引起泡菜“生花”腐败微生物的分离鉴定 敖晓琳1,蔡义民2,夏 姣1,赵 珂3,蒲 彪1,张小平3 (1.四川农业大学食品学院,四川 雅安 625014;2.日本国际农林水产研究中心,日本 茨城 305-8686; 3.四川农业大学资源与环境学院,四川 成都 625014)
摘 要:从四川地区采集4种生花的泡菜样品,通过马铃薯土豆培养基(PDA)和营养琼脂培养基(NA)对生花泡菜中的微生物进行分离,共分离到不同菌落形态的菌株8株,经过回接实验验证,该8株菌均能引起泡菜不同程度腐败。8株菌通过菌落PCR扩增其16S rDNA/18S rDNA基因序列并测序,经序列比对后,构建系统发育树,结果证实8株菌中有4株为细菌,4株为酵母菌。其中3株细菌被鉴定为B.subtilis、1株被鉴定为B.altitudinis;2株真菌被鉴定为P.manshurica,1株为P.kudriavzevii,1株为C.tropicalis。 关键词:四川泡菜;腐败微生物;分离;鉴定
Isolation and Identification of Spoilage Microorganisms from Sichuan Pickles
AO Xiao-lin1,CAI Yi-min2,XIA Jiao1,ZHAO Ke3,PU Biao1,ZHANG Xiao-ping3 (1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 2. Japan International Research Center for Agricultural Sciences (JIRCAS), Ibaraki 305-8686, Japan; 3. College of Resources and Environment, Sichuan Agricultural University, Chengdu 625014, China)
Abstract:Eight spoilage microbes with different colony morphologies were isolated from four different spoiled Sichuan pickle samples by using PDA and NA media. Unspoiled samples were spoiled when artificially inoculated with these strains. They were identified as 4 bacteria including 3 B. subtilis and 1 B. altitudinis and 4 yeasts including 2 P. manshurica, 1 P. kudriavzevii and 1 C. tropicalis through PCR amplification and sequence analysis of 16S rDNA/18S rDNA and phylogenetic tree analysis. Key words:Sichuan pickles;spoilage microorganisms;isolation;identification 中图分类号:TS201.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)21-0204-05 doi:10.7506/spkx1002-6630-201321042 泡菜,尤其是四川泡菜家喻户晓,被广大消费者所喜爱。泡菜的制作过程非常简单,通常将时令新鲜多汁的蔬菜放入盐水中,通过附着在蔬菜上面的微生物发酵产生风味物质从而形成了独具特色的家常菜肴。在四川地区几乎家家都有泡菜,工业化泡菜产业也在不断兴起。由于泡菜的加工过程属于冷加工过程,较好的保存了蔬菜原有营养成分,同时经过乳酸菌发酵不仅增加了泡菜的风味,而且增加了泡菜的保健作用,使其有助于开胃健脾,增加食欲。因此发酵蔬菜制品被称为“未来的食品”[1]。 随着泡菜产业的兴起,泡菜产品的卫生安全和品质问题受到高度的重视。由于泡菜原料未经过灭菌处理,因此在后期发酵过程中一旦环境温度升高或者存放条件不利,泡菜中的腐败微生物就会大量滋生,从而导致产品的腐败变质。在泡菜品质劣变的众多显现中,“生花”是最常见的现象之一。“生花”就是在泡菜表面形成一层白膜,泡菜一旦生花之后,菜品风味发生不期待的变化(馊臭味或腐败味),泡菜坛中盐水表面形成白色成片或成碎花状的膜,菜品开始软烂,泡菜水变浑浊,轻者影响风味,重者整坛菜都不能食用。在夏秋季节由于温度较高,在家庭制作的泡菜中90%会出现不同程度的生花现象。