±0.3）mm＞发酵上清液（25.4±0.2）mm＞离子交换层析峰B（19.2±0.3）mm＞RP-HPLC峰D（18.0±0.2）mm＞RP-HPLC峰F（16.2±0.3）mm。据报道B. amyloliquefaciens发酵液中含有多种抑菌成分，通过分离纯化得到纯度相对较高的两种抑菌成分，与同质量浓度的粗提成分相比，发现抑菌活性反而降低，分析除纯化过程中部分抑菌活性可能有所损失外，推测多种抑菌成分并存时，可能还存在协同抑菌或联合抑菌效果。
2.4 LC-MS分析
2.4.1 活性峰D的质谱分析
利用LC-MS对活性峰D分析，由图4可见，主要信号峰出现在6.57、7.09、7.40 min，对3 个信号峰进行质谱分析，通过主要信号峰的积分面积，计算3 种脂肽同系物的纯度为93.78%。如图5所示，3 种[M+H]+的m/z分别为1 008.8、1 022.8、1 036.8的信号峰，它们的分子质量相差14 Da，与CH2的分子质量大小一致，说明相差一个脂肪酸链。分析三者的二级质谱图，图5中m/z为441.2是y型碎片离子峰，可解释为[Val-Asp-Leu-Leu/Ile+H]+；其中m/z 686.3的信号最强，为y型碎片离子峰，分析该碎片为[Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu/Ile+H2O+H]+。其中[M+H]+的m/z值为1 008.8的二级质谱中m/z 1 009.5－686.3=323.2，代表b型碎片离子，解释为[R13-Glu－H2O+H]+，同理，[M+H]+的m/z为1 022.8与1 036.8的二级质谱中，1 023.5－686.3=337.2代表[R14-Glu－H2O+H]+，1 037.5－686.3=351.2代表[R15-Glu－H2O+H]+。与黎循航[19]、向亚平等[20]报道的Surfactin[M+H]+的m/z吻合，与Chen Yulin等[21]报道的Surfactin二级质谱碎片符合，由此确定活性峰D主要为含有C13～C15三种脂肽Surfactin的同系物。
图4 活性峰D的色谱图
Fig. 4 Chromatogram of bioactive peak D as shown in Fig. 2
图5 主要信号峰的二级质谱图
Fig. 5 Tandem mass spectra of the main signal peaks as shown in Fig. 4
2.4.2 活性峰F的质谱分析
对活性峰F进行LC-MS分析，由图6可见，主要信号峰出现在10.52 min，此峰所占的峰面积为95.46%，此信号峰对应二级质谱图中的母离子[M+H]+为m/z 640.3。利用MassLynx V4.1软件对二级质谱中的特征碎片峰分析，结果如图7所示，预测活性峰F是由6 个氨基酸组成的小肽，序列为L-V-N-P-P-T。借助ExPasy中的ProtParam软件，在线分析该抑菌肽的分子质量为639.75 Da，分子式为C29H49N7O9，等电点为5.52，GRAVY为0.100，脂溶性指数113.33。将此多肽在NCBI、APD数据库进行同源性分析，结果如表1所示，发现与APD数据库中已报道抑菌肽的同源相似性较低，与来自链霉菌属的抗菌肽，APD ID为AP02577的氨基酸序列的同源性最高，为37.5%。由此推断，此6肽为一种新型抗菌肽。
图6 活性峰F的色谱图
Fig. 6 Chromatograms of bioactive peak F as shown in Fig. 2
图7 活性峰F的质谱图
Fig. 7 Mass spectrum of bioactive peak F as shown in Fig. 2
表1 6肽与APD数据库中已知的抗菌肽对比
Table 1 Comparison between the hexapeptide and known antibacterial peptides in the APD database
注：加粗代表相同的氨基酸残基。
++L VNPPT AP02577 37.50 66 +1 Streptomyces n ov.sp.（MST-115088）NVGVLNPPPLV++LV+N+PP+T AP00726 36.36 45 0 Lactobacillus acidophilus WLLVN++K+VSGPAGPPGTH LV++++NPP+T+ AP02978 33.33 18 +1 L. plantarum GZ1-27 LVNPPT 本研 究 100 33 0 B. amyloliquefaciens序列对比 APD ID 同源性/% 疏水率/% 净电荷数 来源
2.5 两种纯化肽的抑菌谱表征
Surfactin与该6肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都有抑菌效果，如表2所示。Surfactin对金黄色葡萄球菌、单核细胞性李斯特菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌的抑制活性高于6肽。两种抑菌肽对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、单核细胞性李斯特菌的抑制活性均较好。
表2 两种纯化肽的抑菌谱表征
Table 2 Antibacterial spectra of the two puri fied peptides
供试菌株 抑菌圈直径/mm Surfactin 6肽枯草芽孢菌 14.2±0.3 16.3±0.4金黄色葡萄球菌 18.0±0.2 1 6.2±0.3单核细胞性李斯特菌 23.7±0.5 20.4±0.3大肠杆菌 17.6±0.3 12.3±0.3肠炎沙门氏菌 21.4±0.4 15.1±0.4
3 结论与讨论
从B. amyloliquefaciens发酵上清液出发，通过酸沉、有机溶剂萃取，DEAE阴离子交换层析，结合制备型RP-HPLC，收集到抑菌活性较高的2 个洗脱峰。对2 种纯化产物进行LC-MS分析，由二级质谱中的特征离子碎片，结合文献[21-22]报道及MassLynx V4.1软件分析，明确纯化产物为含有C13～C15脂肪酸链的Surfactin同系物与氨基酸序列为L-V-N-P-P-T，分子质量为639.75 Da的抑菌肽。将6肽的氨基酸序列与APD数据库中已报道的抑菌肽进行同源性比较，其中同源性最高的仅为37.5%，由此推断，此6肽为新型抗菌肽。鉴于Surfactin与6肽对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、单核细胞性李斯特菌3 种致病菌的生长均有较强的抑制作用，可将其应用于肉类、奶制品等食品防腐剂或饲料添加剂中。
Surfactin最早发现于芽孢杆菌发酵产物，属于环脂肽类抑菌物质。Surfactin由7 个氨基酸和含有C13～C15的脂肪酸链组成[23]，兼备两性物质的特点，分子质量小，抗逆性强，具有抗肿瘤、真菌、支原体、病毒的功效[24]。近年来被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域。目前认为，Surfactin的抑菌作用是通过使敏感细胞膜上的酰基链发生倾斜，磷脂基团重定向于细胞膜内部[25]，导致Surfactin的肽段插入细胞膜，从而有效破坏细胞膜渗透性及完整性[26-27]。
纯化得到的6肽疏水性较强，具有分子质量小、合成简单的优点。结合疏水性较强的肽类可在体外与敏感细菌的DNA结合的报道[28]，推测该6肽穿过细胞膜后，可与细菌DNA双螺旋内部的疏水区结合，干扰细菌DNA的转录、复制、翻译，影响细胞正常分裂。
在分离过程中发现菌株代谢产生多种抑菌物质，随着单一抑菌成分纯度提高，发现抑菌物质的活性提升并不显著。目前，已发现鼠李糖脂与乳酸菌素Nisin可协同抑制李斯特菌[29]，ε-葡萄素与万古霉素可协同抑制金黄色葡萄球菌[30-31]。由此推测，B. amyloliquefaciens发酵液中多种抑菌物质之间可能也存在协同或者联合抑菌作用。新型抑菌肽的抑菌机理及可能的协同或联合抑菌作用有待进一步的研究。
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