海带多糖对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

彭臻菲1,2，方哲翔1，刘 敏1，陈 立1，张其清1,*

(1.福州大学生物和医药技术研究院，福州大学化学化工学院，福建 福州 350108；

2.福建卫生职业技术学院，福建 福州 350101)

摘 要：目的：研究海带多糖诱导血管平滑肌细胞凋亡及其调控机制。方法：在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 诱导血管平滑肌细胞增殖模型基础上，运用MTT法考察海带多糖对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用；利用荧光倒置显微镜观察VSMC细胞形态学的变化；通过流式细胞术分析VSMC细胞周期的分布；采用Western blotting免疫印迹法探讨VSMC细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果：海带多糖抑制VSMC细胞增殖抑制。细胞形态学观察结果及流式、Western blotting免疫印迹分析结果表明海带多糖可诱导VSMC细胞凋亡。其凋亡机制与其诱导细胞周期阻滞于S期以及提高Bax/Bcl-2比率有关。结论：海带多糖可诱导VSMC细胞凋亡。

关键词：海带多糖；增殖抑制；细胞凋亡；Bax/Bcl-2比率

Apoptosis Induction of Laminaria japonica Polysaccharide in Rat Vascular Smooth Muscle Cells

PENG Zhen-fei1,2，FANG Zhe-xiang1，LIU Min1，CHEN Li1，ZHANG Qi-qing1,*

(1. Institute of Biomedical and Pharmaceutical Technology, College of Chemistry and Chemical Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China；2. Fujian Health College, Fuzhou 350101, China)

Abstract：Objective: To explore the apoptotic mechanism induced by kelp (Laminaria japonica) polysaccharides in rat vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods: The bFGF-induced proliferation of VSMC was evaluated by MTT assay. The morphological changes of VSMC were investigated using fluorescence microscope. The cell cycle distribution of VSMC was determined using flow cytometry. The apoptotic factors Bcl-2 and Bax were evaluated by Western blotting assay.
Results: Kelp polysaccharides inhibited the growth of VSMC. Moreover, the results of cell morphology, flow
cytometry and Western blotting assay indicated that kelp polysaccharides could induce VSMC apoptosis. The apoptotic mechanism was related to the induction of S phase arrest, as well as the increase of Bax/Bcl-2 ratio. Conclusion: Kelp polysaccharides can induce apoptosis.

Key words：Laminaria japonica polysaccharide；growth inhibition；apoptosis；Bax/Bcl-2 ratio

中图分类号：Q539 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0344-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321069

动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础，也是威胁人类健康的杀手。动脉粥样硬化防治研究发现， 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖、迁移以及内皮细胞损伤是动脉粥样硬化形成的细胞学基础[1-2]。吸烟、高血压等引起机体氧化应激水平增高的因素是动脉粥样硬化形成的主要诱因[3-4]。

海带属褐藻，盛产于我国东南沿海地区，一直以来作为功能性食品而被人们所熟悉。多糖是海带主要的生物活性大分子之一，已有研究表明，海带多糖具有清除自由基、抗脂质过氧化、增强组织中抗氧化酶活力等生物学活性，可减少机体活性氧过度累积，降低氧化应激引起的动脉血管病变[5-7]。已有研究表明，海带多糖能保护内皮细胞核和线粒体超微结构的完整性，降低内皮细胞的损伤[8]。前期研究证明海带多糖也具有抑制血管平滑肌细胞增殖的活性[9]。因此，海带多糖对减缓早期动脉粥样硬化病变以及动脉粥样硬化的预防都具有重要意义。

bFGF是成纤维细胞生长因子蛋白家族中的一员，具有极强的有丝分裂原活性，对成纤维细胞、血管内皮细胞以及平滑肌细胞都有明显的促增殖、分化及功能表达的作用[10]。目前，已有大量实验采用bFGF作为促细胞增殖的诱导剂[11-12]。本实验以bFGF为诱导剂，建立VSMC细胞体外增殖模型。在此基础上，考察海带多糖对VSMC细胞增殖的抑制机制，为海带多糖的抗动脉粥样硬化功能性食品开发提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海带产自福建宁德，海带多糖组分WPS-1由本实验室按参考文献[13]方法制备；VSMC细胞由本实验室按参考文献[9]方法制备并鉴定。

