海藻酸钠与结冷胶协同固定葡萄糖氧化酶的特性研究

余 君1，徐淑霞1，高玉千1，张庭静2，张世敏1，吴 坤1,*

(1.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002；2.河南农业职业学院，河南 郑州 451450)

摘 要：利用海藻酸钠与结冷胶协同固定葡萄糖氧化酶，研究固定化条件及固定化酶的性质，并与海藻酸钠单独固定葡萄糖氧化酶的特性进行比较。结果表明：在海藻酸钠质量浓度20g/L，其与结冷胶体积比4:1，氯化钙质量浓度60g/L，加酶量4%，固定化时间0.5h的条件下，协同固定化酶活回收率为75.76%，而海藻酸钠单独固定葡萄糖氧化酶活回收率仅为65.82%。与游离酶相比，协同固定化酶的最适反应温度保持不变为35℃，最适pH值由5.5升至6.0。另外，协同固定化的葡萄糖氧化酶具有良好的热稳定性和贮藏稳定性，重复使用率较高。

关键词：葡萄糖氧化酶；固定化酶；海藻酸钠；结冷胶；凝胶颗粒

Immobilization of Glucose Oxidase into Sodium Alginate and Gellan Gum Mixture

YU Jun1，XU Shu-xia1，GAO Yu-qian1，ZHANG Ting-jing2，ZHANG Shi-min1，WU Kun1,*

(1. College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China；

2. Henan Vocational College of Agriculture, Zhengzhou 451450, China)

Abstract：Compared with the characteristics of immobilized glucose oxidase using sodium alginate as the carrier, the conditions of immobilized glucose oxidase using sodium alginate and gellan gum as the carriers and the characteristics of the immobilized enzyme were studied. The results showed that the recovery of immobilized enzyme after 0.5 h immobilization was 75.76%. Under the optimum operating conditions of 20 g/L, 60 g/L, 4% and 4:1 for sodium alginate concentration, CaCl2 concentration, glucose oxidase and sodium alginate-to-gellan gum ratio, respectively, the recovery of immobilized glucose oxidase using common sodium alginate as the carrier was 65.82%. Compared with the free enzyme, the optimum temperature of immobilized enzyme was 35 ℃, and the optimum pH increased from 5.5 to 6.0. In addition, the immobilized enzyme with sodium alginate and gellan gum together as the carriers had better thermal stability, storage stability, and reusability.

Key words：glucose oxidase；immobilized enzyme；sodium alginate；gellan gum；gel particle

中图分类号：Q814.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0278-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321056

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一种需氧脱氢酶，能利用空气中的氧气催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，具有去葡萄糖、脱氧、杀菌、测血糖含量等作用，还可以代替金属催化剂生产葡萄糖酸盐，被广泛地应用于食品领域[1]。但在实际应用中，因对环境敏感、反应后不易回收、成本较高等缺点导致酶制剂难以开发和使用。固定化葡萄糖氧化酶克服了游离酶的这些缺点，呈现出分离回收容易、贮藏稳定性高、可多次重复使用、操作连续、工艺简便、成本较低等一系列优点[2]。目前，寻找合适的固定化方法和设计性能优良的载体，进一步提高转化率和生产能力是酶固定化研究的热点[3]。

海藻酸钠(sodium alginate)是一种亲水性胶态多聚糖，具有较好的生物降解性和生物相容性，稳定无毒，是最常用的固定化酶的载体[4-5]，但海藻酸钠凝胶颗粒的机械强度较弱。结冷胶(gellan gum)是一种微生物多糖，凝胶性能优良[6]，热稳定性好，机械强度大，但凝固温度较高。添加结冷胶于海藻酸钙凝胶中，既克服了凝固温度高的缺点，又增强了凝胶的稳定性[7]。近来的固定化研究中很少有关于结冷胶作为固定化载体的报道。本实验采用海藻酸钠、结冷胶协同固定葡萄糖氧化酶，得到最佳的固定化条件并对固定化酶的特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

葡萄糖氧化酶(1500U) 无锡杰能科生物工程有限公司；海藻酸钠 汕头西陇化工厂；结冷胶 美国Kelco公司；CaCl2 天津科密欧化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

HH-4数显恒温水浴锅 金坛华峰仪器有限公司；HZQ-QX全温振荡器 哈尔滨东联电子技术开发有限公司；PHSJ-3F型pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 固定化GOD凝胶颗粒的制备

