鲜食玉米发育可分为吐丝期、籽粒建成期、乳熟期、蜡熟期、完熟期等阶段[1]。在不同的发育阶段有不同的食用方式，如玉米笋是指刚刚抽丝、尚未鼓粒的幼嫩果穗，穗粒同食[2]；鲜食玉米则以吐丝授粉后发育20 d左右的乳熟期籽粒为食用部位[3-5]。无论是玉米笋还是玉米籽粒，甜味都是鲜食玉米重要的风味特色。据研究，甜玉米中甜味与糖含量尤其是蔗糖含量显著相关，并对消费者的整体嗜好性起了至关重要的作用[6]，因此依据发育过程中糖含量变化规律确定甜玉米的鲜食适采期已多有报道[3-5]。在中国，糯玉米是除甜玉米之外的另一种重要的鲜食玉米类型，在格局上有“南甜北糯”之说。但糯玉米中糖含量的报道更多以可溶性糖表示[3]，难以判断是否可参考甜玉米的甜味评价方式。除糖外，游离氨基酸为公认的呈味物质，如甘氨酸和丙氨酸呈甜味，谷氨酸对鲜味有重要贡献，在番茄[7]、蘑菇[8]等食材中得到广泛研究。但是，有关鲜食玉米中游离氨基酸的研究较少，Masuda等[9]对几种甜玉米中的游离氨基酸分析发现谷氨酸和丙氨酸的含量（鲜质量）分别为70～120 mg/100 g和80～100 mg/100 g，高于水溶液中鲜味和甜味的感官阈值。另有研究表明[10]，鲜食玉米汁中游离糖和氨基酸因胚乳类型的不同可高于或低于感官阈值，但对发育过程中糯玉米游离氨基酸变化则鲜见报道。
除作为重要的滋味成分外，糖和氨基酸还作为食品风味物质或有害物质的前体物[11-12]被广泛报道，还有的氨基酸因生理调节作用而被关注[13-14]。鲜食玉米因多汁味美的特征，也往往被加工成饮品[15]，几十年来始终能在多变的饮料市场占据一席之地。但是，以往研究多围绕玉米的鲜食特性或玉米汁工艺配方开展，在玉米的适宜制汁发育期、适宜性上缺乏必要数据。因此本实验分别选取甜玉米和糯玉米2 种鲜食玉米，采取高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对吐丝授粉始至乳熟期玉米笋或籽粒中的游离糖和氨基酸含量进行测定，并基于主成分分析与聚类分析结果，对发育阶段和品种间的差异进行比较，以期为鲜食玉米加工尤其是制汁原料选择、风味变化和工艺研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜甜玉米晶甜5号和糯玉米晶糯8号采自江苏省南京市六合区试验基地。晶甜5号采样自授粉后第1天开始，每隔3 d采一次，直至授粉后28 d，记为S-1、S-4…S-28共10 个采收期；晶糯8号由授粉后第3天开始采收至25 d，记为W-3、W-7…W-25共8 个采收期。每次采收鲜穗当日运至实验室，手工分离完整籽粒并用液氮速冻后－20 ℃冻藏，授粉后10 d及更早采收的样品则以玉米笋形式冻藏。
葡萄糖、果糖、蔗糖 上海国药集团化学试剂有限公司；硼酸缓冲液 南京化学试剂公司；邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、溶于0.1 mol/L盐酸的氨基酸混合标准溶液（含24 种氨基酸） 上海Sigma公司；谷氨酰胺（纯度≥99%）、天冬酰胺、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、3-巯基丙酸 上海阿拉丁试剂公司。
1.2 仪器与设备
1200型HPLC仪（配备二级管阵列检测器（photodiode-array-detector，DAD）与示差折光检测器（refraction index detector，RID）） 美国安捷伦科技有限公司；RE52CS真空旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 游离糖的测定
参考文献[16]方法，并略有改动。冷冻玉米笋或籽粒剪刀剪碎后取5.0 g，加入50 mL体积分数80%的乙醇溶液，研钵内匀浆后4 000×g离心10 min，沉淀用15 mL 80%乙醇溶液润洗离心2 次。上清液合并后用80%乙醇溶液定容至100 mL，真空旋转蒸发除去乙醇，用蒸馏水定容至20 mL，10 000×g离心10 min，取上清液待测。色谱条件为：Carbohydrate色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），RID检测器，流动相为乙腈-水（75∶25，V/V），流速1.0 mL/min，检测器温度30 ℃，柱温箱温度30 ℃。3 种糖分别用超纯水配制为0.06～9.0 mg/mL系列质量浓度，并依据质量浓度与峰面积关系绘制标准曲线定量。