DMEM培养基 美国Gibco公司；10×PBS干粉、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)、碱性成纤维生长因子(bFGF) 加拿大Biobasic公司；胎牛血清、胰蛋白酶 生工生物工程(上海)股份有限公司；DAB显色试剂盒 北京中杉生物公司；四甲基偶氮唑盐(MTT) 美国Biosharp公司；Hoechst33258染料、PI染色试剂盒 江苏碧云天公司；Bax、Bcl-2单克隆抗体 美国CST公司；HRP标记羊抗鼠IgG 美国Pierce公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

COULTER EPICS XL流式细胞仪 美国Beckman公司；JS-380C凝胶成像分析仪 上海培清科技有限公司；IX71倒置荧光显微镜 日本奥林巴斯公司；DYCZ-24DN电泳仪 北京六一仪器厂；UV-1600紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海带多糖对VSMC细胞增殖的影响

取对数生长VSMC细胞，接种于96孔板，200µL/孔，培养至设定时间。分别加入设定质量浓度(0.1mg/mL和1mg/mL)WPS-1处理至设定时间，模型组以培养液代替多糖样品。加入终质量浓度为50ng/mL bFGF，继续培养48h。各组分别加入100µg MTT，孵育4h后弃上清，加入100µL DMSO，充分振荡溶解蓝色结晶，酶标仪检测各孔光密度值，检测波长578nm。每个实验组设置6孔平行孔。

1.3.2 海带多糖对VSMC细胞生长的影响

细胞核形态观察采用荧光染料Hoechst 33258染色。具体操作方法如下：将无菌盖玻片置于6孔板内。取对数生长VSMC细胞，接种于6孔板内盖玻片上，培养24h后加入不同质量浓度(0.1、0.5、1、2mg/mL)海带多糖，处理24h。模型组用培养液代替海带多糖样品，设置2个平行孔。加入终质量浓度为50ng/mL的bFGF，继续培养48h后，弃培养基，并用无菌PBS洗板2次，加入1mL固定液(95%乙醇、冰乙酸体积比3:1)，固定15min。PBS洗板2次，加入Hoechst 33258染色液，避光染色30min。PBS洗板2次，加封片液于载玻片，盖上处理后的贴有细胞的盖玻片，倒置荧光显微镜观察。

VSMC细胞形态观察按常规方法培养细胞，按1.3.1节实验设计处理细胞，倒置显微镜观察细胞形态。

1.3.3 海带多糖对VSMC细胞周期分布的影响

收集各实验组细胞，经PBS清涤后，按细胞凋亡与细胞周期检测试剂盒说明操作。具体方法如下：加入预冷的70%乙醇1mL，于－20℃固定细胞12h以上，经PBS洗涤后，加入含有RNAase的PI染色液，200μL/管，避光反应30min后，进行流式细胞仪检测。

1.3.4 海带多糖对VSMC细胞凋亡因子表达的影响

采用Western blotting方法检测海带多糖对VSMC细胞凋亡因子Bcl-2及Bax蛋白表达的影响。具体操作方法如下：分别收集各实验组细胞(每组设置3个平行孔)，加入100μL细胞裂解液充分裂解细胞，12000×g离心5min后收集上清液。BCA法测定各组上清液中蛋白含量。取细胞提取上清液(蛋白含量40μg)进行SDS-PAGE凝胶电泳(12%分离胶，5%浓缩胶)，转膜封闭后，分别加入Bax、Bcl-2单克隆抗体，4℃孵育过夜，洗涤后加入HRP标记羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，经DAB显色后凝胶成像系统进行图像分析。

1.4 统计学分析

本实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，所有数据用

±s表示，并对结果进行LSD-t检验。

2 结果与分析

2.1 海带多糖作用时间对VSMC细胞增殖的影响

表 1 海带多糖作用时间对VSMC增殖的影响(

x

±s，n=6)

Table 1 Effect of Laminaria japonica polysaccharids on VSMC proliferation during different time periods (

x

±s，n=6)

