鸭肉肌动球蛋白解离的影响因素研究

董 晗1,2,王道营1,张牧焓1,诸永志1,徐为民1,*,刘 芳1

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014;2.南京财经大学食品科学与工程学院,江苏 南京 210046

 

摘 要:研究可能影响鸭肉肌动球蛋白解离的多种因素,包括内部因素(AMP、IMP、ADP、ATP、Ca2+、PO43-)和外部因素(NaCl腌制、不同种类磷酸盐腌制)。以肌动球蛋白提取物和鸭肉为原料,主要应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)法进行检测。结果表明:在4℃条件下,经过8、16mmol/L的AMP、IMP处理和25~50mmol/L PO43-处理的肌动球蛋白,检测到肌动蛋白条带浓度明显增加;经过8、16mmol/L ADP处理和0.1~5.0mmol/L Ca2+处理后的肌动球蛋白,检测到肌动蛋白条带浓度无明显变化。腌制对肌动球蛋白解离无明显影响。

关键词:鸭肉;肌动球蛋白;解离;影响因素

 

Factors Influencing the Dissociation of Duck Breast Muscle Actomyosin

 

DONG Han1,2, WANG Dao-ying1, ZHANG Mu-han1, ZHU Yong-zhi1, XU Wei-min1,*, LIU Fang1

(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;

2. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210046, China)

 

Abstract: This study illustrated multiple potential factors influencing actomyosin dissociation, including internal factors (AMP, IMP, ADP, ATP, Ca2+, and PO43-) and external factors (marinated with NaCl or with different phosphate salts). Actomyosin was extracted from duck breast muscle and the protein composition was examined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western-blot analysis. Results: The density of actin bands was increased significantly when the actomyosin was treated with 8, 16 mmol/L AMP or IMP or with 25–50 mmol/L PO43- at 4 ℃, whereas treatment with 8, 16 mmol/L ADP or with 0.1–5 mmol/L Ca2+ did not result in a significant change in actin band densities. These results suggest that marinating duck muscle with different salts has no significant effects on actomyosin dissociation.

Key words: duck; actomyosin; dissociation; affecting factors

中图分类号:TS251.68 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)01-0023-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401005

鸭肉及其制品深受中国人广泛喜爱,人们通常以肉品嫩度来评定肉制品品质[1-4]。因此,如何改善肉制品的嫩度成为提高肉品品质的关键问题。一般认为,肉在加热后,肉中胶原蛋白凝胶化使得肉质变嫩[5-9];但经过实验研究,加热的另一影响是促进了肌动球蛋白解离[10-11]。因此推断,肌动球蛋白的解离能够改善肉品嫩度,实验拟对鸭肉中肌动球蛋白解离规律及影响肌动球蛋白解离的因素进行研究,进而揭示肌动球蛋白解离与嫩度的关系。

肌动球蛋白是肌动蛋白与肌球蛋白发生结合后的复合物。肌动球蛋白的聚合度不同,因此它的分子质量也不确定。肌动蛋白与肌球蛋白的结合比例从12.5到14。肌动球蛋白的结合与解离与肌肉的收缩直接相关。肌球蛋白形状类似“豆芽”,头部为重酶解肌球蛋白,尾部为轻酶解肌球蛋白。肌球蛋白的头部有ATP酶活性,可以催化ATP降解。肌动蛋白单独存在时为球状分子,称为G-肌动蛋白,但在ATP和磷酸盐的存在下,G-肌动蛋白聚会成F-肌动蛋白,后者可以与原肌球蛋白等结合生成细丝,参与肌肉的收缩过程[12]。在ATP的作用下,肌球蛋白与肌动蛋白结合成肌动球蛋白。

而在成熟过程中,肉的嫩度逐渐改善,可能原因也是各种因素作用于肌动球蛋白而使其发生解离作用。由此可见,肌动蛋白与肌球蛋白是否结合、结合是否紧密是决定肉品嫩度的关键因素[13]。因此,探究影响肌动球蛋白解离的因素成为众多肉品科研工作者的工作重点。