1.3.2 游离氨基酸的测定
采用OPA衍生法进行游离氨基酸的测定[10]。取2.0 g剪碎的冷冻玉米粒，加入氯仿-甲醇（30∶70，V/V）溶液10 mL，在液氮下研磨匀浆，用6 mL蒸馏水提取3 次后合并水层，冰上静置30 min。取上清液10 μL加入50 μL硼酸缓冲液（0.4 mol/L pH 10.2）以及10 μL OPA试剂进行衍生，混匀后静置30 s，加入640 μL蒸馏水并混匀，过0.45 μm微孔滤膜，待进样。
HPLC检测条件：采用ZORBAX Eclipse-AAA色谱柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）以及DAD；流动相A为0.04 mol/L pH 7.8的NaH2PO4溶液，B为乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）；设定流速为2 mL/min；洗脱梯度：1.9～18.1 min，100%～43% A、0%～57% B；18.1～18.6 min，43%～0% A、57%～100% B；18.6～22.3 min，0% A、100% B；22.3～23.2 min，0%～100% A、100%～0% B。运行时间26 min；流速2.0 mL/min；样品间色谱柱平衡5 min；柱温40 ℃；检测波长338 nm，参比波长390 nm。
通过与标准样品保留时间的比对进行定性，多点校正法进行定量。采用0.1 mol/L盐酸稀释氨基酸混合标样为0.125～2.5 μmol/mL系列浓度，OPA衍生后进行HPLC测定，依据浓度与对应峰面积绘制标准曲线，计算时转化为质量浓度。谷氨酰胺、天冬酰胺和GABA则直接采用超纯水配制为0.01～0.5 mg/mL的溶液进行衍生与标准曲线绘制。
1.4 数理统计
采用JMP 10.0进行单因素方差分析、主成分分析及聚类分析。P＜0.05，差异显著。
2 结果与分析
2.1 2 种鲜食玉米发育过程中游离糖变化与比较
2 种鲜食玉米中均检测到蔗糖、果糖和葡萄糖，在发育早期（＜授粉后10 d），含量最高的糖为葡萄糖，随后蔗糖含量迅速升高，成为含量最高的糖（图1A1、B1）。晶甜5号游离糖总量最高值出现在授粉后22 d（图1A2），此时蔗糖也达到最高值；晶糯8号游离糖总量最高值出现在授粉后13 d（图1B2），此时期恰处于籽粒发育的初期，蔗糖比例迅速提高（图1B1），但尚未成为含量最高的糖。取2 种玉米总糖和蔗糖最高值进行比较，晶甜5号中游离糖总量为晶糯8号的1.33 倍，但蔗糖（83.96 mg/g）是晶糯8号（30.57 mg/g）的2.88 倍，可以看出晶甜5号中蔗糖的比例高于晶糯8号。Reyes等[4]认为甜玉米甜味的感知更多与蔗糖而不是果糖或葡萄糖相关，这可能与蔗糖在含量上的绝对优势有关。其测定的“Xtra sweet 77”和“Jubilee”2 个甜玉米品种的蔗糖含量分别为葡萄糖和果糖含量之和的2.66 倍和4.78 倍。晶甜5号授粉后13～28 d蔗糖为葡萄糖和果糖含量之和的1.17～12.21 倍，并且随发育期延长此比例呈升高趋势，也表现为蔗糖为主的特点。由计算可知，与晶甜5号不同，晶糯8号在授粉后13 d蔗糖/（果糖+葡萄糖）比值为0.35，随后虽然蔗糖含量最高，授粉后16～25 d比值变化范围仅为1.22～2.59。按照糖类的相对甜度即蔗糖的相对甜度为100，果糖和葡萄糖的相对甜度分别为150与70[17]，可以发现2 种玉米甜度值与总糖含量变化基本一致，晶甜5号总糖达最高值时（授粉后22 d），甜度值也最高，并均显著高于总糖和甜度值达最高值时的晶糯8号（授粉后13 d）。
图1 2 种鲜食玉米发育过程中游离糖含量和甜度变化
Fig. 1 Changes in sweetness and free sugar contents in two table corn cultivars during development
2.2 2 种鲜食玉米发育过程中游离氨基酸变化与分析
