响应面法优化果胶酶澄清芡实酒工艺及其效果评价

刘 静，胡彦营，李湘利，冯 磊，刘开伟，孙宁富

(济宁学院生命科学与工程系，山东 曲阜 273155)

摘 要：为优化果胶酶澄清芡实酒的最佳工艺，在单因素试验基础上，选取加酶量、酶解pH值、酶解温度和酶解时间为自变量，以芡实酒澄清度为响应值，采用Box-Behnken试验和响应面分析法，研究自变量交互作用对芡实酒澄清效果的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。结果表明：所得回归模型能很好地反映各因素水平与响应值之间的关系，所得果胶酶澄清芡实酒的最佳工艺条件为加酶量0.13g/L、酶解pH3.57、酶解温度38℃、酶解时间41h，此条件澄清后的芡实酒透光率可达95.5%，果胶含量显著降低，其他理化指标变化不大，非生物稳定性明显提高。

关键词：芡实酒；果胶酶；澄清；响应面法

Optimization and Effectiveness Evaluation of Pectinase Treatment for Decolorization of Semen Euryales Wine

LIU Jing，HU Yan-ying，LI Xiang-li，FENG Lei，LIU Kai-wei，SUN Ning-fu

(Department of Life Science and Engineering, Jining University, Qufu 273155, China)

Abstract：Response surface methodology was used to optimize the decolorization process of Semen Euryales wine by pectinase treatment. The clarity of Semen Euryales wine was investigated with respect to four variables including enzyme dosage, pH, temperature and hydrolysis time by using a Box-Behnken design. As a result, a quadratic polynomial regression equation was built. The equation could well describe the relationship between the dependent and independent variables. The optimal experimental conditions for decolorizing Semen Euryales wine were determined as hydrolysis with an enzyme dosage of 0.13 g/L at 38 ℃ for 41 h at initial pH 3.57. The clarity of samples under the optimized conditions was 95.5%. In addition, the pectin content was reduced significantly, other physiochemical properties showed minor changes and non-biostability was evidently improved.

Key words：Semen Euryales wine；pectinase；clarification；response surface methodology

中图分类号：TS262.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0087-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322017

芡实(Euryale ferox)又名鸡头米，为睡莲科(Nymphaeaceae)芡实属植物芡(Euryale ferox Salisb)的成熟种仁[1]，其碳水化合物含量高达82.6%，还含有蛋白质、矿物质等营养成分及VC、VE、β-胡萝卜素、黄酮、糖苷、生育酚等功效成分[2-3]。以芡实为原料经糊化糖化和人工接种酵母菌进行低温发酵生产的芡实酒是一种新型的果酒，具有较好的保健功效[4]。然而，芡实酒中含有一定的果胶及蛋白质等大分子物质，形成了稳定性很强的混浊酒体，黏度较大，严重影响了芡实酒的感官质量和品质。

果胶酶是一类能分解果胶质的多种酶的总称，主要用于提高原料出汁率和果汁果酒的澄清[5-6]。果胶酶可降低酒体黏度，使果酒中的悬浮物因失去保护胶体而沉降下来，增强了澄清效果[7]。为此，本实验以芡实原酒为实验材料，研究了果胶酶澄清芡实酒的工艺，通过响应面法对其进行优化，并对澄清效果进行评价，以期提高芡实酒的澄清度和食用品质，为芡实酒的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芡实原酒，以芡实、大米、麦芽为原料，经糊化、糖化、发酵等工序酿制而成[4]。

果胶酶(酶活性＞32000U/g) 天津利华酶制剂有限公司；白砂糖为食品级；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

果蔬汁(酒)生产线 江苏靖江食品机械有限公司；酒精计 河北省河间市黎民居仪表厂；PHS-3CW酸度计 上海般特仪器有限公司；FA-2004N分析天平 上海精密仪器有限公司；723PC分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；TGL16台式冷冻离心机 长沙英泰仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芡实酒的生产工艺流程

