薏苡仁醋的醋酸发酵工艺条件响应面法优化

王 颖1，阚建全1,*，余义筠2，郭克娜1

(1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆 400715；2.重庆君亲食品有限公司，重庆 400700)

摘 要：以薏苡仁发酵酒为原料，筛选醋酸菌菌种，并在单因素试验基础上，运用响应面法对薏苡仁醋的醋酸发酵工艺条件进行优化研究。结果表明：选择醋酸杆菌AS1.41作为发酵菌种；响应面优化的最佳工艺条件为装液量20%、发酵温度30℃、发酵时间5.5d、初始pH4.2、初始酒精度7.5%、醋酸菌接种量12.60%；在此条件下发酵得到的薏苡仁醋的醋酸产量为6.76g/100mL，醋香浓郁，有薏苡仁的典型香气，口感柔和纯正。

关键词：薏苡仁醋；响应面法；醋酸发酵；工艺参数

Optimization of Acetic Fermentation Process for Semen Coicis Vinegar by Response Surface Methodology

WANG Ying1，KAN Jian-quan1,*，YU Yi-jun2，GUO Ke-na1

(1. Key Laboratory of Products Processing and Storage of Chongqing, Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for
Agro-products Preservation(Chongqing), Ministry of Agriculture, College of Food Science, Southwest University,

Chongqing 400715, China；2. Junqin Food Co. Ltd. of Chongqing, Chongqing 400700, China)

Abstract：This study reports on the optimization of acetic acid fermentation for semen coicis vinegar using response surface methodology. Results indicated that Acetobacter AS1.41 was selected as fermentation bacteria. The optimal fermentation conditions were 20% medium volume in a 250-mL conical flask, fermentation temperature of 30 ℃, fermentation time of 5.5 d, initial pH 4.2, initial alcohol degree of 7.5% and inoculum (acetic acid bacteria) amount of 12.60%. Under these conditions, acetic acid content was 6.76 g/100 mL in the pearl barley vinegar obtained. It had a typical aroma of coix seed and a soft and pure taste.

Key words：pearl barley vinegar；response surface methodology；acetic acid fermentation；process parameters

中图分类号：TS264.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0292-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321058

薏苡(Coix lacryma-jobi)为禾本科植物，其成熟干燥的种仁称之为薏苡仁。薏苡仁是各种营养丰富均衡的药食兼用的谷物，含蛋白质、多种氨基酸、维生素、矿物质和薏苡素等，被誉为“世界禾本科植物之王”[1]。现代药理研究表明，薏苡仁具有抗肿瘤、增强免疫、降血糖和抗炎活性[2-4]。薏苡主产福建、辽宁、广西、贵州等地，资源十分丰富[5]。国内外以薏苡仁作为医药、食品及轻工业的原材料，需求正不断增加。

目前，关于薏苡仁的深加工研究比较多，如薏苡仁保健酸奶[6]、薏苡仁保健酒[7]、薏苡仁大麦复合茶饮料[8]、薏苡仁口服液[9]等。但是市场上薏苡仁的精深加工制品却很少。薏苡仁难以熟化，烹饪困难的特点限制了其消费量，所以开发薏苡仁深加工产品成了必然趋势。薏苡仁淀粉含量高，易于发酵成醋。本实验采用响应面法优化薏苡仁醋的醋酸发酵工艺条件，制作薏苡仁保健醋。制得的薏苡仁醋不仅保留了薏苡仁的营养成分，又具有醋的风味和口感，使消费者更易接受同时扩大消费领域，也为薏苡仁产品的精深开发开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料、菌种与试剂

薏苡仁酒液(酒精度8.0%，pH 4.05) 本实验室自制。

醋酸杆菌SICC1.41、SICC1.42 四川省工业菌种保藏中心；巴氏醋酸菌巴氏亚种AS1.41(Acetobacter rancens var. turbidans) 中国科学院菌种中心；醋酸菌B1、B2 西南大学食品科学学院实验室保存。