18 种氨基酸得以定量分析，包括Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys以及GABA。所有样品中均未检测到Cys，而Pro因方法所限未能测定。
如图2所示，2 个鲜食玉米品种的游离氨基酸总量均在乳熟期达到最高值，晶甜5号为授粉后19 d，略早于游离糖总量达最高值时（授粉后22 d）；晶糯8号则在授粉后16 d达最高值，略晚于游离糖总量达最高值时（授粉后13 d）。
参照蘑菇中氨基酸的呈味特点[8]，将玉米中的氨基酸分为甜味、鲜味、苦味3 类呈味氨基酸，晶甜5号和晶糯8号在发育过程中各类呈味氨基酸的含量变化分别见图2A2、B2。甜味氨基酸在2 个品种中均为含量最高的氨基酸，其在授粉后13～22 d晶甜5号中含量均高于氨基酸总量的50%，而在晶糯8号中，只有在授粉后16 d甜味氨基酸含量高于总量的50%，达到51.30%。鲜味氨基酸在甜玉米中呈波浪状变化，但在晶糯8号中其含量随发育时间延长符合线性上升趋势（r =0.846 08，P＜0.05）。2 种玉米中苦味氨基酸均为含量最低的呈味氨基酸，其最高值的出现时间与甜味氨基酸一致。
图2 2 种鲜食玉米发育过程中游离氨基酸总量及分组氨基酸变化
Fig. 2 Changes in contents of different taste-active amino acid in two table corn cultivars during development
由图3可知，对于单个的呈味氨基酸，Ala作为甜味氨基酸，在2 种鲜食玉米发育过程中含量高且变幅大。从含量分析，Ala在授粉后10～28 d的晶甜5号中为含量最高的氨基酸，占氨基酸总量的28.98%～44.39%；在晶糯8号中，除授粉后22 d和授粉后25 d外，Ala也是含量最高的氨基酸，可达氨基酸总量的22.50%～40.28%。从变幅分析，晶甜5号中Ala含量的最高值为最低值的22.94 倍；在晶糯8号中变幅较小，最高与最低含量的比值为2.68。Ala作为甜味氨基酸，其阈值为60 mg/100 mL[18]，晶甜5号中的最高值可达326.78 mg/100 g，在晶糯8号中最高值为266.05 mg/100 g，均高于阈值，但味觉阈值测定一般为溶液体系测定，由于糖是玉米中主要的甜味物质，Ala是否对鲜食玉米甜味有作用仍待确定。游离Glu作为鲜味氨基酸已得到广泛研究，在成熟的番茄中可高于200 mg/100 g并提供鲜味特征[19]。在晶甜5号和晶糯8号游离糖含量最高的发育阶段，即授粉后22 d（图1A1）和授粉后13 d（图1B1），此时Glu含量分别为62.51 mg/100 g和51.40 mg/100 g，均高于Glu溶液的鲜味阈值30 mg/100 mL[18]，并与Masuda等[9]对甜玉米中游离Glu的测定结果接近。另外Glu在成熟玉米蛋白中常为含量最高的氨基酸，可达总蛋白的20%左右[20]，但在鲜食玉米的发育过程中，晶甜5号和晶糯8号中的游离Glu为总氨基酸的2.57%～21.99%和5.31%～24.49%，只有在授粉后22～25 d的晶糯8号中表现为含量最高的氨基酸。Asp为对鲜味有贡献的另一种氨基酸，其滋味阈值为100 mg/100 mL[18]，在晶甜5号和晶糯8号中，Asp含量分别为12.98～55.57 mg/100 g以及12.53～82.74 mg/100 g，处于较低水平。测定发育期内2 个品种中4 种苦味氨基酸含量均低于20 mg/100 g，均在氨基酸总量达最高值时达到最高值（图3A3、B3）。
晶甜5号与晶糯8号在测定的发育期中必需氨基酸的总量分别占总氨基酸的20.17%～25.31%与19.21%～25.02%（图2），较为接近。Val和Thr在8 种必需氨基酸（His、Thr、Val、Phe、Met、Ile、Leu、Lys）中含量最丰，与对鲜食玉米游离氨基酸组成的报道一致[20]。Lys为玉米的限制性氨基酸[20]，测定的2 个品种均为非Lys强化品种，含量很低。近年来对氨基酸功能性的研究显示补充外源Gln可以有效缓解人的运动疲劳[13]，而GABA则具有神经保护作用[14]。晶甜5号和晶糯8号中Gln及GABA含量均较低，最高值尚不及卷心菜[21]的1/3和樱桃番茄的1/10[7]。游离Asn近年来受到了广泛的关注，主要因为它是致癌物丙烯酰胺的前体物[22]，尤其是在马铃薯中[23]含量较高，可达94 mg/100 g，占氨基酸总量的1/3，在测定的鲜食玉米中游离Asn含量较低，分布范围为1.13～20.46 mg/100 g，仅为氨基酸总量的0.28%～3.80%。
