北虫草固态发酵产虫草素培养基优化

顾冬艳，尹永祺，杨润强，顾振新*

(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)

摘 要：优化北虫草固态发酵培养基以提高菌丝体中虫草素产量。通过单因素试验和正交试验，以虫草素产量为指标，研究培养基基质、液料比、营养液中碳源、氮源和金属离子对虫草素产量的影响并对其进行优化。结果表明：北虫草固态发酵的最佳培养基组成为大豆粉与麦麸质量比4:1、液料比39:30(V/m)及营养液中葡萄糖10g/L、牛肉膏2g/L、硫酸锰0.3g/L，在此条件下虫草素产量达5499.12µg/g。

关键词：虫草素；北虫草；固态发酵；培养基

Optimization of Medium Constituents for Cordycepin Production by Cordyceps militaris in Solid State Fermentation

GU Dong-yan，YIN Yong-qi，YANG Run-qiang，GU Zhen-xin*

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract：The medium constituents for producing celium cordycepin by Cordyceps militaris in solid state fermentation were optimized. The effects of medium matrix, liquid/solid ratio, carbon sources, nitrogen sources and metal ions in nutrient solution on the yield of cordycepin were studied by single factor and orthogonal array design methods. Results suggested that the optimal medium constituents were soybean meal/wheat bran ratio of 4:1, liquid/solid ratio of 39:30, glucose concentration of 10 g/L, beef extract concentration of 2 g/L and manganese sulfate of 0.3 g/L in nutrient solution. Under these conditions the yield of cordycepin was 5499.12 µg/g.

Key words：cordycepin；Cordyceps militaris；solid state fermentation；medium

中图分类号：TS264.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0254-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321051

北虫草(Cordyceps militaris L.)又名北冬虫夏草、蛹虫草，与冬虫夏草同属异种[1]。北虫草富含虫草素、腺苷、虫草多糖、虫草酸、麦角固醇和甾体等，其中虫草素为其特征功能成分，具有抗肿瘤[2-3]、抗菌[4]、抗病毒[5]、降血脂[3]、清除自由基[6]等多种药理作用。因此，开发富含虫草素的营养保健食品成为研究的热点。目前，人们主要通过从北虫草子实体或菌丝体中提取纯化虫草素，随后将其作为功能成分添加至食品中，然而虫草素提取率低且纯化工艺繁杂导致虫草素保健食品价格昂贵，因此，有必要开发一种新型生产工艺以降低虫草素类保健食品的生产成本。

利用可食性基质固态发酵北虫草获得富含虫草素的菌丝体，将培养基粉碎并作为辅料添加至发酵原料中共同发酵，生产富含虫草素的功能保健食品，从而避免虫草素的提取纯化工序降低生产成本。本实验对虫草素固态发酵阶段进行研究，以培养基中虫草素产量为指标，优化北虫草固态发酵培养基组分，以期为虫草素类功能食品的工业化生产工艺提供部分技术参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

北虫草菌株CM-3由南京农业大学农产品加工实验室保藏。

玉米、小麦、大豆、大米 市售食品级；发芽糙米 南京农业大学农产品加工实验室。

乙腈(色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100液相色谱仪 美国安捷伦公司；TDL-40B离心机 上海安亭科学仪器厂；LDZX-40AI型自动压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；PYX-DHS-BS型隔水电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；0.45μm水系微孔滤膜 上海安普科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基原料的筛选

分别以玉米粉、小麦粉、大豆粉、大米粉、发芽糙米粉为培养基基质，按体积比接种20%北虫草，液料比为(39:30，V/m)，于26℃静止培养8d，测定培养基中虫草素产量。

1.3.2 麦麸添加量试验

分别按大豆粉与麦麸质量比1:1、2:1、3:1、4:1和5:1作为培养基基质，接种20%北虫草，液料比为39:30，于26℃静止培养8d，测定培养基中虫草素产量。

1.3.3 液料比试验

分别按液料比30:30、39:30、48:30、57:30添加纯水于北虫草培养基中，接种20%北虫草，于26℃静止培养8d，测定培养基中虫草素产量。

1.3.4 营养液中碳源优化试验

1.3.4.1 碳源筛选试验

以大豆粉与麦麸质量比4:1作为培养基基质，液料比为39:30，营养液中分别加入20g/L的蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖和阿蜜糖，按20%接种北虫草，于26℃静止培养8d，测定固态发酵后的虫草素产量。

1.3.4.2 葡萄糖最适质量浓度试验

以大豆粉与麦麸质量比4:1作为培养基基质，液料比为39:30，在营养液中分别加入0、10、20、30、40g/L的葡萄糖，按20%接种北虫草，于26℃静止培养8d，测定固态发酵后的虫草素产量，确定葡萄糖添加量。

1.3.5 营养液中氮源优化试验

1.3.5.1 氮源筛选试验

以大豆粉与麦麸质量比4:1作为培养基基质，液料比为39:30，营养液中分别加入10g/L的酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、氯化铵，按20%接种北虫草，于26℃静止培养8d，测定固态发酵后的虫草素产量。