本课题组前期实验研究已发现海带多糖WPS-1对VSMC细胞增殖具有抑制作用[9]。本实验进一步考察WPS-1的作用时间对VSMC细胞增殖的影响。由表1可知，当WPS-1作用时间为12h时，测得0.1mg/mL和1mg/mL实验组VSMC细胞增殖抑制率分别为13.17%和17.81%。当WPS-1作用时间达到48h时，测得0.1mg/mL和1mg/mL实验组VSMC细胞增殖抑制率分别为13.01%和19.59%。由此可见，WPS-1作用时间对VSMC细胞增殖影响不显著。因此，从实验操作方便性考虑，后续的实验选择多糖的预处理时间为24h。

2.2 海带多糖对VSMC细胞生长形态的影响

由图1可知，模型组细胞密度大、呈梭状生长，且细胞透光性好。海带多糖实验组则可观察到细胞收缩变圆，且细胞生长密度和透光性均降低。当VSMC细胞经1mg/mL和2mg/mL海带多糖WPS-1处理后，大量细胞收缩变圆，细胞胞质减少、体积缩小，并可见脱落细胞。由此可以，海带多糖WPS-1影响bFGF诱导的VSMC细胞生长。

a

b

c

d

e

a. 模型组；b. 0.1mg/mL海带多糖实验组；c. 0.5mg/mL海带多糖实验组；d. 1mg/mL海带多糖实验组；e. 2mg/mL海带多糖实验组。图2同。

图 1 海带多糖对VSMC细胞形态的影响(×100)

Fig.1 Morphology of VSMC treated with Laminaria japonica polysaccharide (×100)

为了进一步观察海带多糖WPS-1对VSMC细胞生长的影响，本实验采用Hoechst 33258荧光染料进行细胞染色，结果如图2所示，模型组VSMC细胞核呈圆形或椭圆形，荧光分布均匀，细胞呈分散态生长。海带多糖实验组VSMC细胞荧光分布不均，呈聚集生长状态，随着多糖作用质量浓度的增高，聚集态细胞数量逐渐增多。其中1mg/mL和2mg/mL海带多糖实验组VSMC细胞荧光强度不均，局部呈致密浓染，核染色质出现凝聚、边缘化等凋亡细胞核形态特征。上述实验结果表明，在WPS-1作用下，VSMC细胞形态发生显著改变，典型的VSMC梭状生长形态改变，细胞呈现凋亡趋势。Hoechst 33258染色结果进一步显示，高质量浓度的海带多糖WPS-1诱导VSMC细胞呈现凋亡细胞形态特征。

a

b

c

d

e

图 2 海带多糖诱导VSMC细胞凋亡(×200)

Fig.2 Pro-apoptotic effect of Laminaria japonica polysaccharide on VSMC (×200)

2.3 海带多糖对VSMC细胞周期的影响

a. 模型组；b. 0.5mg/mL海带多糖实验组；c. 2mg/mL海带多糖实验组。

图 3 海带多糖对VSMC细胞周期分布的影响

Fig.3 Effect of Laminaria japonica polysaccharide on cell cycle distribution in VSMC

由图3可知，2mg/mL海带多糖实验组VSMC细胞可检测到凋亡峰(sub-G1)，其细胞凋亡率为6.61%，进一步证实海带多糖WPS-1诱导VSMC细胞凋亡。VSMC细胞周期分布分析结果表明海带多糖实验组与模型组VSMC细胞各周期分布存在显著差异。与模型组细胞周期分布百分比相比，海带多糖实验组细胞G0/G1期百分比降低，S期百分比升高，G2/M期百分比则变化不明显。其中0.5mg/mL多糖实验组细胞S期百分比约为模型组的2倍，而2mg/mL多糖实验组细胞S期百分比则升高至42.14%，约为模型组的4倍。实验结果表明，海带多糖WPS-1诱导VSMC细胞发生S期阻滞，使得VSMC细胞无法完成有丝分裂，从而抑制VSMC细胞增殖。

2.4 海带多糖对VSMC细胞凋亡相关蛋白表达的影响

组别

a. VSMC细胞Bax和Bcl-2蛋白的表达；b. VSMC细胞Bax和Bcl-2蛋白的相对表达量；*. 与模型组相比，有显著性差异(P＜0.05)。

图 4 海带多糖对VSMC细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响(

x

±s，n=3)