配制一定质量浓度的海藻酸钠溶液和海藻酸钠与结冷胶的混合溶液，在沸水浴中搅拌溶解，冷却至室温后，加入GOD，混合均匀。用注射器分别吸取上述溶液[8]，以10cm左右的高度逐滴滴入到CaCl2溶液中，控制约5滴/s，形成凝胶珠，静置使其进一步硬化。过滤、洗涤凝胶珠，除去表面的CaCl2溶液。用吸水纸吸干表面水分，贮藏于4℃冰箱中。

1.2.2 GOD酶活力的测定

游离酶活力测定采用滴定法[9]；固定化酶活力测定参照游离酶活力测定方法。酶活力为3次平行实验取平均值。以每批次实验中测得的酶活力最高值为100%，计算相对酶活力。

1.2.3 固定化GOD酶活回收率的测定

测定游离酶和固定化酶在最适作用条件(温度、pH值)下的酶活力，按照下式计算固定化酶的酶活回收率[10]。

1.2.4 固定化条件单因素试验

1.2.4.1 海藻酸钠质量浓度的确定

配制质量浓度为5、10、20、30、40g/L的海藻酸钠溶液30mL，加入1mL酶液混合均匀，制成海藻酸钠凝胶珠。测定溶液黏度、胶粒下沉时间、胶粒中气泡量、圆整度、机械强度[11]和固定化酶活力。

1.2.4.2 海藻酸钠与结冷胶配比的确定

取质量浓度为20g/L的海藻酸钠溶液30mL，加入不同体积比1:1～6:1的结冷胶与1mL酶液混合均匀，制成凝胶珠，测定固定化酶活力。

1.2.4.3 氯化钙质量浓度的确定

将海藻酸钠与结冷胶的混合溶液用注射器分别滴入到质量浓度为30、40、50、60、70g/L的CaCl2溶液中，做成凝胶颗粒。测定固定化颗粒的下沉时间、气泡量、机械强度和固定化酶活力。

1.2.4.4 加酶量的确定

在海藻酸钠与结冷胶的混合溶液中，分别加入从2%～10%不同体积分数的酶液，制成凝胶颗粒。测定固定化酶的酶活力和酶活回收率。

1.2.4.5 固定化时间的确定

将固定化凝胶珠静置在CaCl2溶液中0.5～2.5h后，测定固定化酶活力。

1.2.5 固定化条件正交试验

根据单因素试验结果设计五因素四水平的正交试验，选择固定化葡萄糖氧化酶酶活回收率为评价指标，从而对固定化条件进行优化。

1.2.6 固定化GOD的最适反应温度和pH值的确定

取一定量的固定化酶颗粒，恒温摇床振荡并控制在不同温度下，测定酶活力。另配制一系列不同pH值的0.06mol/L的磷酸缓冲液，并加入20g/L的葡萄糖，测定酶活力。

1.2.7 GOD的热稳定性实验

将固定化酶颗粒及游离酶放置于不同温度梯度的恒温水浴锅中1h，冷却至室温，测定酶活力[12]。

1.2.8 GOD的贮藏稳定性实验

将固定化酶及游离酶贮存于4℃冰箱中1个月，每5d测定一次酶活力[13]。

1.2.9 固定化GOD的使用稳定性实验

取一定量的固定化酶，测定酶活力。分离出凝胶颗粒，用去离子水反复洗涤抽干，再次测定酶活力，重复操作，记录每次的酶活力变化，考察固定化酶的连续操作稳定性。

2 结果与分析

2.1 固定化条件对酶活力的影响

2.1.1 海藻酸钠质量浓度的影响

表 1 海藻酸钠质量浓度对凝胶颗粒的影响

Table 1 Effect of sodium alginate concentration on the formation of gel beads

注：CaCl2质量浓度保持40g/L，温度35℃。

以不同质量浓度的海藻酸钠为载体，测定海藻酸钠质量浓度对固定化效果的影响。王立娜[14]、郭燕 [15]、汤鸣强[16]等曾研究过，海藻酸钠不仅影响到固定化酶活力，还影响到溶液黏度、胶粒的机械强度和圆整度，而表1的溶液黏度和机械强度等表观现象正好也验证了这一点。当海藻酸钠质量浓度为5g/L时，胶粒脆弱，拖尾现象明显，酶易脱落，固定化作用较差，不利于固定化酶的重复使用。当海藻酸钠质量浓度为40g/L
时，溶液黏度较高，在相同推压孔径下，推压越来越难，固定时不易成球，且酶活力较低。因此选择海藻酸钠质量浓度范围为20～30g/L，通过添加结冷胶来增强固定化载体的机械强度和酶活力。

a

b

a. 质量浓度为20g/L海藻酸钠凝胶颗粒；

b. 海藻酸钠与结冷胶体积比4:1的固定化颗粒。

图 1 固定化凝胶珠的形态

Fig.1 Pictures of immobilized gel beads

由图1a可知，质量浓度为20g/L的海藻酸钠凝胶珠形态基本上呈圆形，圆形微球的四周颜色较浅，中间空心适中，说明海藻酸钠可以作为固定化酶制备的载体，且GOD被很好地包埋在载体中。在粒径分布上，凝胶微球平均粒径均在2～3mm。