1.3.5.2 牛肉膏最适质量浓度试验

以大豆粉与麦麸质量比4:1作为培养基基质，液料比为39:30，在营养液中分别加入0、5、10、15、20g/L的牛肉膏，按20%接种北虫草，于26℃静止培养8d，测定固态发酵后的虫草素产量，确定牛肉膏添加质量浓度。

1.3.6 营养液中金属离子优化试验

1.3.6.1 金属离子筛选试验

以大豆粉与麦麸质量比4:1作为培养基基质，液料比为39:30，营养液中分别加入0.5g/L的醋酸锌、硫酸锰、硫酸亚铁、氯化钙，按20%接种北虫草，于26℃静止培养8d，测定固态发酵后的虫草素产量，确定固态发酵培养基的最适金属离子。

1.3.6.2 硫酸锰最适质量浓度试验

以大豆粉与麦麸质量比4:1作为培养基基质，液料比为39:30，在营养液中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L的硫酸锰，按20%接种北虫草，于26℃静止培养8d，测定固态发酵后的虫草素产量，确定硫酸锰添加质量浓度。

1.3.7 正交试验优化

采用三因素三水平正交试验，考察营养液中葡萄糖、牛肉膏、硫酸锰质量浓度3个因素对培养基中虫草素产量的影响。

1.4 指标测定

培养基中虫草素产量测定参照Li等[7]方法并加以改进，将长满北虫草菌丝体的培养基置50℃烘箱烘干至恒质量，粉碎过100目筛。取0.5g培养基，以料液比1:10添加去离子水，于50℃超声波中超声提取60min后，10000r/min
离心10min，将上清液用去离子水定容至10mL，取1mL用0.45μm滤膜过滤，滤液用安捷伦1200液相色谱测定。色谱柱为Zorbax NH2柱(4.6mm×250mm，5μm)，进样量20μL，流速0.6mL/min，检测温度25℃，检测波长254nm。流动相A为乙腈，B为10mmol/L醋酸铵，采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～5min，0～15% B；5～25min，15%～20% B；25～35min，20%～40% B；35～45min，40%～80% B；45～50min，80% B。

2 结果与分析

2.1 培养基基质对虫草素产量的影响

小写字母不同表示处理间差异显著(P＜0.05)。下同。

图 1 培养基基质对虫草素产量的影响

Fig.1 Effects of raw material in medium on cordycepin yield

由图1可知，以大豆粉作为培养基原料时，虫草素产量显著增加，是发芽糙米培养基的19倍，以玉米、小麦和大米作为培养基时虫草素产量差异不显著，确定大豆作为虫草素固态发酵培养基基质。

2.2 麦麸添加量的确定

由图2可知，随着麦麸量的减少，虫草素产量呈先显著上升后显著下降趋势，在大豆粉与麦麸质量比为4:1时虫草素产量最高达3366.05µg/g，因此，大豆粉与麦麸质量比为4:1。

图 2 大豆粉和麦麸的配比对虫草素产量的影响

Fig.2 Effects of soybean meal/wheat bran ratio on cordycepin yield

2.3 液料比的确定

图 3 液料比对虫草素产量的影响

Fig.3 Effects of liquid/solid ratio on cordycepin yield

由图3可知，在液料比为39:30时北虫草产虫草素产量最高，为3325.85μg/g，之后随着液料比增加，虫草素产量显著下降。由此可见，液料比为39:30为宜。

2.4 营养液中碳源优化试验结果

2.4.1 碳源对虫草素产量的影响

图 4 不同碳源对虫草素产量的影响

Fig.4 Effects of different carbon sources on cordycepin yield

由图4可知，在不添加任何碳源的大豆培养基中发酵北虫草时，虫草素产量为3232.66µg/g。添加葡萄糖和乳糖后，虫草素产量发生显著变化，分别提高了47%和34%，而添加蔗糖、麦芽糖、阿蜜糖后，虫草素产量变化不显著。确定葡萄糖为营养液中最佳碳源。

2.4.2 葡萄糖质量浓度对虫草素产量的影响

由图5可知，随着葡萄糖质量浓度的提高，虫草素产量呈先上升后下降的趋势，在质量浓度20g/L时，虫草素产量最大，因此选择葡萄糖质量浓度范围为10～30g/L。

图 5 葡萄糖质量浓度对虫草素产量的影响

Fig.5 Effects of glucose concentration on cordycepin yield

2.5 营养液中氮源优化试验结果

2.5.1 氮源对虫草素产量的影响

图 6 不同氮源对虫草素产量的影响

Fig.6 Effects of different nitrogen sources on cordycepin yield

由图6可知，培养基中添加酵母膏、牛肉膏均显著提高虫草素产量，添加牛肉膏虫草素产量最高，而添加氯化铵、硫酸铵后，虫草素产量变化不显著。

2.5.2 牛肉膏质量浓度对虫草素产量的影响

图 7 牛肉膏质量浓度对虫草素产量的影响

Fig.7 Effects of beef extract concentration on cordycepin yield

由图7可知，随着牛肉膏质量浓度的提高，虫草素产量呈先上升后下降的趋势，在牛肉膏质量浓度为5g/L时，虫草素产量最高，在质量浓度为15～20g/L时，虫草素产量变化不显著。因此，选择牛肉膏质量浓度为0～10g/L。

