利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans葡萄糖脱氢酶基因及其生物信息学分析

戴宝新1,2，冯惠勇1，李天明1，刘天佳1,3，刘静文1，仪 宏1,*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050018；3.河北常山生化药业股份有限公司，河北 石家庄 050018）

摘 要：以Gluconobacter suboxydans J菌株基因组DNA为模板，基于吡咯喹啉醌附着位点的保守区域设计引物，通过交错式热不对称PCR获得编码葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH）的全长基因（gdh），并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：gdh基因全长2268bp，编码755个氨基酸，其蛋白序列与Gluconobacter属的GDH具有较高的同源性。GDH的分子质量约为81.72ku，pI值约为5.14；GDH蛋白的二级结构由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的无规则卷曲3种结构模块组成；GDH N末端的AA1～140区域有5个跨膜结构域。

关键词：葡萄糖酸；交错式热不对称PCR；弱氧化醋酸杆菌；葡萄糖脱氢酶；生物信息学

Cloning through TAIL- PCR and Bioinformatics Analysis of the Glucose Dehydrogenase Gene from

Gluconobacter suboxydans

DAI Bao-xin1,2, FENG Hui-yong1, LI Tian-ming1, LIU Tian-jia1,3, LIU Jing-wen1, YI Hong1,*

(1. College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China;

2. Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd., Shijiazhuang 050018, China;

3. Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co. Ltd., Shijiazhuang 050018, China)

Abstract: Pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQ-dependent GDH, EC1.1.5.2), which catalyzes the conversion of D-glucose to gluconic acid, is an important enzyme in the production of gluconic acid by fermentation or enzymatic method. The aim of this study was to clone and characterize the gene enconding PQQ-dependent GDH from Gluconobacter suboxydans. Primers were designed based on the conserved region of the PQQ-attaching sites, and the entire gdh gene was obtained by thermal asymmetric interlaced-PCR (TAIL-PCR). The gene was then sequenced and analyzed by bioinformatics methods. The sequence analysis suggested that its coding region consisted of 2268 bp nucleotides encoding 755 amino acids. The deduced amino acid sequence showed a high level of similarity to the PQQ-dependent GDH of Gluconobacter oxydans. The molecular weight of the encoded protein was 81.72 ku with an isoelectric point of 5.14. The bioinformatic analysis suggested that its second structure consisted of 18.41% alpha helix, 16.16% extended strand and 65.43% random coil and its N-terminal contained five transmembrane domains locating in the region between amino acid residues 1 and 140. This study indicates that TAIL-PCR provides a simple and efficient method for the cloning of the unknown genes. The bioinformatic analyses of GDH provide a foundation for further investigation on the characteristics and catalytic mechanism of GDH and its potential applications in gluconic acid production.

Key words: gluconic acid; thermal asymmetric interlaced-PCR (TAIL-PCR); Gluconobacter suboxydans; glucose dehydrogenase; bioinformatics

中图分类号：Q812 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2014)01-0194-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401038

葡萄糖酸作为膨松剂、凝固剂、螯合剂、酸味剂而广泛应用于食品、化工、水处理、建筑等行业，葡萄糖酸盐类可作为食品添加剂和营养增补剂[1-2]。葡萄糖酸和柠檬酸一样具有清爽的酸味，而且葡糖酸还稍带甜味，因此可与柠檬酸一样用在饮料中[3]。在营养增补剂、食品保鲜剂、品质改良剂等方面有广泛的应用[4]。美国、日本等国家早在20世纪50年代就开始大批量生产葡萄糖酸，目前世界葡萄糖酸的产量约为6万t，而我国总产量不足千吨，因此葡萄糖酸的生产研究具有良好的应用前景。

葡萄糖酸是葡萄糖经过简单氧化反应生成的温和有机酸，催化葡萄糖氧化的酶类有两种，一种是由真菌产生的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD，EC1.1.3.4），氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢[5]。目前，发酵法及酶法生产葡萄糖酸都采用的是黑曲霉或青霉产生的葡萄糖氧化酶，这方面的报道较多[6-10]。另种是由细菌产生的葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH，EC1.1.1.5.2），催化葡萄糖脱氢生成葡萄糖酸[11]，这种葡萄糖脱氢酶是一种单体蛋白，存在于许多氧化细菌中，如Gluconobacter oxydans、Acinetobacter calcoaceticus等[12]。1979年，Olijve等[13]发现了吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）依赖型的GDH。然而，Velizarov等[14]发现大肠杆菌中GDH没有任何的辅助因子。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）依赖型的GDH是二聚体蛋白，与PQQ依赖型的GDH没有同源性。2000年，Sode[15]、Igarashi[16]等的研究表明，依赖水溶性PQQ的葡萄糖脱氢酶可以利用定点突变技术，置换单个氨基酸提高热稳定性。弱氧化醋酸杆菌（Gluconobacter suboxydans），是一种专性需氧细菌，自身生长的营养要求低，生长速度快，属于“吃得少、产得多”的类型，利用细菌生产葡萄糖酸具有产业化潜力，但是有关Gluconobacter suboxydans产生的GDH还未见报道。