而在商业产品中一般通过低温存放和添加防腐剂来防止生花现象的出现,但是由于条件的不可控性以及防腐剂对有益的乳酸菌的抑制效果,使得工业化泡菜的品质得不到期望的要求。本实验欲从引起泡菜生花的微生物入手,对其进行分离、回接,从而搞清楚引起泡菜腐败的主要微生物类群,通过生物防控的方式控制这些腐败微生物的生长,从而开发出富含活性益生菌的安全卫生的泡菜产品。 1 材料与方法 1.1 泡菜样品 泡菜样品采集自四川地区家庭制作的泡菜,样品均呈现不同程度的变质情况,样品来源及情况见表1。4个样品泡制的蔬菜类型都不同,但都出现了浑浊,色泽变淡,泡菜汁表面长白膜的情况。 表 1 样品来源及情况列表 Table 1 List of spoiled pickle samples
1.2 试剂与培养基 2×PCR Mix 北京天根生物科技有限公司;DNA纯化回收试剂盒 宝生物工程(大连)有限公司;所用其他生化试剂均为分析纯。 PDA培养基和NA培养基分别用于真菌和细菌的活化、培养和计数。 1.3 仪器与设备 PowerPac Basic电泳仪、1000-Series PCR仪、UVP凝胶电泳图像分析仪 美国Bio-Rad公司;PYX-DHS-60×75电热恒温培养箱 上海浦东荣丰科学仪器有限公司;PH4-C+酸度计 成都世纪方舟科技有限公司。 1.4 微生物的分离纯化 按文献[2]的方式将腐败泡菜的样液稀释至10-6后,取不同稀释度的液体均匀涂布于PDA和NA培养基中分别分离其中的真菌和细菌。分离的菌株通过菌落形态观察、染色镜检后,不同菌落形态及菌体形态的菌株被纯化后保存于15%甘油溶液中,作为供试菌株用于后续实验。 1.5 回接实验 新鲜水萝卜→清洗→晾干→切分→称质量→加入4%盐水→接种供试菌株(106CFU/mL)→发酵→结果观察和记录。以未接种指示菌的样品作为对照,接种供试菌株后发生腐败现象的,将供试菌株用于后续的鉴定。 1.6 腐败微生物的鉴定 1.6.1 DNA简单提取方法 用灭菌的牙签将少量在平板上培养18h的菌落挑入装有20μL 0.2% SDS的离心管中,在涡旋振荡仪使菌体充分分散,将离心管放入沸水煮沸5min,立即放入-20℃冰箱冷冻15min,将样品10000r/min离心1min,取上清液用于PCR扩增[3]。 1.6.2 PCR扩增和检测 真菌扩增用引物EF-3、EF-4[4];细菌扩增用引物27F、1492R[5];PCR扩增体系(25μL):PCR-mix,12.5μL;Primer(20μmol/L),各1μL;菌液0.5μL;无菌水10μL。 PCR扩增程序:预变性95℃、5min;94℃变性1min,55℃退火1.5min,72℃延伸2min,共30个循环;72℃最终延伸10min。扩增产物用含EB的1%琼脂糖凝胶电泳检测,目的片段长度在1.5kb左右[6]。 目的条带回收:采用DNA纯化回收试剂盒。用手术刀片将片段大小在1.5kb左右的条带切割放入1.5mL EP管,后续操作按照回收试剂盒的说明书进行操作。纯化的目的DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。 1.6.3 序列同源性分析 将测序结果在GenBank中通过BLAST进行基因比对,获得相似度较高的序列后,与所测序列通过ClustalX进行多重序列比对,比对结果通过MEGA 4.0软件构建系统发育树[6]。 2 结果与分析 2.1 微生物分析结果 a b
c d
e f
g h
a. 1P-1;b. 1P-2;c. 2P-1;d. 3P-1;e. 3P-2;f. 4P-1;g. 4P-2;h. 4P-4。 图 1 变质泡菜样品中分离菌株的菌落形态 Fig.1 Colony morphology of 8 spoilage microorganisms from pickle samples 样品主要采用NA和PDA平板分别对细菌和真菌进行分离。由于在两种平板上分离出来的菌株均能在PDA平板上生长良好,因此,根据菌株在PDA平板上菌落形态的差异从4个样品中共分离到8种不同的菌落,分别标记为1P-1、1P-2、2P-1、3P-1、3P-2、4P-1、4P-2、4P-4。由图1可知,通过显微镜观察菌株1P-1、2P-1、3P-2、4P-2为酵母菌,其余4株菌为芽孢杆菌。从不同样品的分离情况来看,1号、3号和4号样品分离到的主要为酵母菌和芽孢杆菌,2号样品中分离到的菌株为酵母菌。因此,从分离到的菌株类型来看,在变质泡菜中酵母菌和芽孢杆菌可能为主要存在的腐败微生物。 2.2 回接实验结果 为了观察所分离到的菌株引起的泡菜在发酵过程中的变质情况,将分离到的8株菌株分别接种到自然发酵的泡水萝卜中,以不接种的泡菜作为对比,观察8株供试菌株所引起的泡菜的劣变。从实验结果来看,接种的8株菌株在泡菜腐败变质的过程所引起的变化是各不相同的,回接实验结果见表2。 表 2 供试菌株回接泡菜实验结果 Table 2 Spoilage phenomena in pickle samples caused by the spoilage microorganisms
