贝类水产品中汞的形态分析

曹程明1,2，冷桃花1,*，解 楠1，宁啸骏1，周 瑶1,3

(1.上海市质量监督检验技术研究院，国家食品质量监督检验中心(上海)，上海 200233；

2.上海市质量技术监督局，上海 200233；3.华东理工大学精细化工研究所，上海 200237)

摘 要：建立贝类水产品中二价汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)分离检测方法。本方法利用C18反相高效液相色谱柱对贝类水产品中二价汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞进行分离，采用电感耦合等离子体质谱对汞元素进行检测，并利用外标法定量测定贝类水产品中各形态的汞含量。本研究优化色谱分离条件，以甲醇-乙酸铵溶液为流动相，通过梯度洗脱，4种汞形态在15min内得到了有效地分离。本方法操作简便、分离效果好、检出限低，适用于贝类水产品中有机汞的检测。

关键词：二价汞；甲基汞；乙基汞；苯基汞；高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱

Speciation Analysis of Mercury in Shellfish Muscle

CAO Cheng-ming1,2，LENG Tao-hua1,*，XIE Nan1，NING Xiao-jun1，ZHOU Yao1,3

(1. National Food Quality Supervision and Inspection Center (Shanghai), Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200233, China；2. Shanghai Municipal Bureau of Quality and Technical Supervision, Shanghai 200233, China；3. Institute of Fine Chemicals, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

Abstract：Four mercury species (inorganic mercury, methyl-mercury, ethyl-mercury and phenyl-mercury) in shellfish muscle were analyzed by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). A C18 reverse phase HPLC column was applied to separate four mercury species, and their concentrations were measured by using ICP-MS through an external standard method. The method was optimized and the four mercury species could be effectively separated within 15 min using gradient elution with methanol/ammonium acetate as the mobile phase. This developed method is simple, efficient and sensitive, which can be suitable for determination of mercury species in shellfish muscle.

Key words：inorganic mercury；methyl-mercury；ethyl-mercury；phenyl-mercury；high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry (HPLC-ICP-MS)

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0193-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322039

汞在自然界中主要以液态汞、Hg2+、Hg+、甲基汞、乙基汞和苯基汞等无机或有机的形态存在，是常见的污染物之一。由于有机汞可通过呼吸道、皮肤或消化道等途径入侵人体，且毒性较无机汞大，因此进行食品中有机汞的形态分析具有极其重要的社会意义。

目前汞的形态分析方法研究很多，有气相色谱法(gas chromatography，GC)[1]、气相色谱质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)[2]、液相色谱-原子荧光光谱法(high performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectroscopy，HPLC-AFS)[3-4]、液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry，HPLC-ICP-MS)[5]、气相色谱-电感耦合等离子体质谱法(GC-ICP-MS)[6-9]以及毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法(capillary electrophoresis-ICP-MS，CE-ICP-MS)[9-12]等。GC-MS和GC-ICP-MS法只能测定有机汞，无法同时测定无机二价汞；HPLC-AFS分析需要进行在线氧化，而氧化的效率直接影响到方法的检出限。CE-ICP-MS是一种较有效的汞形态分析方法，但CE的接口问题导致CE-ICP-MS的联机无法普及。

HPLC-ICP-MS仪是一种非常适合元素形态分析的仪器，但由于苯基汞需高比例有机相的洗脱，易造成ICP-MS熄火，因此目前应用该方法进行汞的形态分析主要集中在甲基汞和乙基汞上[13-16]。

本研究通过引入氧氩混合气为反应气，通过氧气与流动相中的有机相反应，消除高比例有机相对ICP-MS的影响，建立了利用HPLC-ICP-MS同时测定贝类水产品中二价汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞的方法，能有效消除基体对汞的干扰。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