大米→磨碎 耐高温α-淀粉酶

↓ ↓

芡实→磨浆→配料→糊化→糖化→糖酸调整→煮沸→冷却→主发酵→后发酵→陈酿→澄清→调配→杀菌→成品

↑ ↑ ↑

麦芽→粉碎 糖化酶与麦芽粉 活化←安琪葡萄酒、果酒专用酵母

1.3.2 芡实酒澄清度与色度测定波长的选择

以蒸馏水为对照，采用分光光度法，从波长320nm处开始，每隔20nm测定1次吸光度和透光率[8]，绘制芡实酒在可见光区的吸收曲线，以确定芡实酒的色度与澄清度测定波长。

1.3.3 单因素试验

澄清单因素试验加酶量为0～0.32g/L、酶解pH3.0～5.5、酶解温度20～50℃、酶解时间24～48h。每次取100mL原酒于150mL三角瓶中进行酶解澄清，加入果胶酶后搅拌均匀，每隔20min搅拌1次，持续1h后静置澄清。澄清结束后，3500r/min离心5min[9]，取上清液测定酒体吸光度与透光率。各处理重复3次。

1.3.4 响应面试验设计

结合单因素试验结果，以加酶量、酶解pH值、酶解温度和酶解时间为影响因素，芡实酒澄清度为响应值，采用Box-Behnken试验和响应面分析法，通过Design-Expert 8.0研究交互作用及其对芡实酒澄清效果的影响。

1.3.5 果胶酶澄清芡实酒的效果评价

以优化所得最佳条件澄清芡实酒，以原酒为对照，评价果胶酶处理对芡实酒酒精度、总酸、总糖、蛋白质、果胶等理化指标的影响，并对其非生物稳定性和色泽、风味进行评价，以分析果胶酶对芡实酒澄清效果的影响。

1.3.5.1 澄清度与色度的测定

澄清度：用723PC分光光度计，在所选波长处用1cm比色杯测定透光率(T，%)，蒸馏水作空白；色度：用723PC分光光度计，在所选波长处用1cm比色杯测定吸光度(A)，蒸馏水作空白。

1.3.5.2 理化指标的测定

酒精度：采用酒精计法[10]；总糖含量：采用斐林试剂滴定法，以葡萄糖计[10]；总酸含量：采用电位滴定法，以柠檬酸计[10]；甲醇含量：采用比色法[10]；蛋白质含量：采用考马斯亮蓝G-250法[11]；果胶含量：采用咔唑法[12]。

1.3.5.3 非生物稳定性[13]

蛋白质稳定性实验：取200mL烧杯，装满澄清酒液，加入2mL 10g/100mL的单宁液，在80℃条件水浴中加热20min，若冷却后出现絮凝沉淀，则为蛋白质不稳定；酒石酸氢钾稳定性实验：取澄清酒液100mL在－5℃条件下处理14d，若有酒石结晶析出，则为酒石不稳定；铁稳定性实验：澄清酒液暴露于空气中7d，若有沉淀生成，则为铁破败；铜稳定性实验：取三角瓶装满澄清酒液，用软木塞封口，让瓶子平放，并接受阳光照射，放置1周，若出现混浊，则为铜破败；氧化稳定性实验：取澄清酒液100mL在空气中放置24h，若出现混浊和过氧化物，则为氧化性不稳定。

2 结果与分析

2.1 芡实酒澄清度与色度测定波长的确定

图 1 澄清芡实酒的波长与吸光度的关系曲线

Fig.1 Relationship between the wavelength and absorbance of
Semen Euryales wine

由图1可知，在320～740nm的波长范围内澄清芡实酒无明显的吸收峰。为反映芡实酒可见的颜色变化，本实验选择420nm波长处作为芡实酒色度的测定波长。在700nm波长处，芡实酒自身的吸光度不大于0.02，此时所测得的澄清度背景吸收较小，相对误差小[8,14]，故选择700nm作为澄清度的测定波长。

2.2 果胶酶澄清芡实酒的单因素试验

2.2.1 加酶量对芡实酒澄清效果的影响

图 2 加酶量对芡实酒透光率和吸光度的影响

Fig.2 Effect of enzyme dosage on light transmittance and
absorbance of Semen Euryales wine