2.1.2 海藻酸钠与结冷胶配比的影响

海藻酸钠存在机械强度较差的缺点，有关文献[17]报道可以通过一定的添加剂来增加机械强度。图1b为海藻酸钠和结冷胶协同固定化颗粒的形态，与图1a比较可以看出，协同固定的凝胶微球更加圆润。另外，张慧旻[18]与苏德福[7]等曾研究过可以通过添加结冷胶改善凝胶的机械强度。保持海藻酸钠质量浓度为20g/L，随海藻酸钠与结冷胶配比的增大，溶液黏度变小，胶粒较脆弱，容易破壁，酶易外泄，正如图2所示，酶活力呈先上升后下降的趋势，在体积比4:1时相对酶活力达到最大。

图 2 海藻酸钠与结冷胶体积比对固定化酶酶活力的影响

Fig.2 Effect of sodium alginate-to-gellan gum ratio on the activity of immobilized glucose oxidase

2.1.3 CaCl2质量浓度的影响

CaCl2溶液质量浓度对形成凝胶的机械强度有较大的影响[19-20]。海藻酸钠与Ca2+形成海藻酸钙凝胶，当Ca2+质量浓度过大时，凝胶表面布满Ca2+，Ca2+与酶作用会降低酶活；Ca2+质量浓度过小，会影响凝胶的机械强度，导致酶外泄。如表2所示，随CaCl2溶液质量浓度的增大，胶粒的下沉时间变长，机械强度变大，相对酶活力先增大后变小，最适的CaCl2溶液质量浓度为50g/L。

表 2 CaCl2质量浓度对凝胶颗粒的影响

Table 2 Effect of CaCl2 concentration on the formation of gel beads

注：海藻酸钠质量浓度保持20g/L，海藻酸钠与结冷胶体积比4:1，温度35℃。

2.1.4 加酶量的影响

图 3 加酶量对固定化酶活力的影响

Fig.3 Effect of enzyme concentration on the activity of immobilized glucose oxidase

加酶量直接关系到固定化酶的活力。由图3可知，随着加酶量的增加，固定化酶的活力也增加；但当加酶量达4%之后，酶活力逐步下降。随加酶量的增加，酶活回收率下降，加酶量越高，其损失也越大。这是因为，凝胶与酶分子接触的位点是有限的，在接触位点未被饱和之前，固定化酶活力随加酶量的增加而增大；接触位点被饱和之后，过多的酶因无法固定到载体上而处于游离态被损失掉，故增加加酶量使酶活力下降。因此加酶量的确定要从固定化酶活力和酶活回收率两方面考虑[21]。由图3可知，海藻酸钠与结冷胶协同固定GOD的最适加酶量为4%，酶活回收率在80%左右。

2.1.5 固定化时间的影响

固定化时间是指载体材料与酶的混合液滴落至CaCl2后静置反应的时间。由图4可知，随固定化时间的增加，固定化酶活力呈先升高后下降的趋势。这是因为，海藻酸钠与CaCl2反应形成凝胶是需要时间的。固定初期，包埋逐渐紧密，流失减少，固定化酶活力呈升高趋势；一定时间后固定化酶活力达到最大，随时间延长会使Ca2＋与酶作用，影响活力，并且凝胶过于紧密，影响酶与底物的结合。故选择最适的固定化时间为1h。

图 4 固定化时间对固定化酶活力的影响

Fig.4 Effect of immobilization time on the activity of immobilized glucose oxidase

2.1.6 固定化条件正交试验结果

在单因素的试验基础上，以海藻酸钠质量浓度、海藻酸钠与结冷胶配比、氯化钙质量浓度、加酶量和固定化时间进行了五因素四水平的正交试验以确定最佳的固定化条件。各因素水平安排及试验方案结果见表3。