由表2可知,对照组在发酵1周之后,颜色淡红色(正常的泡好的水萝卜的颜色为鲜红色),有较好的发酵香味,没有出现生花现象,说明没接种的自然发酵的泡菜利用蔬菜中附带的乳酸菌进行自然发酵,而且在发酵过程中因腐败菌不占优势,发酵的成品色泽、酸度以及香味都较好,没有明显的腐败现象。从接种供试菌株的样品的色泽来看,1P-1、1P-2色泽鲜红,因此两株菌对泡菜颜色没有影响;3P-2和4P-1接种的泡萝卜颜色完全褪去,表现为白色,可能原因为两株菌能产生能使萝卜红色褪去的酶,在酶的作用下泡菜颜色变为白色;其余的菌株颜色变为暗红色,可能原因是微生物产生的多酚氧化酶或者是萝卜本身的多酚氧化酶使萝卜中的酚类物质发生褐变反应造成的结果。从酸度情况来看,所有样品的pH值都小于4,说明接种腐败菌后对其良性发酵的乳酸菌的生产没有明显的抑制作用;3P-1和4P-4接种的泡菜pH值较高,可能原因是两株菌能代谢产生碱性物质,另一方面这两株菌与泡菜中的乳酸菌可能具有一定拮抗作用,从而影响了乳酸菌的产酸;其余样品酸度和对照相似。 从气味上来看,菌株2P-1、3P-2、4P-4产生较严重的腐败味,对泡菜风味的影响较大,4P-2产生的腐败味不是很明显,而其他4株菌与对照相比在风味上没有明显差异,可能原因为不会产生不洁风味,或者产生量较少被乳酸菌发酵的酸香风味掩盖。从硬度来看,除了3P-2与对照相比使泡菜变软外,其余样品硬度与对照无明显变化。由于硬度的变化主要是泡菜中果胶发生变化而引起的,因此可推断:从接种引起的生花情况来看,除了4P-4与对照未发生生花情况,其余菌株均引起生花,而且1P-1、2P-1、3P-2、4P-2这4株菌在发酵第3天液体表面就开始出现膜状物质,且生花较严重;而其余的样品生花较迟,在发酵第5天开始陆续出现生花现象,生花原因有可能为供试菌株自身产膜,也可能是供试菌株的代谢产物促进了产膜微生物的生长,从而使泡菜表面生花。而在本实验中鉴于分离到的8株菌均能引起不同程度的腐败,因此将8株菌株都用于序列的测定,以确定供试菌株的种属。 2.3 腐败菌株鉴定结果与分析 2.3.1 菌株PCR扩增产物纯化结果
1. Marker: DL2000 Lander;2~9.分别为菌落1P-1、1P-2、2P-1、3P-1、3P-2、4P-1、4P-2、4P-4。 图 2 菌株PCR扩增产物纯化结果 Fig.2 Electrophoresis patterns of purified PCR products 将8株供试菌株的菌落经简单处理后用于16S rDNA/ 2.3.2 菌株系统发育树的构建 根据图3供试细菌16S rDNA序列构建的系统发育树可以看出,分离到的4株细菌都属于芽孢杆菌属。其中菌株3P-1、4P-1、4P-4与标准菌株B.subtilis聚在一起,而且3株菌与枯草芽孢杆菌的序列相似度也大于99%,因此这3株菌被鉴定为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌被证实为多种食品中的优势腐败菌,可分解食品中蛋白质、糖类等造成食品的风味和口感发生不期望的变化,从而引起食品的腐败变质。李洁等[7]研究了引起半干面腐败变质的主要微生物类群,证明枯草芽孢杆菌是半干面贮藏前期最主要的腐败微生物。在新疆番茄酱罐头中,芽孢杆菌也被证实是引起罐头平酸败坏的主要细菌[8]。从发酵泡菜的结果来看,不同的菌株引起的变化有差异,主要造成泡菜颜色、风味的劣变。
图 3 根据供试细菌16S rDNA序列构建的系统发育树 Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences for bacteria from spoiled samples 由图3可知,1P-2与标准菌株B.altitudinis聚在一起,序列相似度也达99%以上,因此1P-2被鉴定为B.altitudinis。关于B.altitudinis的文献较少,胡志明等[9]研究了黄酒大罐发酵过程中的微生物,发现B.altitudinis是引起黄酒发酵的微生物之一;毛云莹[10]对成都平原农田土壤中的芽孢杆菌进行了分离鉴定,证实B.altitudinis为其中的一种芽孢杆菌。由于土壤中含有此种芽孢杆菌,因此也就容易随泡菜原料一起被带入到泡菜当中。由表2可知,接种此种芽孢杆菌并不会对泡菜的风味和颜色产生不良影响。
