响应面法优化超声辅助热水提取黄河
鲤鱼鱼鳞明胶工艺

肖 枫1,2，朱文学2,*

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

摘 要：采用超声辅助热水提取法从新鲜黄河鲤鱼鱼鳞中提取明胶，在单因素试验的基础上，采用响应面试验中的Box-Behnken试验设计，对影响鱼鳞明胶提取率的提取温度、超声时间、超声功率和液料比因素进行优化，建立各因素与明胶得率关系的数学模型。结果表明：黄河鲤鱼鱼鳞明胶的超声辅助热水提取最佳工艺参数为提取温度70℃、超声时间100min、超声功率300W、液料比10:1(mL/g)，在此条件下明胶得率64.18%，与模型预测值接近，因此该模型可以应用于生产。

关键词：黄河鲤鱼；鱼鳞；响应面；超声辅助提取；明胶

Optimization of Ultrasonic-Assisted Hot Water Extraction of Gelatin from Yellow River
Cyprinus carpio haematopterus Scale

XIAO Feng1,2，ZHU Wen-xue2,*

(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；

2. School of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

Abstract：Gelatin was extracted from fresh Cyprinus carpio haematopterus scale by ultrasound-assisted extraction method. On the basis of single factor experiments, Box-Behnken design (BBD) and response surface methodology (RSM) were applied to explore the effects of extraction temperature, ultrasonic treatment time, ultrasonic power and material/liquid ratio on
extraction efficiency. A mathematical model was established and analyzed to describe the relationship between the extraction variables and the yield of gelatin. The optimum extraction conditions were found to be 70 ℃ extraction temperature, 300 W ultrasonic power, 100 min ultrasonic treatment time, and a liquid-to-solid ratio of 10:1 (mL/g), resulting in a yield of gelatin of 64.18%, which was in good agreement with the model predicted value. Therefore, this method can be applied in the natural product industry.

Key words：Cyprinus carpio haematopterus；scale；response surface methodology；ultrasound-assisted extraction；gelatin

中图分类号：TS254.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0101-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322020

鱼鳞主要由羟基磷灰石和胶原纤维组成，占鱼体质量的1%～5%。有关研究表明，鱼鳞中有机物占41%～55%，而蛋白质占有机物的70%[1]，主要为胶原蛋白和角蛋白等硬蛋白[2]，胶原蛋白的含量受鱼品种的影响。据报道，红点副绯鲤(Parupeneus heptacanthus)[3]和深海红鱼(Sebastes mentella)[4]鱼鳞中蛋白质含量分别达到干物质总质量的44.41%和56.9%。胶原蛋白在食品、医药、化妆品、生物材料和组织工程等领域都有广泛的应用，因此，富含胶原蛋白的生产加工废弃物的综合利用和高值化利用也越来越受到大家的关注。

Ⅰ型胶原蛋白通常存在于腱、骨和皮肤等结缔组织中，目前胶原蛋白产品主要来源于陆生动物如牛、猪等等骨骼和皮肤，但是，由于存在安全性方面的潜在问题，一些国家相继出台了不少法规，限制来源于哺乳动物的提取物应用于食品、医药等对人体有直接影响的产品中[5]。因此，水产动物来源的胶原蛋白产品是一个安全的替代品，目前，已经有许多关于鱼皮胶原蛋白的提取、性质等方面的报道，其中包括鲢鱼[6]、鲶鱼[7]、鲤鱼[8]、草鱼[9-10]、罗非鱼[11]等淡水鱼和点纹斑竹鲨[12]、黑鳍鲨[13]、鳕鱼[14]中胶原蛋白特性和提取工艺的研究，近年来，也有一些关于鱼鳞胶原蛋白的提取方法及相关性质的报道[4,15-16]。然而，利用热水提取黄河鲤鱼鱼鳞明胶工艺的研究尚未见报道。本实验以黄河鲤鱼鱼鳞为原料，采用超声波辅助热水提取工艺，利用响应面分析法对黄河鲤鱼鱼鳞明胶提取工艺进行优化，得到黄河鲤鱼鱼鳞明胶最佳提取工艺，以促进黄河鲤鱼的综合利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄河鲤鱼由济源市三佳食品有限公司提供，活鱼屠宰后，取下鱼鳞，用清水洗干净，冷冻贮藏。

盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、醋酸钠、对二甲氨基苯甲醛、高氯酸、氯胺-T等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

722N型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；Fs4111型电子分析天平 北京精诚实验设备有限公司；HR152型电热恒温水浴锅 青岛海尔医用低温科技有限公司；TDL-5型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；KQ-500DE型数控超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；JS-1冻力仪 南京远拓科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼鳞矿物质脱除