二价汞(≥99.5%) 贵州省铜仁银湖化工有限公司化学试剂厂；甲基汞((60.2±2.3)μg/g)、乙基汞((64.7±2.4)μg/g) 北京中国计量科学研究院；苯基汞(98.0%) 德国Dr. Ehrenstorfer公司；ICP-MS调谐液(1μg/L
的Li、Y、Ce、Tl) 美国Agilent公司；贝类实际样品 上海超市随机抽取；鱼肉实物标样 国家标准物质中心；超纯水(电阻率≥18.2MΩ•cm) 美国Millipore公司；甲醇(色谱纯)、L-半胱氨酸(≥98%) 美国Sigma公司；其他化学试剂均为优级纯。

1.2 仪器与设备

7500型电感耦合等离子体质谱仪、1200高效液相色谱仪、ZORBAX SB C18反相色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)、ZORBAX XDB C18反相色谱柱(4.6mm×150mm，5μm) 美国Agilent公司；AL204型万分位电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂；超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；DMA-80测汞仪 美国Milestone公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB C18反相色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相A：0.06mol/L乙酸铵-0.1g/100mL L-半胱氨酸；B：100%甲醇；流速1mL/min；进样量20μL。

表 1 HPLC梯度洗脱程序

Table 1 HPLC gradient elution program

1.3.2 质谱条件

射频功率1380W；载气流量0.6mL/min；辅助气流量0.25mL/min；反应气(optional gas)比例20%；采样模式：时间积分；分析时间1800s。样品分析前用ICP-MS调谐液将仪器灵敏度调至大于2000cps。

1.3.3 样品前处理条件

样品处理条件参考Yan等[17]报道的文献进行，称取0.2g干样品或1.5g湿样于50mL的离心管中，加入10mL重蒸水，5mL 12mol/L浓盐酸和10mL甲苯，超声萃取25min，5000r/min离心10min，将上清液转移至另一50mL的离心管中。下层溶液加入5mL甲苯，超声萃取25min，离心，合并上清液。加入0.2g/100mL L-半胱氨酸溶液5mL超声萃取30min，离心，下层水溶液过膜进样。

1.4 数据处理

数据处理用Chromatography Data Analysis系统软件和Instrument Offline软件。

2 结果与分析

2.1 色谱分离条件的优化

2.1.1 螯合剂的选择

考虑到分离时间和分离度，本研究采用梯度洗脱，以甲醇-乙酸铵溶液为流动相，在水相中分别添加2-巯基乙醇和L-半胱氨酸，考察其对分离结果的影响。结果发现，添加螯合剂能明显改善峰形并且提高分离度(图1)；当选用2-巯基乙醇为螯合剂时，苯基汞和乙基汞出峰较好，虽然无机汞与甲基汞能够得到基线分离，但保留时间很接近，在测试样品的过程中容易因样品基质的原因产生保留时间漂移而导致分离不完全；而且2-巯基乙醇毒性大，气味难闻。当选用L-半胱氨酸为螯合剂时，4种汞形态在15min内分离完全，二价汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞的出峰时间分别为2.2、3.6、7.3min和14.2min，且L-半胱氨酸为螯合剂无毒无害。

1.无机汞；2.甲基汞；3.乙基汞；4.苯基汞。下同。

a.螯合剂的种类对分离的影响；b.螯合剂的质量浓度对分离的影响。

图 1 螯合剂及其质量浓度对汞形态分析的影响

Fig.1 Effects of chelators and their concentrations on mercury species analysis

本研究还比较不同质量浓度的2-巯基乙醇和L-半胱氨酸对分离的影响(图2)，结果发现0.1g/100mL的L-半胱氨酸和0.05g/100mL的2-巯基乙醇即可满足分离要求，继续提高浓度，分离结果未有明显变化。

2.1.2 色谱柱的选择

文献多采用C18柱分析汞化合物[18-20]。本研究分别考察50μg/L的无机汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞混合标准溶液在ZORBAX SB C18柱和ZORBAX XDB C18柱上的分离情况(图2)。以L-半胱氨酸为螯合剂时4种汞化合物在20min内均可得到基线分离，且汞化合物在SB C18的响应值明显高于XDB C18柱；而以2-巯基乙醇为螯合剂时，无机汞和甲基汞在SB C18柱上无法实现分离，但在XDB C18柱上能得到基线分离。综合考虑，本研究选择以SB C18柱，以L-半胱氨酸为螯合剂。

a.以L-半胱氨酸为螯合剂(SB C18柱)；b.以L-半胱氨酸为螯合剂(XDB C18柱)；c.以2-巯基乙醇为螯合剂(SB C18柱)；d.以2-巯基乙醇为螯合剂(XDB C18柱)。

