明胶与甜菜果胶的相互作用

李玉辉，章轶锋，谢晶晶，张 露，方亚鹏*

（湖北工业大学食品与制药工程学院，湖北 武汉 430068）

摘 要：研究明胶与甜菜果胶形成的复合物受pH值和混合比例的影响。甜菜果胶与明胶总质量浓度为0.1g/100mL时，在两者一定的混合比例下，添加葡萄糖酸内酯进行酸化，利用紫外-可见分光光度计、激光纳米粒度及电位滴定分析仪，测定体系的浊度、散射光强和流体力学半径。通过寻找特征pH值，确定相边界，进而构建体系的pH值-混合比率相图。结果表明：明胶与甜菜果胶混合物在酸化过程中，在高pH值区域无相互作用，随后形成分子内可溶性复合物，进一步酸化形成分子间可溶性复合物，在低pH值区域为不可溶性复合物，体系逐渐失稳。

关键词：甜菜果胶；明胶；相互作用；复合物；相图

Interaction between Gelatin and Sugar Beet Pectin

LI Yu-hui, ZHANG Yi-feng, XIE Jing-jing, ZHANG Lu, FANG Ya-peng*

(School of Food and Pharmaceutical Engineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

Abstract: Factors such as pH and mixing ratio for influencing the complex of sugar beet pectin and gelatin were studied. The total concentration of sugar beet pectin and gelatin was fixed at 0.1 g/100 mL. At a certain mixing ratio, the mixed system was acidified by gluconolactone, and the turbidity, light scattering intensity and hydrodynamic radius of the system were determined. Through exploring featured pHs, the phase boundaries were determined and a pH-composition phase diagram was established. The turbidity was measured using UV-Vis spectrophotometer, and light scattering intensity and hydrodynamic radius were tested using Zetasizer Nano-ZS apparatus. Based on the phase diagram and microscopic observation, no interaction was found between sugar beet pectin and gelatin at higher pH levels, while intramolecular and subsequently intermolecular soluble complexes were formed due to further acidification. At low pH levels, insoluble molecular complexes were developed and the system became unstable.

Key words: sugar beet pectin; gelatin; interaction; complex; phase diagram

中图分类号：TS201.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2014)01-0029-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401006

蛋白质和多糖是食品体系中两类重要生物大分子，是影响食品质构的主要因素。食品体系的稳定性和结构是与蛋白质-多糖之间的相互作用有关，而不仅仅依赖于单个生物大分子的功能性[1]。在加工过程中，各种成分的固有性质以及它们之间的相互作用决定着食品的结构、质地和稳定性[2]。大多数情况下，高分子在溶液中相互混合是不稳定的，容易发生相分离[3]，携带相反电荷的两种物质通过静电吸引结合在一起形成可溶性或不溶性的复合物[4]。

Tolstoguzov[5]将大分子相互作用分为3种类型：带电的大分子之间的相互作用、带相反电荷基团（酸性和碱性）分子之间的相互作用、离子之间的相互作用。蛋白质与非离子型多糖或阴离子多糖与pH值在等点电以上的蛋白质混合物之间可以产生排斥力。在低离子强度下，带正电荷的蛋白质（pH＜pI）与阴离子多糖可以产生强的吸引力，不带电或带负电的蛋白质（pH＞pI）和阴离子多糖产生弱的相互作用力。然而，在某些情况下仍然可以形成复合物，因为蛋白质基团上存在正电荷区域[6]。在所有的作用力当中，静电吸引力是最普遍的，包括带电分子间形成的复合物[7]。

蛋白质-多糖组合是研究复合凝聚作用的常用模型。一般认为，蛋白质与多糖之间的复合不是由单一的某种作用完成的，而是静电作用力、氢键、疏水相互作用、范德华力、离子键、容积排阻作用等共同作用的结果。在这些作用力中，静电引力存在最为广泛。蛋白质-多糖复合物形成的相互作用力首次被Tiebackx[8]提出来，他认为明胶与阿拉伯胶形成复合物的稳定性取决于添加到复合物溶液中酸的数目，所以，Tiebackx推测这与两种高分子之间作用力的性质有关。同样，Bungenberg[9]论证了不溶性复合物的形成与特定的pH值和离子强度有关。据报道，白蛋白与不同类型淀粉分子（玉米、马铃薯、大米）之间的相容性与pH值影响有关。不溶性复合物达到的最大量需要特定的酸碱值[10]。蛋白质与生物大分子的比例是复合物形成过程中一个重要影响因素。对每一个体系而言，产生最大絮凝量其分子比例是特定的。研究发现，β-乳球蛋白和阿拉伯胶在总质量浓度为1g/100mL，通过浊度测量，产生最大絮凝量的质量比为4∶1。在溶液中，蛋白质或多糖过量时，不会产生絮凝。生物聚合物浓度比较高时，体系由于热力学不相容性会发生相分离[5]。