将样品置于1.0mol/L HCl溶液(液料比10:1，mL/g)中浸泡30min，然后用纱布过滤，此过程重复2次，用清水洗净，备用。

1.3.2 鱼鳞杂蛋白脱除

取已脱除矿物质的样品加0.1mol/L NaOH溶液(液料比10:1，mL/g)搅拌浸泡6h，溶液每3h更换1次。处理过的鱼鳞用清水清洗至洗液呈中性。

1.3.3 羟脯氨酸含量测定

样品用6mol/L HCl溶液于105℃条件下水解6h，比色法测定羟脯氨酸的含量[17]。

1.3.4 鱼鳞明胶的提取

采用超声波辅助热水提取法对样品中的胶原蛋白进行提取，提取的胶原蛋白受热变性变为明胶。选择提取温度、超声提取时间、超声功率和液料比作为影响因素。以提取物中羟脯氨酸的含量与原始样品中羟脯氨酸含量的比值来计算明胶的提取率。

1.3.5 单因素试验

称取经处理的鱼鳞10g，分别对提取温度、超声提取时间、超声功率和液料比进行单因素试验，考察各因素对鱼鳞明胶提取率的影响。

1.3.6 响应面优化试验

根据Box-Behnken Design(BBD)原理，选取提取温度、超声提取时间、超声功率和液料比4个因素，以明胶提取率为考察目标进行响应面试验设计，优化明胶提取工艺。通过Design-Expert 8.0软件对试验数据进行回归分析，预测最优工艺参数。试验因素及水平见表1。

表 1 响应面试验因素与水平

Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.3.7 黏度和凝冻强度的测定

配制质量分数6.67%的明胶溶液，按照GB 6783—1994《食品添加剂：明胶》的方法测定明胶溶液的黏度和凝冻强度[18]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度对明胶提取率的影响

经矿物质和杂蛋白脱除处理的黄河鲤鱼鱼鳞，在提取时间90min、超声功率300W、液料比8:1(mL/g)的条件下，研究提取温度对明胶提取率的影响。

图 1 提取温度对明胶提取率的影响

Fig.1 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of gelatin

由图1可以看出，鱼鳞明胶提取率随提取温度的升高而升高，在45～65℃范围内提取率快速升高，提取温度继续升高则提取率变化缓慢，提取温度75℃时明胶提取率与提取温度65℃时无显著差异(P＞0.05)，因此选择65℃为较优提取温度。胶原蛋白本身难溶于水，温度较低时，利用弱酸介质也很难将一些动物组织中的胶原蛋白提取出来，在鱼鳞明胶的提取过程中，胶原蛋白首先要发生一定程度的降解，才能以明胶的形式溶于水中，升高温度可以加速胶原蛋白的降解，从而促进鱼鳞明胶的溶出。

2.1.2 超声提取时间对明胶提取率的影响

在提取温度65℃、超声功率300W、液料比8:1(mL/g)条件下改变提取时间，如图2所示，当超声时间在90min以内时，提取率随提取时间延长而迅速升高(P＜0.05)，提取90min以后变化趋势较缓慢，提取率无显著变化(P＞0.05)，因此选择90min为较优超声提取时间。大分子物质在超声波引发的机械效应、瞬时高压和局部高温的作用下，会引起共价键的断裂，从而导致高分子物质的降解。超声波的这种作用对于生物活性大分子的提取可能会产生负面影响，但是对于明胶的提取来说，超声作用造成样品中胶原蛋白纤维的断裂能够促进其降解，从而提高明胶的提取率。然而，过长时间的超声处理，可能会造成产品中小分子物质含量增加。

图 2 超声时间对明胶提取率的影响

Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction efficiency of gelatin

2.1.3 超声功率对明胶提取率的影响

在提取温度65℃、超声时间90min、液料比8:1(mL/g)
的条件下研究超声功率对明胶提取率的影响。如图3所示，超声功率在100～300W内，提取率随超声功率的增大而升高，继续增大超声功率则提取率有所下降，因此选择超声功率300W作为较优水平。在超声强度较低时，超声波强度越大所产生的空化效应越明显，但是当超声强度增加到一定程度以后会出现过饱和现象，形成音障，阻碍超声波的传递，从而使超声作用减弱[19]，超声波对鱼鳞明胶提取率的影响可能与其产生的空化效应有关，同时超声波产生的机械效应[20]也可促进鱼鳞胶原蛋白的断裂，从而提高明胶得率。

图 3 超声功率对明胶提取率的影响

Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of gelatin

2.1.4 液料比对明胶提取率的影响

在提取温度65℃、超声时间90min、超声功率300W的条件下研究液料比对明胶提取率的影响，如图4所示，明胶提取率随提取液用量增大呈增加趋势。表明提取液用量的增加降低了提取液中溶质的浓度，有利于溶质的溶出。当液料比达到10:1以上时，明胶得率没有显著变化，提取液用量的增加虽然使得提取液中明胶的总量增大，但会造成提取液中明胶浓度的降低，从而使得后续加工过程中消耗的能量增加，不利于实际生产，综合考虑，选择10:1(mL/g)作为较优水平。