图 2 色谱柱的选择对色谱分离的影响

Fig.2 Effect of column type on separation efficiency

2.2 样品前处理条件的优化

考虑到生物样品基体较为复杂，容易干扰样品的萃取过程，且无机汞溶于水，有机汞易溶于甲醇、乙醇、甲苯等有机溶剂，本实验分别比较了碱消解法、酸提取法、有机溶剂提取等方式，考察其对贝类水产品中无机汞和有机汞的提取效果。

2.2.1 碱消解法

李冰等[21]报道了碱消解的生物样品中甲基汞和乙基汞的回收率均大于80%，但并没有文献报道碱消解的生物样品中无机汞和苯基汞的回收率。本研究根据该样品前处理方法，采用25% KOH-甲醇溶液对样品进行消解，冷却后用盐酸酸化、二氯甲烷萃取，然后采用硫代硫酸钠溶液进行反萃取。结果表明，样品中无机汞的回收率很低，不到10%，而甲基汞和乙基汞的回收率均大于80%，苯基汞的回收率不到40%。除了采用硫代硫酸钠溶液进行反萃取，实验还根据文献[22]采用L-半胱氨酸溶液作为反萃取溶液，结果显示，甲基汞和乙基汞的回收率均达到70%以上，苯基汞回收率50%左右，但该方法对无机汞的提取效果较差，回收率不到10%。

2.2.2 酸消解法

酸消解提取法也是汞形态研究的最常用方法之一，且该消解方法主要用于无机汞、甲基汞和乙基汞的提取研究，未见苯基汞回收率的相关报道。刘丽萍等[14]报道酸消解法测定水产品中的无机汞、甲基汞和乙基汞的加标回收率大于72%。本实验采用该方法对贝类水产品中的汞化合物进行了消解，结果发现，苯基汞大部分部转化为无机汞，导致无机汞的回收率达到添加量的182%，甲基汞和乙基汞的回收率与文献报道基本一致。

研究发现，盐酸体积分数(以原盐酸为100%)对无机汞的回收率有着直接的影响，但对甲基汞和乙基汞的影响不是很明显(图3)。随着盐酸体积分数的增加，无机汞的回收率逐渐增大，至50%(V/V)的盐酸时，无机汞的回收率几乎接近100%。

图 3 酸消解过程中盐酸的体积分数对回收率的影响

Fig.3 Effect of chlorhydric acid concentration on the recovery of different mercury species

2.2.3 有机溶剂提取法

有机溶剂萃取也是研究汞形态分析的有效技术之一，且有文献报道了水样中4种汞化合物的回收率可达86.6%～111%[5]，但未见生物样品中4种汞形态化合物回收率的相关报道。

本研究根据文献[17]，采用5mol/L盐酸溶液和10mL的甲苯溶液混合超声萃取30min，比较L-半胱氨酸溶液的浓度对汞化合物反萃取效果的影响(图4)。结果显示，随着L-半胱氨酸质量浓度的提高，甲基汞和苯基汞的回收率变化不大，乙基汞在L-半胱氨酸的质量浓度达到2g/100mL时，回收率基本为0，此时无机汞的回收率却大大升高。经过综合考虑，本研究选择0.2g/100mL的L-半胱氨酸溶液为汞化合物的反萃取溶液。

图 4 L-半胱氨酸质量浓度对汞化合物回收率的影响

Fig.4 Effect of L-cysteine concentration on the recoveryof different mercury species

考虑到苯基汞的水溶性较差，实验在L-半胱氨酸溶液中添加甲醇，以提高苯基汞的回收率(图5)。结果显示，随着甲醇体积分数的增加，无机汞、甲基汞和乙基汞的回收率逐渐降低，而苯基汞的回收率基本不受甲醇的影响。