图3 2 种鲜食玉米发育过程中单一氨基酸含量变化
Fig. 3 Changes in contents of individual free amino acids in two table corn cultivars during development
2.3 游离糖与氨基酸变化的多元统计分析
图4 2 种鲜食玉米发育过程中游离糖与氨基酸变化的主成分得分图
Fig. 4 PCA scores plots of free sugars and amino acids in two table corn cultivars during development
将2 个品种鲜食玉米所有采收期的游离糖和氨基酸含量数据进行主成分分析，前3 个主成分分别提取了总变异的39.9%、24.4%和13.3%。如图4所示，在PC1上，W-16和S-19的得分最高，其次为S-13与S-16，说明这4 个样品总游离氨基酸含量偏高，与2.2节结论一致；其他样品中发育早期的样品（≤授粉后13 d）和乳熟期样品在PC2上的得分则按正负分别聚集。另外，在PC3上得分为正值的7 个样品中有6 个为糯玉米样品（授粉后10～25 d），而甜玉米样品则除S-13外，得分全部为负值，说明PC3更多体现了2 种玉米之间的差别。从表1可知，在PC1上载荷大于0.7的指标有Thr，其次有Leu、Ser、Gly、Ala、Val、Ile、Met和His，包括了4 种甜味氨基酸和3/4的苦味氨基酸；在PC2上载荷绝对值高于0.7的指标有Gln、葡萄糖、果糖、蔗糖；在PC3上载荷值排名前二的2 个指标分别为Asp和Glu这2 种鲜味氨基酸，并且均为正值。综合样品主成分得分与各指标在主成分上的载荷分析，发育程度不同是样品间的主要差异，并主要体现为甜味氨基酸和糖含量变化；其次才是玉米品种间的差异，并主要体现在鲜味氨基酸上。
表1 游离糖与氨基酸的主成分载荷
Table 1 PCA loadings of free sugars and amino acids
主成分 PC1 PC2 PC3 Asp 0.475 －0.160 0.734 Glu 0.355 －0.492 0.674 Asn 0.379 0.779 0.115 Ser 0.852 0.114 －0.363 Gln 0.066 0.855 －0.121 His 0.774 0.193 0.044 Gly 0.827 －0.249 －0.390 Thr 0.912 －0.043 0.120 Arg 0.676 0.315 0.158 Ala 0.830 －0.202 －0.044 GABA 0.453 0.672 －0.264 Tyr 0.606 －0.050 －0.566 Val 0.829 0.368 0.106 Met 0.819 －0.142 －0.190 Phe 0.434 －0.607 －0.541 Ile 0.854 －0.074 0.361 Leu 0.814 0.089 0.032 Lys 0.556 －0.440 0.608果糖 0.021 0.885 －0.006葡萄糖 0.079 0.864 0.068蔗糖 0.264 －0.749 －0.451
样品的聚类分析结果见图5。在距离6.06处所有样品聚为3 类：I为S-1、S-7、W-7、S-10、W-10、S-4、W-13、W-4、S-13、S-16；II为S-22、S-25、S-28、W-19、W-22、W-25；III为W-16与S-19。从样品采收时的授粉后时间可以看出，第I类为发育早期的样品，即早于授粉后13 d的糯玉米和早于授粉后16 d的甜玉米，第II类则与推荐的鲜食适采期基本吻合，为授粉后22～28 d的甜玉米和授粉后16～25 d的糯玉米，第III类则是2 个品种发育过程中游离氨基 酸含量均达最高之时。这个分类结果与样品在PC1和PC2得分图（图4）上的分布一致。
图5 不同发育阶段2 种鲜食玉米聚类分析的树状图
Fig. 5 Cluster analysis of two table corn cultivars at different developmental stages
3 讨 论