图 4 根据供试真菌18S rDNA序列构建的系统发育树 Fig.4 Phylogenetic tree based on 18S rDNA gene sequences for fungi from spoiled samples 根据图4供试真菌18S rDNA序列构建的系统发育树可以看出,有3株菌与毕赤酵母属的菌株归到1个类群。1P-1和3P-2与标准菌株P.manshurica聚在一起,菌株2P-1与P.kudriavzevii归为一个小簇,且3株菌与相应的标准菌株的序列相似度大于99%,因此1P-1和3P-2被鉴定为P.manshurica,2P-1被鉴定为P.kudriavzevii。而另外1株菌4P-2与C.tropicalis聚到一起,被鉴定为C.tropicalis(热带念珠菌/热带假丝酵母)。因此,从变质的泡菜样品中分离到的真菌主要来源于两个属的3种真菌。对于3种真菌的接种效果来看,最大的特点在于接种之后引起的快速在培养基表面产膜,引起生花的现象。由此可见泡菜样品中的真菌是引起生花的主要原因。目前对于毕赤酵母引起的腐败研究的比较多。毕赤酵母分解糖的能力弱,不产生酒精。能氧化酒精,能耐高或较高体积分数酒精。常使酒类和酱油产生白花,形成浮膜,为酿造工业中的有害菌[11]。章银珠等[12]的研究发现,引起陈化黄酒变质的微生物中就有毕赤酵母。Saez等[13]从变质的葡萄酒中分离得到了P.manshurica,且证实该菌为引起葡萄酒变质的主要菌种之一。Akabanda[14]、Dhaliwal[15]、Golomb[16]等依次从加纳发酵奶、甘蔗汁、发酵橄榄中分离出P.kudriavzevii,且多为产品中的优势菌。虽然在本实验中将P.kudriavzevii回接泡菜出现生花现象,但有可能是P.kudriavzevii促成了其他真正意义上的腐败菌的腐败活动,且目前关于P.kudriavzevii引起其他食品腐败的也鲜有报道,因而P.kudriavzevii是否为泡菜生花腐败菌还有待进一步研究。热带假丝酵母菌(C.tropicalis)广泛存在于自然环境,可在水果、蔬菜和其他植物以及土壤中发现,能引起食品腐败变质。侯风伶等[17]从变质保健饮料中分离得到了热带假丝酵母,且证明引起饮品胀气变质的主要为热带假丝酵母。由此可见,引起泡菜“生花”的微生物可能主要为芽孢细菌和酵母菌。 3 讨 论 3.1 泡菜原料中的微生物对接种发酵过程的影响 为了较好的模拟自然发酵的过程,因此泡菜原料未经过灭菌处理,而且如果原料灭菌之后,作为产酸的乳酸菌也将被杀灭,将导致泡菜发酵失败,因此接种的供试菌株只是作为优势菌株存在,所以其他微生物生长会在一定程度对供试菌株造成影响,不过和对照相比也能看出接种供试菌株所带来的显著差异。 3.2 不同的酸度条件对供试微生物产膜的影响 在接种发酵泡菜的过程中,接种4株真菌的样品所引起的生花现象较早,而且较严重,而接种芽孢杆菌的样品生花现象出现的较晚,为了进一步证实芽孢杆菌能否引起生花现象,本实验通过不同pH值条件下供试菌株在培养液中的产膜情况来进行说明。从实验结果来看无论在pH3、pH5还是pH7的PDA培养液中,酵母菌都能成膜,而且量较大,1P-1与3P-2在酸性条件下的产膜量大于中性条件。而芽孢杆菌在pH7时,表面会形成膜,在pH5条件下,液体浑浊,液面会有少量膜,而在pH3条件下,溶液澄清。因此酸度条件对芽孢杆菌的生长和产膜影响较大。因此在泡菜泡制的过程中应避免原料中芽孢杆菌的大量存在,如果在发酵初期,乳酸菌的生长不占优势,芽孢杆菌就能在发酵液中大量繁殖,导致发酵产品劣变,随着发酵的进行,虽然受酸度的影响,芽孢杆菌开始受到抑制,但是其死亡的菌体和代谢产物等将有可能促进其他腐败微生物的生长,导致产品的败坏。 4 结 论 通过对4种“生花”的四川泡菜中的微生物进行分离,得到了8株疑似腐败菌。将其回接于泡菜后,与对照相比均出现了不同程度的腐败变质现象。通过对分离到的菌株进行16S rDNA/18S rDNA序列分析,证实引起泡菜腐败的8株菌中具有B.subtilis 3株、B.altitudinis 参考文献: [1] MAKI M. Lactic acid bacteria in vegetable fermentations[M]//SALMINEN S, WRIGHT A V, OUWEHAND A. Lactic acid bacteia: microbiological and functional aspects. New York: Marcel Dekker, 2004: 419-430. [2] 刘小艺, 阚建全, 阮志勇. 