表 3 正交试验因素水平设计及结果

Table 3 Five-variable/four-level orthogonal array design and results

根据正交试验的结果可以确定最优的固定化条件为：海藻酸钠质量浓度20g/L、海藻酸钠与结冷胶配比4:1、氯化钙质量浓度60g/L、加酶量4%、固定化时间0.5h。此外，由极差分析表明，各因素对葡萄糖氧化酶活力回收率的影响强度为：海藻酸钠质量浓度＞固定化时间＞加酶量＞海藻酸钠与结冷胶配比＞氯化钙质量浓度，原因可能是海藻酸钠质量浓度和固定化时间与固定化酶的机械强度有关，机械强度越大，游离酶能更好地固定在载体中，酶活回收率就越大。

2.2 固定化GOD的性质

2.2.1 温度和pH值对酶活力的影响

图 5 温度对固定化酶活力的影响

Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity

分别取一定量的游离酶和固定化酶，于不同温度条件下测定酶活力并计算相对酶活力。图5表明，游离酶的最适反应温度是35℃，协同固定化酶为35℃。与海藻酸钠单独固定GOD相比，酶活力在低温条件下较高，高温下有上升的趋势。这说明协同固定化酶对较高温度的适应性更强，固定化载体对酶分子形成了保护环境[22]。

图 6 pH值对固定化酶活力的影响

Fig.6 Effect of pH on enzyme activity

其他条件不变，在pH值为4.0～8.0范围的0.06mol/L磷酸缓冲液中，测定酶活力。图6表明，游离酶的最适pH值为5.5，协同固定化酶的pH值是6.0，且酶活力在海藻酸钠单独固定GOD之上。说明协同固定化酶比游离酶更耐碱，且显示出比游离酶更宽的pH值适应性[23]，结冷胶在改善固定化载体维持酶空间结构的稳定性上起到一定作用。

2.2.2 固定化酶的热稳定性

由图7可知，游离酶在45℃保存1h，酶活力损失了快一半；在65℃保存1h，酶活力降至25%。而固定化酶在65℃保温1h，仍保留有55%左右的酶活。可见固定化酶的热稳定性远高于游离酶，这可能是酶分子与载体间形成共价键稳定了酶分子的构象，使活性中心的稳定性随之增加。海藻酸钠与结冷胶协同固定化酶活力在35～60℃较稳定，在60～70℃时稍低于海藻酸钠单独固定化酶，这可能与协同固定化酶的最适反应温度较低有关。

图 7 游离酶和固定化酶的热稳定性

Fig.7 Thermal stability of free and immobilized glucose oxidase

2.2.3 固定化酶的贮藏稳定性

图 8 贮存时间对固定化酶活力的影响

Fig.8 Effect of storage time on enzyme activity of free and immobilized glucose oxidase

由图8可知，在4℃条件下贮藏30d，固定化酶的活力下降速率较慢。游离酶的活力下降至68%左右，而单独固定化酶仍有超过75%的活力。在这两种固定化方式中，海藻酸钠与结冷胶协同固定的GOD活力更高。这说明协同固定化酶的贮藏稳定性较好。

2.2.4 固定化酶的重复使用

图 9 使用次数对固定化酶活力的影响

Fig.9 Effect of reuse time on enzyme activity of free and immobilized glucose oxidase

游离酶无法从反应体系中分离，不能重复利用。而固定化酶可以从反应体系中分离实现重复利用[24]。由图9可知，海藻酸钠固定化GOD酶活回收率为65.82%，而协同固定化GOD酶活回收率为75.76%，表明海藻酸钠与结冷胶协同固定化效果较好。单固定化GOD在循环使用7次后，保持有32%以上的活力；而海藻酸钠与结冷胶协同固定GOD重复使用5次相对酶活力仍保持在48%以上，显示出良好的操作稳定性。

3 结 论

利用海藻酸钠与结冷胶协同固定GOD，保持海藻酸钠质量浓度20g/L，海藻酸钠与结冷胶体积比4:1，CaCl2质量浓度为60g/L，加酶量为4%，固定化时间是0.5h。固定化GOD的最适作用温度和pH值分别为35℃和6.0。与海藻酸钠单独固定GOD相比较，协同固定化GOD在稳定性方面有所提高，且可以多次重复利用后仍保留有较高的酶活力。海藻酸钠包埋固定化GOD酶活回收率为65.82%，而海藻酸钠与结冷胶协同包埋固定化GOD酶活回收率为75.76%，这表明协同固定的效果好，结冷胶对改善海藻酸钠载体起到了重要作用。随着结冷胶应用范围的愈加广泛，海藻酸钠与结冷胶协同固定GOD的方法在食品工业领域具有潜在的应用价值。

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