目前，鲜食玉米的适宜采收期多以水分或可溶性糖含量确定[3-5]。陈骁熠等[5]根据水分含量确定Hz5008超甜玉米的适采期为授粉后18 d，Hz6012普甜玉米为授粉后16 d，但同时发现2 种玉米总糖出现最高值的时期则分别为授粉后19 d和授粉后18 d，与依据水分含量推荐的适采期略有偏差。Azanza等[6]发现授粉后18 d采收时超甜玉米的籽粒饱满度不够，但授粉后18～22 d期间，糖含量呈现下降趋势，因此为得到适宜鲜食的籽粒饱满度，无法选择糖含量最高的采收期。刘萍等[3]认为授粉后23～25 d是鲜食糯玉米的最佳鲜食期，而在授粉后17～29 d期间，所有品种的含水量均呈下降趋势。综上所述，若以鲜食为目的，无论甜玉米还是糯玉米，选择的适宜成熟度都可能与水分及糖含量最高时期有一定偏差。本研究发现，晶甜5号超甜玉米中总糖与总氨基酸最高值分别出现在授粉后22 d与授粉后19 d，与报道中鲜食适采期[3-5]一致，但晶糯8号二者最高值分别出现在授粉后13 d与授粉后16 d，较刘萍等[3]报道的鲜食适采期偏早。考虑若以制汁为目的，水溶性风味成分含量为最重要的指标，与鲜食适采期可能并不完全一致。
可溶性糖作为鲜食玉米最重要的风味成分，在不同胚乳类型的玉米在发育过程中碳水化合物具有不同的变化规律[24]。晶甜5号为超甜玉米品种[25]，超甜突变体中丧失了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，淀粉的合成能力低[26]，导致可溶性糖尤其是蔗糖的大量积累，并且较高蔗糖含量的维持时间长，适宜的果穗采收时间也相对较长。晶糯8号中3 种游离糖的组成比例与晶甜5号不同，蔗糖比例偏低，蔗糖/（葡萄糖+果糖）最高值仅为2.59，而晶甜5号此值可达12.21。除此外，晶糯8号游离糖其最高值出现在灌浆初期（授粉后13 d），然后显著下降，这可能与此发育阶段糯玉米中游离糖向淀粉的快速转化有关[24]。
另据研究，玉米游离氨基酸含量及其组分依赖于不同的遗传背景，并由少数基因所控制[27]，其遗传多样性已在中国糯玉米育种领域得到了重视[28]。晶甜5号甜玉米授粉后19～25 d时鲜味和甜味2 类氨基酸分别占总氨基酸的17.34%～19.50%和58.26%～60.44%，与Masuda等[9]相比，鲜味氨基酸占比偏高，而甜味氨基酸占比偏低。参照孟强等[28]测定的糯玉米自交系中呈味氨基酸在总氨基酸的比例范围（鲜味氨基酸5.97%～47.36%；甜味氨基酸4.85%～30.72%），晶糯8号在授粉后16～25 d鲜味和甜味2 类氨基酸分别占总氨基酸的29.19%～49.66%和32.61%～46.80%，属于呈味氨基酸比例偏高的品种。本研究还发现Glu和Asp含量变化也是2 个品种的重要差异，Asp是连接氨基酸代谢和糖代谢的纽带[29]，Glu则与玉米的氮素利用即蛋白的合成密切相关[30]。2 个鲜食玉米品种间的差异主要体现在Asp与Glu 2 种氨基酸上，说明除碳水化合物代谢是甜玉米和糯玉米的主要区别外，氮素的利用与代谢也有所不同。鲜食玉米不同品种和类型在呈味氨基酸组成上存在一定差异，而具体如何影响鲜食玉米加工产品风味仍待深入研究。从营养角度分析游离氨基酸，则可发现测定的2 个品种中限制性必需氨基酸Lys[20]以及近年来广受关注的功能氨基酸Gln[13]、GABA[14]和可作为有害成分丙烯酰胺前体物的Asn[11]含量均偏低，不足以引起重视。另外，这几种氨基酸在前3 个主成分上载荷最高的只有Asn与Gln，而这2 种氨基酸在高等植物氨同化途径中与鲜味氨基酸Asp和Glu可相互转化[30]。综上推测，鲜食玉米中氨基酸的呈味作用更值得关注。
4 结 论
晶甜5号超甜玉米和晶糯8号糯玉米中在发育过程中游离糖和游离氨基酸含量变化存在一定差异：1）晶甜5号游离糖含量和游离氨基酸的最高值分别出现在授粉后22 d与授粉后19 d，晶糯8号达最高值时发育时间较短，分别出现于授粉后13 d与授粉后16 d；2）晶糯8号中鲜味氨基酸在发育过程中呈线性上升趋势，并成为区别于晶甜5号的重要特征。综上所述，游离糖和游离氨基酸在鲜食玉米制汁适宜采收期的确定以及对不同鲜食玉米风味的差异分析上均具有重要的参考价值，对于鲜食玉米加工尤其是玉米汁生产中风味调控有实际意义。
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