本实验利用氨基酸保守序列分析和交错式热不对称PCR（thermal assymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR），从氧化醋酸杆菌中获得PQQ依赖型的GDH基因的全序列，并对该基因序列及蛋白序列进行生物信息学分析，为进一步研究葡萄糖脱氢酶的性质、催化机制以及在葡萄糖酸生产上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

弱氧化醋酸杆菌（Gluconobacter suboxydans）J 河北科技大学生物科学与工程学院工业微生物研究室保藏。

限制性内切酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA分子质量标准 大连宝生物工程公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株J基因组DNA的提取

将菌株J在固体平板上培养48h，收集菌体，按细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取菌体J总DNA。

1.2.2 编码GDH的基因（gdh）保守片段的克隆

根据GenBank中记录的Gluconobacter oxydans 621H的基因组（CP000009.1）基因序列，分析PQQ附着位点的保守区域，设计引物GDH1F、GDH2F、GDH3F、GDH4F、GDH5F、GDH6F、GDH9F、GDH1R、GDH2R、GDH3R，引物序列见表1。通过各上、下游引物的组合，进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性4min，94℃、30s，52℃、30s，72℃、2min，32个循环，72℃延伸10min。PCR扩增产物纯化后，TA克隆于pEasy-T1载体。

表 1 实验中所用引物序列

Table 1 Primer sets used in this study

1.2.3 gdh基因全序列的克隆与分析

1.2.3.1 TAIL-PCR的引物序列

根据已克隆并测序的菌株J的gdh，设计2组3条特异性巢式引物，5’端3个向外的特异性引物为GHR1、GHR2、GHR3，3’端3个向外的特异性引物GHF1、GHF2、GHF3，引物序列见表1。8个随机引物（简称RAPD1,RAPD2,…,RAPD8）为生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3.2 TAIL-PCR扩增

表 2 3’端和5’端特异性引物的TAIL-PCR反应程序

Table 2 3’-terminus and 5’-terminus-specific PCR primers used for TAIL-PCR

以菌体J基因组DNA为模板，在25μL体系中以GHF1与随机简并引物（RAPD1,RAPD2,…,RAPD8）分别配对，进行第1次PCR扩增，所得产物稀释50倍后取1µL作模板，以GHF2和相应的RAPD引物开始第2次PCR扩增；所得产物稀释50倍后取1µL作为模板，以GHF3和相应的RAPD引物进行第3次PCR扩增。采用同样的方法，以GHR1、GHR2、GHR3为引物，使用随机简并引物，进行TAIL-PCR反应，反应程序见表2，以0.8g/100mL琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小。

1.2.3.3 序列分析

使用DNAClub软件分析核苷酸序列中的开放阅读框（open reading frame，ORF），推导编码的氨基酸序列。使用DNASTAR软件绘制不同来源的GDH的进化树。利用在线软件ExPASY Proteomics Server compute PI/Mw tool（http://web.expasy.org/compute_pi/）分析GDH的分子质量和等电点。使用Network Protein Sequence Analysis在线软件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl）分析蛋白的二级结构，利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线软件进行跨膜区分析。

2 结果与分析

2.1 gdh基因保守区中间片段的克隆

由图1可知，根据在NCBI上Gluconobacter oxydans 621H的基因组（CP000009.1）氨基酸序列分析，PQQ附着位点的保守区域大约在AA190～510之间，根据保守区域内的氨基酸序列，反推出保守区内的碱基序列，以此为根据设计上游引物：GDH1R、GDH2R、GDH3R，设计下游引物：GDH1F、GDH2F、GDH3F、GDH4F、GDH5F、GDH6F。

图 1 Gluconobacter oxydans 621H的GDH氨基酸序列保守域分析

Fig.1 Analysis of the conserved domains of the amino acid sequence of GDH of Gluconobacter oxydans 621H in NCBI

M. DNA Marker；1～17为PCR扩增产物。

图 2 GDH保守片段PCR扩增产物

Fig.2 PCR amplification products of conservative GDH fragment

将引物进行两两配对，分别进行PCR扩增，在0.8g/100mL琼脂凝胶上各取3µL PCR产物电泳（图2），结果表明，在第2、3、4、6、7、8、9、11、12、13泳道都有单一条带，选取PCR扩增产物最长的片段，即第8、11泳道产物，纯化后进行TA克隆，获得GDH中间部分片段。