分别添加0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32g/L的果胶酶，在pH3.5和35℃条件下酶解48h。由图2可知，随加酶量的增加，芡实酒透光率从75.6%提高到90.3%，吸光度则由原酒的0.935下降到0.311；加酶量超过0.12g/L时，酒体透光率和吸光度变化不明显。这是因为未加果胶酶时，果胶等大分子物质未被彻底降解而产生较多的混浊物，从而影响了酒体外观；随着加酶量的提高，果胶等被大量降解，酒体透光率和吸光度均较为理想[15]。考虑到成本等因素，选取加酶量0.12g/L左右较为适宜。

2.2.2 酶解pH值对芡实酒澄清效果的影响

图 3 酶解pH值对芡实酒透光率和吸光度的影响

Fig.3 Effect of enzymolysis pH on light transmittance and
absorbance of Semen Euryales wine

分别调整酒液pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，固定加酶量0.12g/L，在35℃条件下酶解48h。由图3可知，在pH3.5时，酒体透光率最大，可达90.2%，吸光度最低，为0.312；pH值大于4.0时，澄清效果明显变差，这与果胶酶催化反应的pH值有关，另外pH值变化较大会改变酒体电解质环境，致使蛋白质等物质的稳定性降低而引起酒体混浊[16]。

2.2.3 酶解温度对芡实酒澄清效果的影响

图 4 酶解温度对芡实酒透光率和吸光度的影响

Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on light transmittance and absorbance of Semen Euryales wine

固定加酶量0.12g/L，调整酒液pH3.5，分别在20、25、30、35、40、45、50℃条件下酶解48h。由图4可知，当酶解温度20～25℃时，芡实酒透光率仅82.6%～84.7%，吸光度0.606～0.542，此时酒体依然混浊，酶解效果较差；酶解温度在30～40℃时，透光率最高可达90.4%，吸光度0.308；酶解温度超过45℃时，澄清效果变差，这与果胶酶在高温条件下的部分失活及酒体非生物稳定性下降等因素有关[17]。

2.2.4 酶解时间对芡实酒澄清效果的影响

图 5 酶解时间对芡实酒透光率和吸光度的影响

Fig.5 Effect of enzymolysis time on light transmittance and
absorbance of Semen Euryales wine

固定加酶量为0.12g/L，调整酒液pH3.5，于35℃条件下分别酶解24、28、32、36、40、44、48h。由图5可知，随着酶解时间的延长，芡实酒透光率不断提高，在酶解40h时，透光率可达91.3%，此时吸光度最低，为0.255；超过40h时，澄清效果变化不大，且随着酶解时间的延长，会增加污染杂菌的风险。

2.3 响应面法优化果胶酶澄清芡实酒工艺

2.3.1 模型的建立与显著性分析

根据Box-Behnken试验设计原理，综合单因素试验结果，选取加酶量、酶解pH值、酶解温度和酶解时间4个因素，分别在3个水平上进行果胶酶澄清试验，共有29个试验点。轴向点代表各独立变量的极值水平，中心点代表中心水平，重复5次以估计试验误差。响应面分析因素和水平见表1，试验方案及结果见表2。

采用Design-Expert 8.0软件对试验结果进行多元回归拟合，得到以澄清度为目标函数的二次回归方程：

Y=93.68＋2.28X1＋1.43X2＋3.73X3＋2.95X4－0.47X1X2－0.70X1X3＋1.05X1X4－0.62X2X3＋0.10X2X4＋0.30X3X4－3.51X12－3.42X22－2.94X32－5.82X42

方程中加酶量(X1)、酶解pH值(X2)、酶解温度(X3)和酶解时间(X4)在设计中均经量纲线性编码处理，各项系数绝对值的大小可直接反映各因素对澄清度的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。由回归方程可知，各因素的线性项、二次项以及加酶量和酶解时间交互项对澄清度影响较大。

表 1 响应面分析法的因素与水平表

Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

表 2 响应面分析试验方案及结果

Table 2 The experimental design and results for response surface analysis

表 3 响应面二次回归方程方差分析

Table 3 Analysis of variance for the fitted response surface quadratic regression equation