酵母膏、琼脂 天津市大茂化学试剂厂；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HZ-9211K恒温振荡培养器 太仓市科教器材厂；SW-CJ-IFD无菌工作台 苏州安泰空气技术有限公司；HH.BLL.600-S电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；HH-6数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 薏苡仁醋的发酵工艺流程和操作要点

α-淀粉酶 糖化酶 酵母液

↓ ↓ ↓

薏苡仁→粉碎→糊化→液化→糖化→酒精发酵→过滤→醋酸发酵→陈酿→杀菌→成品

↑

醋酸菌活化液

操作要点：将薏仁酒按体积分数20%的装液量装入150mL的锥形瓶中，加棉塞。调节初始pH值为4.0，初始酒精度为8%，按体积分数15%的接种量接入醋酸菌活化液，置于30℃的振荡培养箱中摇床培养。

1.3.2 醋酸菌的活化和筛选

将醋酸菌活化培养基制成斜面，接入醋酸菌，在30℃条件下培养24h。然后按每10mL接入1环菌的比例把醋酸菌接入液体活化培养基，该培养基装液量≤20%，用棉塞封口，在30℃条件下的恒温振荡培养箱中以200r/min的转速振荡活化2d(总酸度应达到2g/100mL以上)[10-11]。

依次将AS1.41、SICC1.41、SICC1.42、B1、B2菌种活化液(其菌浓约为1×107CFU/mL)按15%的接种量接入装有50mL酒液的250mL的锥形瓶中，置于30℃、转速为200r/min的恒温振荡培养箱中培养，每24h测定1次酸度，直到连续两次测定酸度不再变化为止。并进行感官评定。

1.3.3 薏苡仁醋的醋酸发酵条件优化

1.3.3.1 单因素试验

在前期预实验基础上，以原料装液量、初始pH值、发酵温度、初始酒精度、醋酸菌接种量5个影响因素进行单因素试验。以选出影响较大的因素进行响应面试验，以醋酸产量为测定指标，所有试验均重复3次。

1.3.3.2 响应面试验设计

在单因素试验分析结果的基础上，采用四因素三水平的Box-Behnken响应面设计方法[12-14]，以发酵初始pH值、菌种接种量、发酵时间和初始酒精度这4个影响较大的因素进行响应面试验，以醋酸产量为指标进行优化，所有试验均重复3次。

1.3.4 指标测定及计算方法

1.3.4.1 基础指标测定

pH测定：用pH计测定；酒精度测定：酒精比重计法，按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]的方法测定。

醋酸产量的测定[16]：取1mL的发酵液于150mL锥形瓶中，加入蒸馏水20mL，用0.1mol/L的NaOH标准溶液进行电位滴定至pH8.2，并计算醋酸产量。

式中：X为样品中醋酸产量/(g/100mL)；c为NaOH标准溶液的浓度/(mol/L)；V0为空白实验消耗NaOH标准溶液的体积/mL；V1为样品滴定时消耗NaOH标准溶液的体积/mL；V为吸取样品的总体积/mL；0.06为1mol NaOH相当于醋酸的质量/mg。

1.3.4.2 薏苡仁醋的感官评定方法

由10人组成感官评定小组对薏苡仁醋进行感官评定，感官评定人员要求身心健康、经过一定的训练和具有良好的表达能力。感官评价标准见表1。将50mL试样盛于透明一次性杯子中，感官评定薏苡仁醋色泽、香气、滋味、体态和典型性5项，每项去掉一个最高分和一个最低分，求取平均值，5项相加得最后感官评定值[17]。

表 1 薏苡仁醋的感官评价指标

Table 1 Criteria for sensory evaluation of semen coicis vinegar

1.4 数据处理方法

利用Excel2007处理软件对单因素试验数据进行处理和分析。采用Design-Expert软件(Version 7.1 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA)对响应面试验得到的数据进行线性回归和方差分析。