应用响应面优化泡菜用微生物的富集培养基[J]. 食品工业科技, 2011, 32(5): 183-189. [3] 阳辛凤, 高秋芳, 李敏锡, 等. 菌落PCR快速扩增工业酿酒酵母基因组DNA片段[J]. 生物技术通报, 2010(9): 215-219. [4] JAMES B R, JACK H. PCR primers that amplify fungal rRNA genes from environmental samples[J]. Apply Environment Microbiology, 2000, 66(10): 4356-4360. [5] 武香玉, 徐海燕, 辛国芹, 等. 一株乳酸菌的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 畜牧与饲料科学, 2012, 33(3): 1-3. [6] 敖晓琳, 张小平, 史令, 等. 四川泡菜中两株优良乳酸菌的鉴定及不同发酵条件对其发酵泡菜品质的影响[J]. 食品科学, 2011, 32(11): 152-156. [7] 李洁, 孙姝, 朱科学, 等. 半干面腐败菌的分离与鉴定[J]. 食品科学, 2012, 33(5): 183-187. [8] 闫国宏, 傅力, 肖春芳, 等. 新疆番茄酱中枯草芽孢杆菌耐热性的研究[J]. 食品研究与开发, 2008, 29(11): 88-90. [9] 胡志明, 谢广发, 吴春, 等. 黄酒大罐发酵醪液中原核微生物的初步研究[J]. 酿酒科技, 2009(8): 58-61. [10] 毛云莹. 成都平原农田土壤芽孢杆菌[D]. 雅安: 四川农业大学, 2011. [11] 中国科学院微生物研究所. 常见和常用真菌[M]. 北京: 中国科学出版社, 1973: 80-90. [12] 章银珠, 姚卫蓉. 变质传统发酵陈化黄酒微生物的分离和鉴定[J]. 中国酿造, 2008(21): 62-66. [13] SAEZ J S, LOPESCH A, KIRS V E, et al. Production of volatile phenols by Pichia manshurica and Pichia membranifaciens isolated from spoiled wines and cellar environment in patagonia[J]. Food Microbiology, 2011, 28(3): 503-509. [14] AKABANDA F, OWUSU K, JAMES T D, et al. Taxonomic and molecular characterization of lactic acid bacteria and yeasts in nunu, a Ghanaian fermented milk product[J]. Food Microbiology, 2013, 34(2): 1-7. [15] DHALIWAL S S, OBEROI H S, SANDHU S K, et al. Enhanced ethanol production from sugarcane juice by galactose adaptation of a newly isolated thermotolerant strain of Pichia kudriavzevii[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(10): 5968-5975. [16] GOLOMB B L, MORALES V J, ALESIA Y, et al. Effects of pectinolytic yeast on the microbial composition and spoilage of olive fermentations[J]. Food Microbiology, 2013, 33(1): 97-106. [17] 侯风伶, 申志新, 张淑红. 热带假丝酵母菌引起保健饮品变质的检测[J]. 中国卫生检验杂志, 2002(6): 709. 收稿日期:2012-12-11 基金项目:教育部春晖计划项目(Z2011101);国家自然科学基金项目(31171726) 作者简介:敖晓琳(1979—),女,讲师,博士,研究方向为食品微生物。E-mail:huavslin@163.com |
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