2.2 TAIL-PCR扩增N端和C端基因序列

以菌株J基因组为模板，5’端3个向外的特异性引物为GHR1、GHR2、GHR3，与8个随机引物按反应程序进行3次PCR扩增。3’端3个向外的特异性引物GHF1、GHF2、GHF3分别与8个随机引物按反应程序进行3次PCR扩增。在0.8g/100mL琼脂凝胶上各取TAIL-PCR第2次和第3次扩增产物3µL电泳。由图3可知，3’端特异性引物与试剂盒中随机引物RAPD1和RAPD3得到的扩增结果与预期结果相同，第3次的PCR扩增产物比第2次的PCR扩增产物小100bp；5’端特异性引物与试剂盒中随机引物RAPD1与RAPD2、RAPD4得到的扩增结果与预期结果相同，第3次的PCR扩增产物比第2次的PCR扩增产物小100bp。将第3次PCR产物经回收纯化后，将其连接到pEasy-T1载体上进行TA克隆，进行测序。

M. DNA Marker；1、3、5、7为3’端的第3次PCR扩增产物；2、4、6、8为3’端的第2次PCR扩增产物；11、13、15、17、19为5’端的第3次PCR扩增产物；12、14、16、18、20为5’端的第2次PCR扩增产物。

图 3 TAIL-PCR扩增N端和C端基因序列产物

Fig.3 TAIL-PCR amplification products of the C-terminus and N-terminus

2.3 gdh全基因序列分析

将3段基因测序结果拼接，得到gdh全序列。在NCBI上分析已测得的菌株gdh基因的序列，结果表明ORF长度为2268bp，编码755个氨基酸。核酸BLAST分析表明，克隆的gdh序列与Gluconobacter oxydans 621H的gdh基因（cp000009.1）有较高的同源性为83%，与
G. oxydans的gdh基因（X32710.1）的同源性为82%。氨基酸BLAST分析表明，克隆的GDH序列与Gluconobacter oxydans 621H（YP_190704.1）的氨基酸同源性为87%，与Gluconobacter morbifer G707（ZP_09094391.1）的同源性为85%，与Gluconobacter oxydans（CAA44594.1）的同源性为85%，与Gluconacetobacter xylinus NBRC 3288（YP_004867379.1）的同源性为58%，与Gluconacetobacter europaeus LMG 18494（ZP_08901745.1）的同源性为59%。根据菌株J的GDH基因的ORF编码氨基酸序列，利用DNASTAR软件的MegAlign绘制不同来源的GDH的进化树，结果见图4。

图 4 利用DNASTAR 软件绘制的不同来源的GDH进化树

Fig.4 Phylogenetic tree constructed on the basis of ghd gene sequences by neighbor joining using the software DNASTAR

利用在线软件ExPASy Proteomics Server compute PI/Mw tool （http://web.expasy.org/compute_pi/）预测菌株J的GDH分子质量约为81.72ku，等电点pI值约为5.14。

使用Network Protein Analysis在线软件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl）分析蛋白的二级结构。克隆的gdh所编码的蛋白的二级结构由18.41%的
α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的无规则卷曲3种结构模块组成。

利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线软件进行了跨膜区分析，结果表明，GDH的N末端有5个明显的跨膜区结构，分别为AA7～29、AA39～56、AA61～83、AA116～138，膜外蛋白区为AA30～38、AA84～86、AA139～755，膜内蛋白区为AA1～6、AA110～115。

3 结 论

TAIL-PCR是一种染色体步移技术，用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该方法因其简单、高特异性、高效、高灵敏及快速等优点，而成为一种扩增基因侧翼序列的有效方法[17-19]。本实验基于保守序列分析，采用改进的TAIL-PCR成功地从Gluconobacter suboxydans克隆了1个新的PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶基因，GenBank、Swiss-prot等数据库中都未见报道。通过生物信息学分析，该基因与Gluconobacter oxydans 621H及Gluconobacter frateurii NBRC 101659的氨基酸的同源性较高；氨基酸序列与NCBI中报道的葡萄糖酸杆菌属的GDH具有一定同源性。利用软件分析的理论分子质量为81.72ku，与Ameyama等[20]报道的Gluconobacter suboxydans的GDH 83ku相接近。利用软件分析的二级结构表明GDH蛋白的二级结构由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的无规则卷曲3种结构模块组成，其N末端的AA1～140区域共有5个跨膜结构，其余氨基酸序列处于膜外部。Satoshi等[21]报道PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶A型酶的N末端为跨膜区，本研究的分析结果与此报道基本一致。综上所述，GDH基因全序列的克隆以及核酸序列、蛋白序列及初步结构分析的信息，为进一步研究葡萄糖脱氢酶的性质、蛋白结构、催化机制以及在葡萄糖酸生产上的应用提供参考。

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