2.6 营养液中金属离子优化试验

2.6.1 金属离子对虫草素产量的影响

由图8可知，在大豆培养基营养液中添加不同种类金属离子，对北虫草产虫草素的影响差异显著。添加硫酸锰和硫酸亚铁均能提高虫草素的产量，尤以Mn2+影响最显著，是对照的1.39倍。而醋酸锌抑制虫草素的合成，氯化钙对虫草素合成无显著影响。

图 8 不同金属离子对虫草素产量的影响

Fig.8 Effects of different metal ions on cordycepin yield

2.6.2 硫酸锰质量浓度对虫草素产量的影响

图 9 硫酸锰质量浓度对虫草素产量的影响

Fig.9 Effects of MnSO4 concentration on cordycepin yield

由图9可知，硫酸锰质量浓度为0.2g/L时，培养基中虫草素产量最高，随硫酸锰质量浓度继续增加，虫草素产量呈逐渐下降并趋于平缓趋势，因此硫酸锰的质量浓度确定为0.2～0.4g/L。

2.7 正交优化试验结果

表 1 北虫草产虫草素培养基配方的L9(34)正交试验设计及结果

Table 1 L9(34) orthogonal array design and results

由表1极差分析可以看出，影响虫草素产量的各因素的主次顺序为：葡萄糖＞硫酸锰＞牛肉膏。表2方差分析表显示，葡萄糖质量浓度和硫酸锰质量浓度对虫草素产量影响达到显著水平，因此选择在正交试验中有最大K值的水平，牛肉膏对其无显著影响。综合考虑，3个因素最佳搭配方案为A1B1C2，即葡萄糖10g/L、牛肉膏2g/L、硫酸锰0.3g/L。由于此优化组合不在9组试验中，需追加实验加以验证。

表 2 方差分析

Table 2 ANOVA for the experimental results of orthogonal array design

2.8 验证性实验

按正交试验优化的营养液进行验证实验，以确保试验的准确性。在最优组合条件下，即葡萄糖为10g/L、牛肉膏为2g/L、硫酸锰为0.3g/L，此时北虫草固态发酵产虫草素量为5499.12μg/g，而正交试验9组试验虫草素产量最高为5381.87μg/g，说明优化组合的虫草素产量高于正交试验结果中最高产量，故本研究确定的营养液组成合理可信。

3 讨 论

利用可食性基质固态发酵北虫草获得富含虫草素的菌丝体，将培养基粉碎并作为辅料添加至发酵原料中共同发酵生产富含虫草素的酱油，黄酒和醋等功能食品，避免了虫草素提取和纯化步骤，不仅简化了生产工艺且降低了生产成本。

通过对北虫草固态发酵培养基原料的筛选发现大豆培养基中北虫草产虫草素产量最高，这与彭志妮等[8]的研究结果一致，这可能是由于大豆中蛋白质产量高，因此其碳氮比低，而Mao[9]和Shih[10]等证实了低碳/氮比能够提高北虫草发酵过程中虫草素的产量。固态发酵培养基中液料比会影响基质的物理形状从而影响固态发酵的进程。本研究中虫草素产量随液料比的增加呈先增加后减少趋势，这可能是由于液料比较大，大豆粉容易凝结成团从而影响培养基中氧的传递和发酵热的散失[11]，北虫草生长受阻且其酶活下降导致虫草素产量较低，而液料比过小则会影响营养物质的溶解和传递及发酵基质颗粒的膨胀[12]，同样不利于北虫草的生长，因此适宜的液料比且添加适量的麦麸保证培养基的疏松性，有利于北虫草通气生长高产虫草素。

碳源、氮源和金属离子对北虫草产虫草素影响显著，原因可能是通过添加适量碳、氮源调整培养基的碳氮比使之更适合北虫草产虫草素，研究发现葡萄糖是最佳碳源，这与Mao[9]和Masuda[13]等的研究结果一致，北虫草利用碳源的特点为单糖明显优于二糖[14]。金属离子是微生物生成的某些酶的辅酶或激活剂，对微生物生理活动具有显著影响，低质量浓度的金属离子会刺激菌体生理活动增加，而高质量浓度则对其生理活动表现出抑制作用[15]。本研究发现硫酸锰是北虫草固态发酵产虫草素的最佳金属离子且其质量浓度为0.3g/L时虫草素产量最高。

通过单因素试验和正交试验确定北虫草固态发酵产虫草素的最佳培养基组成为：大豆粉与麦麸质量比4:1、液料比39:30、营养液中葡萄糖10g/L、牛肉膏2g/L、硫酸锰0.3g/L，在此条件下虫草素产量最高达5499.12µg/g。

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