图 5 提取液中甲醇体积分数对回收率的影响

Fig.5 Effect of methanol concentration on the recovery of different mercury species

图 6 硫代硫酸钠溶液的体积分数对回收率的影响

Fig.6 Effect of sodium thiosulfate concentration on the recovery of different mercury species

由于单纯采用L-半胱氨酸溶液进行反萃取，乙基汞的回收率不稳定，而单纯采用硫代硫酸钠溶液反萃取，甲基汞、乙基汞和苯基汞的回收率较高，但无机汞的回收率为0，因此，实验考察0.2g/100mL L-半胱氨酸溶液和1.0g/100mL的硫代硫酸钠溶液混合萃取的效果。结果发现，甲基汞、乙基汞和苯基汞的回收率随着硫代硫酸钠溶液体积分数的增高，先升高，随后有所下降，但无机汞的回收率为0(图6)，实验条件考察结果表明，不添加硫代硫酸钠。

因此，本研究采用盐酸-甲苯为提取试剂、超声萃取后，用0.2g/100mL的L-半胱氨酸溶液反萃取的样品前处理方法，所得乙基汞和苯基汞的回收率大于50%，而无机汞和甲基汞的回收率均大于70%。

2.3 方法的线性范围、检出限和精密度

配制质量浓度分别为2.5、5、10、25、50、100、250、500μg/L的一系列4种汞化合物的混合标准溶液，在优化的实验条件下考察方法的线性范围，4种汞化合物在0～500μg/L质量浓度范围内线性良好，线性相关系数R2均大于0.998，标准曲线回归方程见表2。在空白样品中加入5μg/L的标准混合溶液，以3倍基线噪声测定4种汞化合物的检出限，分别为2.00、2.00、2.00μg/kg和3.73μg/kg。

表 2 汞形态的标准曲线回归方程

Table 2 Standard curve equations for mercury species

分别选择低、中、高3水平(2.5、25、50μg/L)的混合标准溶液，连续6次重复测定，低水平的RSD在10%以内，其余水平的相对标准偏差(RSD)均小于5%。

2.4 方法的加标回收率和重复性

分别向水产样品中加入3.2、16、32μg/L 3种不同水平的4种汞化合物标准溶液，各平行处理3个样品，扣除样品空白后，其中无机汞和甲基汞的加标回收率在77.4%～112.9%，乙基汞的回收率在63.4%～90.6%，苯基汞的回收率在51.9%～67.0%，其相对标准偏差除低水平添加量的RSD在10%以内，其余水平的RSD均小于5%。

2.5 实际样品的检测

对贝类水产品中的总汞水产品和鱼肉实物标样中汞形态及含量的测定结果见表3。

表 3 实际样品中总汞和汞形态化合物的测定结果

Table 3 The concentrations of total mercury and different mercury species in real samples

注：—.小于检出限。

由表3可知，利用本方法测定鱼肉实物标样中的汞形态，其回收率为108%，说明运用有机溶剂提取、HPLC-ICP-MS系统测定样品中的汞形态，结果可靠。上述结果表明，野生小淡菜和皇冠贝中甲基汞含量较其他贝类水产品中的甲基汞含量高，贝类水产品中汞的存在形式主要是甲基汞，个别样品中含有一定量的无机汞，样品中未见乙基汞和苯基汞的检出。测得贝类水产样品中汞形态的回收率均大于77%。

3 结 论

本研究采用HPLC-ICP-MS测定贝类水产品中4种汞的形态，通过对色谱分离条件和样品前处理方法的比较，选择以L-半胱氨酸为螯合剂，SB C18为色谱柱分离4种汞化合物，线性范围为0～500μg/L，线性相关系数R2大于0.998，检出限2.00～3.73μg/kg，汞化合物的RSD除低水平添加外均小于5%。本方法样品前处理简便快速、线性范围宽、精密度高、重复性好，能有效地同时处理和分析4种汞的形态，适合于贝类水产品中4种汞化合物的形态测定。

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