2 结果与分析

2.1 醋酸菌的筛选结果

图 1 不同醋酸菌的产酸能力比较

Fig.1 Comparison of different bacteria strains on acetic acid production

由图1和表2可知，从5种醋酸菌菌种的产酸能力和感官评分来看，AS1.41的产酸性能最强，感官评分也最高，其发酵的醋具有薏仁典型香气、醋香浓郁、醋味柔和、绵软爽口。故选用醋酸菌AS1.41作为醋酸发酵的菌种。

表 2 不同醋酸菌种发酵结果的感官评分

Table 2 Sensory evaluation scores of acetic acid fermentation with different bacterial strains

据资料[18-19]介绍，AS1.41醋酸菌是巴氏醋酸菌巴氏亚种，属于恶臭醋酸杆菌浑浊变种，是我国生产上最常用的菌种之一。

2.2 醋酸发酵工艺条件的单因素试验结果

2.2.1 初始pH值对薏苡仁醋酸发酵的影响

图 2 不同初始pH值对薏苡仁醋酸发酵的影响

Fig.2 Effect of initial pH on acetic acid fermentation

由图2可知，pH值为3.0和5.5时，发酵产酸的速率较慢，最终的产酸量也低于其他样品。其原因是pH值过高或过低会抑制醋酸菌的生长。当pH值在3.5～4.5之间时，产酸速率较快，产醋酸量较多，感官评分也较高，所以初步选定pH值在3.5～4.5为较佳发酵的初始pH值。

2.2.2 接种量对薏苡仁醋酸发酵的影响

图 3 不同接种量对薏苡仁醋酸发酵的影响

Fig.3 Effect of inoculum amount on acetic acid fermentation

醋酸菌的接种量对发酵速度和醋酸产生量均有一定的影响，接种量越大，发酵速率和产酸量会相应提高，但是当接种量过大，达到18%～20%时，发酵液中的营养物质过多的用于醋酸菌细胞的增殖上，使得用于生成醋酸的底物减少，产酸量会有所下降；若接种量过小(＜10%)，醋酸发酵速率慢、发酵不充分、产酸量低。由图3可知，接种量在8%和10%时产酸量较少，产酸速率慢，接种量达到18%时，发酵1～3d产酸速率快，但是从第3天开始到发酵结束，产酸速率变慢，总产酸量只有4.45g/100mL。接种量在12%～16%之间，产酸速率快，产醋酸量较大。故初步选择接种量为12%～16%。

2.2.3 初始酒精度对薏苡仁醋酸发酵的影响

图 4 不同初始酒精度对薏苡仁醋酸发酵的影响

Fig.4 Effect of initial alcohol content on acetic acid fermentation

理论上来说，酒精度越高，说明酒精产量越大，产酸也应该越多，但是过高的酒精度会对醋酸菌的生长繁殖有抑制作用，就难以产生醋酸。由图4可知，在9%的酒精度条件下，产酸量较少，产酸速率慢；当初始酒精度为4%时，总产酸量也少，只有4.32g/100mL。酒精度在6%～8%时，发酵初期产酸速率较快，在5d时达到最大产酸量，发酵时间合适。故选择酒精度6%～8%。

2.2.4 装液量对薏苡仁醋酸发酵的影响

图 5 不同装液量对薏苡仁醋酸发酵的影响

Fig.5 Effect of medium volume on acetic acid fermentation

醋酸菌是好氧菌，装液量越多，基质中的溶氧量越少，醋酸菌因得不到足够的氧气使醋酸发酵缓慢，产酸量减少，从而导致感官品质下降。由图5可知，装液量在20%时，发酵产生的醋酸最多，产生速率也最快，其他情况下产酸较少，速率也较慢。所以选择20%的装液量进行醋酸发酵。

2.2.5 发酵温度对薏苡仁醋酸发酵的影响

发酵温度会直接影响醋酸菌的繁殖速度和产酸速率，发酵温度过低则发酵缓慢，醋酸产生量低；若过高，则会造成醋酸菌提前老化，从而使酒精转化率变低。由图6可知，在30℃条件下发酵，最终醋酸产量最高，为6.36g/100mL。所以，选择30℃作为最适发酵温度。