现今已经研究发现的可以促进肌动球蛋白解离的因素有IMP和AMP[14],和焦磷酸盐与MgCl2共存的情况下[15]。可能影响肌动球蛋白解离的其他多种因素还未有深入发现,因此,影响肌动球蛋白解离的因素还有待于进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸭肉原料取自肉用麻鸭(3kg左右),选自当地农贸市场(孝陵卫农贸市场),随机选取40日龄左右健康肉用麻鸭6只,按企业的工艺要求,宰杀、放血、去毛,迅速剥离两侧胸肌,放置4℃条件下过夜成熟,待用。

抗兔骨骼肌肌动蛋白多克隆抗体、IMP、AMP、ADP、ATP 美国Sigma公司;羊抗兔IgG、DAB显色试剂盒 巴傲得生物科技公司;Goat anti-GAPDH 美国Genscript公司;预热宽范围标准蛋白 加拿大Fermentas公司。

1.2 仪器与设备

HH-8数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;T-25数显匀浆机 德国IKA公司;HI-9025酸度计 意大利Hanna公司;SPX-250B-Z生化培养箱 上海博讯有限公司;UniCenMR冷冻离心机 德国Herolab公司;UV-6100紫外-可见光分光光度计 上海元析仪器有限公司;Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳仪、Semi-Dry转印仪 美国Bio-Rad公司;JS-680C全自动凝胶成像分析仪 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

实验共设两组,一组以鸭胸肉肉糜提取的肌动球蛋白为实验原料,验证影响肌动球蛋白解离的内部因素:IMP、AMP、ADP、ATP、CaCl2、Na3PO4;另一组以完整鸭胸肉块为实验原料,验证影响肌动球蛋白解离的外部因素:NaCl腌制、磷酸盐腌制。

1.3.2 前处理方法

内部因素组:准确吸取0.5mL肌动球蛋白溶液,放入1.5mL离心管,分别加入1mL不同浓度的IMP、AMP、ADP、ATP、CaCl2、Na3PO4溶液,4℃条件下振荡反应16h。反应完毕后,离心分离,取0.2mL上清液,用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blotting)法检测。

外部因素组:1)NaCl腌制:取完整的鸭胸肉,分别用NaCl干腌(胸肉表面撒盐)15h,湿腌(100℃饱和食盐水,冷却至室温后腌制)15h,干腌3h后湿腌12h,湿腌3h后干腌12h。2)混合磷酸盐腌制:取完整的鸭胸肉,并取3种不同的磷酸盐(焦磷酸钠、三聚磷酸钠、六偏磷酸钠)分别溶于5mL蒸馏水中。用5mL注射器分别向鸭胸肉注入焦磷酸钠溶液、三聚磷酸钠溶液、六偏磷酸钠溶液。磷酸盐的用量为0.4g/100g鸭肉,腌制24h。注射期间进行2~3次滚揉,以利于磷酸盐均匀分布。

鸭肉腌制后,提取肌动蛋白溶液,进行SDS-PAGE分析。

相关溶液配制方法:IMP溶液配制:20mmol/L Tris-HCl,3mmol/L NaN3,x mmol/L IMP(x为IMP浓度,x = 0、12、24),pH7.2。

AMP、ADP、ATP溶液配制:同IMP溶液。

Na3PO4溶液配制:20mmol/L Tris-HCl,xmmol/L Na3PO4(x为Na3PO4浓度,x = 0、7.5、15、37.5、75),pH7.2。

CaCl2溶液配制:20mmol/L Tris-HCl,xmmol/L CaCl2(x为CaCl2浓度,x = 0、0.15、0.3、0.75、1.5、3、7.5),pH7.2。

100℃饱和食盐水:烧杯中加一定量的水,煮沸后向其中加热NaCl固体,不停搅拌,直到有固体未溶解,且等足够长时间仍未溶解,过滤得滤液,即为100℃饱和食盐水。

1.3.3 肌动球蛋白和肌动蛋白提取方法

肌动球蛋白的提取方法为,参考Okitani等[11,14]的方法,并稍作修改。具体为2g新鲜鸭肉肉糜溶于20mL Weber-Edsall溶液(0.6mol/L KCl、0.04mol/L NaHCO3、0.01mol/L Na2CO3,pH 7.2),12000r/min匀浆2次(每次30s,中间间隔10s)。匀浆后溶液置于4℃培养箱内,摇床振荡24h。过滤后,4℃、12000×g离心20min,弃去上清液,沉淀溶于20mL Weber-Edsall溶液,振荡混匀后,4℃、12000×g离心20min,弃去上清液,沉淀溶于5mL Tris-HCl缓冲溶液(20mmol/L Tris-HCl、0.6mmol/L KCl,pH7.2)即得肌动球蛋白溶液。利用考马斯亮蓝法测定蛋白质量浓度后,并调整质量浓度为10mg/mL,立即使用。