注：**.差异极显著(P＜0.01)；*.差异显著(P＜0.05)。

为检验方程的有效性，对酶法澄清芡实酒的数学模型进行了方差分析，并对各因素的偏回归系数进行检验。由表3可知，影响芡实酒澄清的各因素大小顺序依次为X3＞X4＞X1＞X2；线性项(X1、X2、X3、X4)和二次项(X12、X22、X32、X42)对结果影响极显著(P＜0.01)，交互项中仅X1X4对结果影响显著(P＜0.05)，其他交互项(X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4)对结果影响不显著(P＞0.05)；失拟项不显著(P＞0.05)；模型极显著(P＜0.01)，模型的确定系数R2=0.98，模型调整确定系数R2Adj=0.96，表明模型拟合度较好，能够反映澄清度与加酶量(X1)、酶解pH值(X2)、酶解温度(X3)和酶解时间(X4)的关系。因此，所得回归方程能较好地预测芡实酒澄清度随各因素的变化规律。

2.3.2 响应面分析与优化

图 6 加酶量与酶解时间交互影响澄清度的响应面和等高线

Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effect of enzyme dosage and enzymolysis time on the clarity of Semen Euryales wine

利用Design-Expert 8.0软件得到二次回归方程的响应曲面及等高线。由图6可知，在加酶量保持不变时，澄清度随酶解时间的延长，呈现先升高后降低的变化趋势；酶解时间一定时，澄清度随加酶量的增加也呈现先增加后下降的趋势；等高线呈椭圆形，说明加酶量与酶解时间的交互作用明显。

2.3.3 最佳澄清条件的确定和验证

在所选试验因素范围内，利用Design-Expert 8.0软件对响应面立体图分析，得出果胶酶澄清芡实酒的最佳酶解条件为加酶量0.13g/L、pH3.57、酶解温度37.99℃、酶解时间41.19h，模型预测澄清度为95.673%。考虑到实际操作的便利，选取最佳澄清条件为加酶量0.13g/L、pH3.57、酶解温度38℃、酶解时间41h。在此优化的条件下，进行3次平行验证实验，澄清后的芡实酒澄清度可达95.5%，与预测值非常接近，这表明该模型能较好的预测芡实酒的澄清度。

2.4 果胶酶澄清芡实酒的效果评价

2.4.1 果胶酶澄清对芡实酒理化指标的影响

表 4 果胶酶澄清对芡实酒理化指标的影响

Table 4 Effect of enzymatic decolorization on physicochemical properties of Semen Euryales wine

由表4可知，原酒经果胶酶澄清处理后，酒精度、总糖、总酸、蛋白质的含量无明显的变化，果胶含量有明显减少，甲醇含量略有升高，这与李艳松等[18]的研究结果一致，但甲醇含量远低于红葡萄酒国家标准400mg/L[19]。这说明用果胶酶进行芡实酒的澄清是可行的。

2.4.2 果胶酶澄清对芡实酒稳定性的影响

表 5 果胶酶澄清对芡实酒稳定性的影响

Table 5 Effect of enzymatic decolorization on the stability of
Semen Euryales wine

注：＋.不稳定；－.稳定。

由表5可知，经果胶酶澄清处理的芡实酒稳定性明显提高，产品呈金黄色，清亮透明，口感较好。这是因为果胶酶破坏了胶状物质而产生大量的微小絮凝物，该絮凝物具有大的表面积和极强的吸附能力[20]，可将已发生褐变的多酚类物质及蛋白质吸附并沉淀下来[21]。芡实酒酒石酸氢钾呈现稳定是因为原酒的酒石酸含量较低。

3 结 论

果胶酶澄清芡实酒的最佳工艺条件为加酶量0.13g/L、酶解pH3.57、酶解温度38℃、酶解时间41h，澄清后的芡实酒透光率可达95.5%。经果胶酶澄清的芡实酒果胶含量显著降低，其他理化指标变化不大，非生物稳定性明显提高，所得芡实酒清亮透明，色泽为金黄色，口感协调。

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