Fig.4 Effect of Laminaria japonica polysaccharide on the expressions of Bcl-2 and Bax in VSMC (

x

±s，n=3)

VSMC细胞凋亡相关蛋白表达检测结果(图4)表明，海带多糖实验组VSMC细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达量显著低于模型组，且随着多糖质量浓度升高，VSMC细胞抗凋亡蛋白表达量逐渐降低。相反地，海带多糖实验组VSMC细胞促凋亡蛋白Bax表达量比模型组高(图4a)。采用Bio-Rad图像处理软件分析各条带，以模型组抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表达量为标准，计算多糖实验组VSMC细胞Bax和Bcl-2蛋白相对表达量(图4b)。结果表明，2mg/mL 海带多糖WPS-1作用下，VSMC细胞促凋亡蛋白Bax相对表达量值为1.178，抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达量值为0.721。0.5mg/mL海带多糖WPS-1作用下，Bax和Bcl-2的相对表达量与模型组相比则变化不显著，其相对表达量值分别为1.056和0.995。各实验组VSMC细胞Bax/Bcl-2比率计算结果显示，2mg/mL和0.5mg/mL WPS-1作用下，VSMC细胞Bax/Bcl-2比率分别为1.634和1.061。说明海带多糖WPS-1对VSMC细胞凋亡相关蛋白的调控结果是上调促凋亡蛋白Bax表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，使得Bax/Bcl-2比率升高。

3 讨 论

VSMC细胞是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分，有研究发现，在动脉粥样硬化病变早期，血管中膜层VSMC细胞过度增殖并向内膜迁移，导致血管内膜层增厚，进一步引起血管壁硬化和管腔狭窄，加速血管动脉粥样硬化病变[14]。因此，对VSMC细胞增殖调控成为控制血管动脉粥样硬化发生发展的有效措施。

海带多糖是天然的活性生物大分子，具有良好的生物相容性和显著的生物学活性。多糖构效关系研究发现，多糖的单糖组成、硫酸根以及分子质量大小等均是海藻多糖生物活性的影响因素。岩藻糖是海藻活性多糖主要的单糖构成类型[15-16]。大量的研究结果表明，富含岩藻糖的海藻多糖具有抗氧化、促细胞凋亡等生物活性[17-18]。本实验所研究海带多糖的岩藻糖含量达到47%，具有抗氧化和VSMC细胞增殖抑制活性[9,13]，表明高岩藻糖含量可能是海带多糖具有VSMC细胞增殖抑制活性的关键结构影响因素之一。

本实验进一步考察了海带多糖对VSMC细胞增殖的调控作用。实验结果显示，在海带多糖作用下，VSMC细胞呈现凋亡细胞形态特征，表明海带多糖可诱导VSMC细胞凋亡。VSMC细胞凋亡机制研究发现，VSMC细胞内促丝裂素蛋白激酶活性改变，细胞周期阻滞，以及细胞凋亡相关蛋白表达量变化等因素与VSMC细胞凋亡息息相关[19-21]。前期的实验发现，海带多糖的抗氧化活性改变了VSMC细胞内对氧化还原敏感的增殖性和抑制性信号蛋白酶和转录因子活性之间的平衡[10]。本实验继续考察海带多糖对VSMC细胞周期和Bcl-2凋亡蛋白表达的影响。流式细胞周期分析结果表明，海带多糖诱导VSMC细胞发生S期细胞阻滞。Bcl-2家族蛋白是细胞线粒体凋亡通路的关键因子，Western blotting实验结果表明，海带多糖实验组VSMC细胞Bax/Bcl-2比率发生显著变化，提示海带多糖可能通过线粒体通道诱导细胞凋亡。

综上所述，海带多糖通过诱导细胞凋亡调控VSMC细胞增殖，其凋亡机制可能与其调控细胞周期及Bcl-2凋亡相关蛋白表达有关。但海带多糖诱导VSMC细胞凋亡通路及相关分子信号转导机制仍有待于进一步的深入研究。

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