肌动蛋白的提取方法与肌动球蛋白提取方法类似。具体为2g新鲜鸭肉肉糜溶于20mL Weber-Edsall溶液(0.6mol/L KCl、0.04mol/L NaHCO3、0.01mol/L Na2CO3,pH7.2),12000r/min匀浆2次(每次30s,中间间隔10s)。匀浆后溶液置于4℃培养箱内,摇床振荡24h。过滤后,用蒸馏水使KCl浓度调整到0.2mol/L。取其中0.2mL样品Ⅰ(肉样匀浆稀释液,即为肌肉全蛋白提取液)用于电泳检测总蛋白,剩余部分于4℃、12000×g离心20min,取0.2mL样品Ⅱ(离心上清液,即为肌动蛋白提取液)并加入0.4mL上样缓冲液制成电泳样品。

1.3.4 检测方法

采用Western blotting法检测提取液中肌动蛋白含量。采用变性不连续电泳,分离胶12%,浓缩胶5%(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺质量比为36.51)。电泳分离后用半干转膜仪将凝胶中的蛋白转印到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,Tris-HCl缓冲溶液+吐温溶液(TBST溶液)漂洗(3次,每次5min)。转印后的PVDF膜用含有5g/100mL脱脂奶粉的TBST溶液(0.05%吐温-20、50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、5mmol/L KCl,pH7.4)室温封闭1h,膜漂洗3次后与一抗(一抗为抗兔骨骼肌肌动蛋白多克隆抗体,用含有5g/100mL脱脂奶粉的TBST溶液11000稀释)结合,4℃摇床孵育过夜,然后膜漂洗3次后与二抗(二抗为辣根过氧化酶连接的羊抗兔IgG,用含有5g/100mL脱脂奶粉的TBST溶液15000稀释)结合,室温摇床孵育1h,膜漂洗后使用DAB显色剂显色,显色后蒸馏水彻底冲洗停止反应,并使用凝胶成像仪拍照。实验选用GAPDH作为内参蛋白。Quantity One软件扫描蛋白免疫印迹条带,得出光密度值用于数据分析。

1.4 数据分析

所有图片使用Quantity One处理分析,所有数据以

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±s

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表示,所得数据使用SPSS18.0进行单因素方差分析。不同处理组间差异分析采用单因素方差分析,用Duncans多重比较,α = 0.05。定量分析统计图使用Sigma Plot绘制。

2 结果与分析

2.1 内部环境影响因素

2.1.1 IMP对鸭肉肌动球蛋白解离的影响

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字母不同表示组别间有显著性差异(P<0.05)。下同。

图 1 IMP对肌动球蛋白解离影响的Western blotting转印图(A)和
定量分析图(B)

Fig.1 Western blotting (A) and quantitative analysis (B) for the effect of IMP on actomyosin dissociation

由图1A可知,对照组只有微弱的肌动蛋白条带,在IMP的作用下,可以观察到条带浓度逐渐增大。由图1B也得出相同结果,加入IMP后的肌动蛋白含量均高于对照组,并随着IMP浓度的增加而增加,8mmol/L IMP处理组显著高于对照组(P<0.05),16mmol/L处理组显著高于8mmol/L组与对照组(P<0.05)。

2.1.2 AMP对鸭肉肌动球蛋白解离的影响

由图2A可知,对照组的肌动蛋白条带浓度很低,在AMP的作用下,可以观察到条带浓度逐渐增大。由图2B也得出相同结果,加入AMP后的肌动蛋白含量均高于对照组,并随着AMP浓度的增加而增加,但是经过8mmol/L AMP处理的与对照组没有显著差异(P>0.05),16mmol/L
处理组显著高于8mmol/L组与对照组(P<0.05)。