图 4 液料比对明胶提取率的影响

Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction efficiency of gelatin

2.2 响应面试验

2.2.1 模型的建立及显著性检验

表 2 响应面优化试验设计及结果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

根据Box-Behnken试验原理，在单因素试验的基础上，结合生产实际，设计了四因素三水平的响应面试验，对黄河鲤鱼鱼鳞明胶的提取工艺进行优化，试验结果如表2所示。回归分析得到明胶提取率与各因素的回归方程为：

Y=63.47＋2.68X1＋1.95X2＋0.89X3＋0.89X4＋1.83X1X2＋
0.9X1X3＋0.17X1X4＋1.03X2X3＋0.05X2X4＋0.65X3X4－3.69X12－2.79X22－3.98X32－2.58X42

由表2可知，此方程P＜0.0001，该模型达到极显著水平，而失拟项不显著，相关系数(R2=0.9575)较高，因此，该方程拟合较好，可以用此模型来预测超声辅助提取鱼鳞明胶工艺的结果。模型的一次项X1、X2、二次项以及交互项X1X2对明胶提取率的影响极显著(P＜0.01)，模型的一次项X3、X4对明胶提取率的影响显著(P＜0.05)，其他项不显著，表明各因素对鱼鳞明胶提取率的影响不是简单的线性关系。

表 3 回归模型的方差分析

Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

2.2.2 响应面分析

图 5 各因素对明胶提取率影响的响应面图

Fig.5 Response surface plots showing the effect of different extraction variables on the extraction efficiency of gelatin

试验中所考察的4个因素对鱼鳞明胶提取率影响的交互作用见图5。由图5a可以看出，响应面图的坡度较陡，等高线成椭圆形，因此，提取温度和超声时间对明胶提取率影响较大，且2因素交互作用较强，由表3也可看出，2因素的交互作用对明胶提取率有极显著影响。提取温度(X1)和超声功率(X3)(图5b)、提取温度(X1)和液料比(X4)(图5c)、超声时间(X2)和超声功率(X3)(图5d)、超声时间(X2)和液料比(X4)(图5e)、超声功率(X3)和液料比(X4)(图5f)对明胶提取率的响应面图具有类似的趋势，等高线接近圆形，表明它们的交互作用都较弱，对响应值的影响不显著。由图5可以看出，涉及到提取温度和超声时间的响应面图较陡峭，试验范围内的超声功率和液料比对响应值的响应面图较平坦，因此超声辅助提取黄河鲤鱼鱼鳞明胶工艺中，提取温度和超声时间对明胶得率的影响最大。

2.2.3 提取工艺参数的优化和验证

对响应面试验结果进行优化分析，计算得到回归拟合方程在X1=0.55、X2=0.58、X3=0.27、X4=0.23时可取得最大值，即最优提取条件为提取温度70.5℃、超声时间107.4min、超声功率327W、液料比10.4:1(mL/g)，在此条件下，黄河鲤鱼鱼鳞明胶的得率为64.99%。考虑实际操作，将优化参数修正为提取温度70℃、超声时间100min、超声功率300W、液料比10:1(mL/g)。采用修正后的提取条件进行实验，实际提取率为(64.18±0.57)%，实验值与预测值在95%置信区间内没有显著差异，表明该响应面优化模型是有效的，因此，该模型用于黄河鲤鱼鱼鳞明胶的提取是可行的。

2.3 鱼鳞明胶的黏度和凝冻强度

食用明胶分为A型(酸法明胶)与B型(碱法明胶)以及皮类与骨类[19]。明胶溶液的黏度和凝冻强度是反映明胶品质的重要指标[14]，是明胶的重要特性。GB 6783—1994中规定了骨明胶和皮明胶的理化指标，目前还没有制定关于鱼鳞明胶的相关标准，因此本实验将制得的鱼鳞明胶与B型皮明胶和骨明胶的黏度和凝冻强度进行比较，了解鱼鳞明胶的产品品质，结果如表4所示。在食品工业中使用明胶通常都要求其具有一定的黏度，用途不同，对其黏度的要求会有所差别，结果表明实验中制得的鱼鳞明胶黏度达到B型皮食用明胶的B级和B型骨食用明胶的A级，其凝冻强度达到B型骨和皮食用明胶的B级，因此，在黏度和凝冻强度性质方面达到了食用明胶的要求。

表 4 鱼鳞明胶与B型明胶的黏度和凝冻强度比较

Table 4 Comparison of viscosity and gel strength between gelatin from common carp scale and B type gelatin

3 结 论

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken原理进行试验设计，建立了黄河鲤鱼鱼鳞明胶超声辅助提取法明胶得率的模型方程。利用Design Expert软件进行回归分析计算，得到超声辅助提取法的最优工艺参数：提取温度70℃、超声时间100min、超声功率300W、液料比10:1(mL/g)，在此条件下明胶得率64.18%，与模型方程的预测值无显著差异。该方法制备的明胶在黏度方面达到B型皮食用明胶B级和B型骨食用明胶A级国家标准，超声辅助提取法可以提高鱼鳞明胶的提取效率，但是超声处理的机械效益促进蛋白分子的断裂，是否对明胶产品的加工特性产生影响，还需进一步研究。

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