图 6 发酵温度对薏苡仁醋酸发酵的影响

Fig.6 Effect of temperature on acetic acid fermentation

2.3 薏苡仁醋酸发酵工艺条件的响应面优化试验研究

2.3.1 响应面试验设计及结果

表 3 Box-Behnken响应面试验设计方案及结果

Table 3 Box-Behnken experimental design matrix and experimental results

响应面优化试验结果见表3。以发酵时间(A)、初始pH值(B)、初始酒精度(C)、醋酸菌种接种量(D)为自变量，薏苡仁醋酸产量(Y)为因变量，通过软件分析，得到优化后的响应值的动态参数方程：

Y=6.62＋0.37A＋0.14B＋0.36C＋0.24D＋0.19AB＋0.79AC－0.49AD＋0.17BC＋0.39BD＋0.65CD－1.29A2－1.52B2－1.53C2－0.97D2

2.3.2 回归模型方差分析

表 4 醋酸产量回归模型方差分析

Table 4 Analysis of variance for the fitted regression equation

注：变异系数为0.7969，**. P＜0.01，表示差异极显著；*. P＜0.05，表示差异显著。

F检验反映的是回归模型的有效性，包括失拟性检验和回归方程显著性检验。由方差分析表4可见，该模型的P＜0.0001，表明该模型极显著；失拟项在α=0.05水平上不显著(P=0.2558＞0.05)。因变量与所考察自变量之间的线性关系显著(R2=0.9600)，模型调整复相关系数R2Adj= 0.9199，说明建立的模型能理解响应值变化的91.99%，模型的拟合程度较好。说明试验结果可靠，本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测。

由回归方程系数显著性检验可知，模型的一次项A和C影响极显著(P＜0.01)，D影响显著(P＜0.05)，B影响不显著(P＞0.05)；二次项影响均极显著(P＜0.01)；交互项AB和BC影响不显著(P＞0.05)，AD和BD影响显著(P＜0.05)，AC和CD影响极显著(P＜0.01)。对一次项回归系数的绝对值大小进行比较可知，影响薏苡仁醋发酵过程的因素作用大小为：A＞C＞D＞B，即发酵时间＞初始酒精度＞接种量＞初始pH值。

经软件Design Expert 7.0优化，分析得到薏苡仁醋酸发酵的最佳工艺条件为：发酵时间5.34d、初始pH 4.19、初始酒精度7.37%、醋酸菌接种量12.60%。

2.3.3 验证实验

为检验实验结果与真实情况的一致性，对上述优化条件进行验证实验。同时考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：发酵时间5.5d、初始pH4.2、初始酒精度7.5%、醋酸菌接种量12.60%，在此条件下进行3次平行实验，得到实际薏苡仁醋酸产量为6.76g/100mL，与理论预测的最大值6.94g/100mL相差不大。因此，经响应面法优化所得的发酵最佳工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。

3 结 论

通过单因素和Box-Behnken响应面试验，利用统计学的方法建立了薏苡仁醋发酵条件的二次多项式模型：Y=6.62＋0.37A＋0.14B＋0.36C＋0.24D＋0.19AB＋0.79AC－0.49AD＋0.17BC＋0.39BD＋0.65CD－1.29A2－1.52B2－1.53C2－0.97D2。最佳发酵工艺条件为：巴氏醋杆菌巴氏亚种AS1.41作为薏苡仁醋的发酵菌种，发酵时间为5.5d、初始pH值为4.2、初始酒精度为7.5%、醋酸菌接种量为12.60%。在本实验范围内建立的模型准确有效，可用来预测设定条件范围内及其周围的薏苡仁醋发酵工艺参数。在此条件下发酵所得薏苡仁醋的醋酸产量为6.76g/100mL，品质较好，醋香浓郁，有薏苡仁的典型香气，口感柔和纯正，是一种营养成分丰富的保健型醋，发展前景良好。

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