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图 2 AMP对肌动球蛋白解离影响的Western blotting转印图(A)和
定量分析图(B)

Fig.2 Western blotting (A) and quantitative analysis (B) for the effect of AMP on actomyosin dissociation

2.1.3 ADP对鸭肉肌动球蛋白解离的影响

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图 3 ADP对肌动球蛋白解离影响的Western blotting转印图(A)和
定量分析图(B)

Fig.3 Western blotting (A) and quantitative analysis (B) for the effect of ADP on actomyosin dissociation

由图3A可知,不同浓度ADP处理组与对照组的肌动蛋白条带浓度都很低,并没有观察出ADP对肌动球蛋白的解离有任何影响。由图3B也得出相同结果,加入8、16mmol/L ADP的处理组与对照组没有显著差异(P>0.05)。

2.1.4 ATP对鸭肉肌动球蛋白解离的影响

由图4可知,对照组可以检测到微弱的肌动蛋白条带,但经过ATP处理的肌动球蛋白提取液,却检测不到肌动蛋白的存在。

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图 4 ATP对肌动球蛋白解离影响的Western blotting转印图

Fig.4 Western blotting for the effect of ATP on actomyosin dissociation

2.1.5 Na3PO4对鸭肉肌动球蛋白解离的影响

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图 5 Na3PO4对肌动球蛋白解离影响的Western blotting转印图(A)和
定量分析图(B)

Fig.5 Western blotting (A) and quantitative analysis (B) for the effect of Na3PO4 on actomyosin dissociation

由图5A可知,低浓度Na3PO4处理组条带与对照组的肌动蛋白条带浓度都很低,在Na3PO4浓度增加到25mmol/L
时,条带浓度开始增大。由图5B也得出相同结果,加入25mmol/L Na3PO4处理的溶液中肌动蛋白含量高于对照组与低浓度的Na3PO4处理组,但与对照组无显著差异(P>0.05),50mmol/L处理组显著高于对照组与低浓度处理组(P<0.05)。

2.1.6 CaCl2对鸭肉肌动球蛋白解离的影响

由图6A可知,不同浓度CaCl2处理组与对照组的肌动蛋白条带浓度相似,没有明显差别。由图6B也得出相同结果,不同浓度CaCl2处理组与对照组中的肌动蛋白含量无显著差异(P>0.05)。

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图 6 CaCl2对肌动球蛋白解离影响的SDS-PAGE电泳图(A)和
定量分析图(B)

Fig.6 SDS-PAGE (A) and quantitative analysis (B) for the effect of CaCl2 on actomyosin dissociation

2.2 外部环境影响因素

2.2.1 NaCl腌制对鸭肉肌动球蛋白解离的影响

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图 7 NaCl腌制对肌动球蛋白解离影响的SDS-PAGE电泳图(A)和
定量分析图(B)

Fig.7 SDS-PAGE (A) and quantitative analysis (B) for the effect of NaCl on actomyosin dissociation

由图7A可知,腌制后的鸭肉肌动蛋白条带浓度略高于对照组,不同腌制方法的条带浓度没有明显的差别。由图7B也得出相同结果,不同腌制方法与对照组中的肌动蛋白含量无显著差异(P>0.05)。

2.2.2 磷酸盐腌制对鸭肉肌动球蛋白解离的影响

由图8A可知,不同的磷酸盐腌制后的鸭肉,肌动蛋白条带浓度相似。由图8B也可得出此结果,不同磷酸盐腌制的鸭肉中与对照组中的肌动蛋白含量无显著差异(P>0.05)。

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图 8 磷酸盐腌制对肌动球蛋白解离影响的SDS-PAGE电泳图(A)和
定量分析图(B)

Fig.8 SDS-PAGE (A) and quantitative analysis (B) for the effect of phosphates on actomyosin dissociation

3 讨 论

3.1 影响肌动球蛋白解离的内部因素

本实验研究结果表明,鸭肉本身的内源物质,AMP、IMP和PO43-有助于肌动蛋白从肌动球蛋白上解离下来。而ADP、Ca2+和ATP对肌动球蛋白的解离没有促进作用,反而ATP可以促进肌动蛋白和肌球蛋白结合生产肌动球蛋白。

实验结果显示,在较低温度(4℃)条件下,用8mmol/L和16mmol/L的IMP和AMP处理的肌动球蛋白可以显著的促进其解离,IMP和AMP的浓度越大,它对肌动球蛋白解离的促进作用就越明显。这也与Okitani等[14]的研究结果相符,IMP和AMP是导致低温贮存的骨骼肌中肌动球蛋白可逆解离的主要因素。

Benjakul等[15]研究发现,焦磷酸盐与MgCl2共同作用可以导致肌动球蛋白发生自然解离,也就证明了PO43-是可以影响肌动球蛋白解离的因素之一。但是肉中虽然含有大量的矿物质,低浓度(<25mmol/L)的PO43-对肌动球蛋白的解离仍然没有促进作用。因此可以推测,鸭肉内源游离的PO43-可能达不到可以促进肌动球蛋白解离的程度,而本实验中的25mmol/L和50mmol/L的高浓度PO43-促进了肌动球蛋白解离,可能是由于高浓度的离子,导致溶液的高强度的作用力将肌动蛋白从肌动球蛋白上分离下来。

没有检测出ADP和ATP对肌动球蛋白解离有促进作用,反而在ADP存在的情况下,肌动蛋白的含量低于对照组。由ATP处理后的肌动球蛋白无法检测到肌动蛋白条带,可以推测,在较低的温度(4℃)条件下,肌动球蛋白的解离是可逆的,即溶液中的肌动蛋白与肌球蛋白在ATP的作用下重新结合生成肌动球蛋白。

肉成熟嫩化的机制——酶假说[16-17]与钙理论[18-19],人们大多支持酶假说,认为Ca2+浓度升高激活钙蛋白酶而改善了肉的嫩度,而Takahashi等[19-20]研究发现,在钙蛋白酶不发挥作用的情况下,肌肉中Z盘的弱化就是Ca2+的作用。但是本实验研究结果显示,不同浓度的Ca2+对提取出来的肌动球蛋白解离没有影响。这与钙理论并不相符。

3.2 影响肌动球蛋白解离的外部因素

南京盐水鸭以其肉质软嫩而闻名,其制作过程的主要步骤之一就是用食盐腌制,因此要考虑NaCl的腌制是否对肉的嫩度有影响。杨勇等[21]研究发现,各种盐和酶都是具有嫩化效果的,焦磷酸钠的嫩化效果是最好的。Benjakul等[15]研究发现,添加焦磷酸盐与MgCl2可以引起肌动球蛋白发生自然解离。孙卫青等[22]也比较了混合磷酸盐在鸭肉中的应用,并得到一定嫩度改善结果。因此NaCl与多种磷酸盐对肉品的腌制是否影响肌动球蛋白解离有待研究。

但是实验结果显示,NaCl腌制与磷酸盐腌制对鸭胸肉肌动球蛋白解离均没有产生影响。最主要原因可能因为完整的鸭胸肉是完整的体系,而盐溶液不能够破坏肌纤维,更不能影响到肌肉的内部蛋白,即无法影响肌动球蛋白的解离。

4 结 论

本实验对鸭肉中影响肌动球蛋白解离的多种因素进行研究,结果表明,IMP、AMP、高浓度PO43-对肌动球蛋白的解离有促进作用,但ADP、Ca2+、ATP、腌制对肌动球蛋白解离没有明显影响。由实验结果看出,影响肌动球蛋白解离的小分子内部因素并不多,由此需要从另一角度进行更深入的研究,包括构成肌纤维的多种相关蛋白质和鸭肉内部的多种内源酶。这一研究成果将为今后建立肌动球蛋白解离的调控程序,探究肌动球蛋白解离与鸭肉嫩度之间的关系提供参考依据。

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收稿日期:2012-11-15

基金项目:国家自然科学基金项目(31101312);江苏省农业科技自主创新基金项目(CX(12)3082)

作者简介:董晗(1987—),女,硕士研究生,研究方向为食品科学。E-mail:handong.2567@yahoo.com.cn

*通信作者:徐为民(1969—),男,研究员,博士,研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail:weiminxu2002@yahoo.com.cn