甜菜渣中含有丰富的果胶资源，含量占其干质量的19.6%[11]，具有较大的开发利用价值。甜菜果胶是从甜菜榨糖后残余的甜菜渣中提取而来的新型果胶，其侧链上含有较高成分的乙酰基，无凝胶性[12]。甜菜果胶含有阿魏酸基团[13-16]，约占中性糖残基含量的0.61%～2.5%[17]，因此又赋予其较强的乳化性[18-19]，是一种良好的食品添加剂，可以作为微胶囊的壁材[20-22]。明胶是由胶原蛋白经过水解得到的一种天然高分子材料，在照相、制药、食品、化妆品和胶黏剂等行业中得到了广泛的应用[23-24]。根据明胶制备方法的不同，可以分为A型明胶（酸法水解）和B型明胶（碱法水解）。A型明胶是用酸水解猪皮、牛皮、牛骨等动物胶原得到的，其等电点在6～8之间，可塑性和弹性较好。而B型明胶是将动物的骨和皮等通过碱法水解处理得到的，其等电点在4.7～5.3之间，硬度较好[25]。

明胶-阿拉伯胶复合凝聚物被广泛应用于微胶囊化技术。此后，乳清蛋白、植物蛋白、低甲氧基果胶以及黄原胶等体系也陆续进入人们的视线。尽管利用复合凝聚现象制备微胶囊的研究时间较长，但其在现代食品加工中的应用尚处于起步阶段。本实验利用甜菜果胶代替阿拉伯胶，解决阿拉伯胶供应链不稳定的问题，降低应用成本。选择明胶-甜菜果胶体系作为研究对象，在不同的蛋白质-多糖配比及pH值条件下，通过相图的构建探讨其相互作用机理，为明胶与甜菜果胶复合作为壁材进行微胶囊化提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

B型明胶（Mw1.945×105u）、葡萄糖酸内酯 美国Sigma公司；甜菜果胶（Mw 2.263×106u） 日本三荣源公司；氢氧化钠、盐酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SRT-202滚轴式混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；XH-B旋涡混合器 江苏康健医疗用品有限公司；Direct Q3纯水机 美国Merck Millipore公司；ORION 4 STAR pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GL-21M智能高速冷冻离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；Zetasizer Nano-ZS纳米粒度、电位滴定分析仪 英国马尔文仪器有限公司；TU-1900双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；BT-1600图像颗粒分析系统 丹东百特科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 明胶与甜菜果胶混合物的制备

分别取适量的明胶和甜菜果胶粉末溶解在去离子水中（加入0.005g/100mL叠氮化钠），配成质量浓度为0.5g/100mL的溶液，置于滚轴混合器上，在室温下混合摇匀12h，使其充分溶解。将明胶溶液置于50℃水浴中，使其充分溶胀。明胶、甜菜果胶分别经过冷冻离心（10000r/min，50min），取上清液，用0.45μm过滤膜过滤。取过滤后的溶液大约5g，放入105℃烘箱中恒质量。明胶与甜菜果胶按照一定的比例，配成总质量浓度为0.1g/100mL混合物，初始pH值调为8.0，混合30min备用。

1.3.2 在线pH值测定

采用Orion 4 Star pH计对葡萄糖酸内酯酸化过程中的混合物的pH值进行连续监控，在25℃恒温条件下，先将pH计在4.01、7.00和10.01值处进行三点校正，pH值测定的精确度为0.01 pH单位，通过pH-时间曲线表征酸化过程。

1.3.3 胶粒的电位（ξ）测定

酸化过程中体系ξ的变化可以反映体系中明胶与甜菜果胶的相互作用，最终ξ值的大小可以用来衡量体系的稳定性。

按照1.3.1节的方法，配制不同比例的明胶-甜菜果胶混合体系，分别称取10g，利用Nano ZS激光纳米粒度及电位滴定分析仪（MPT-2自动滴定单元）进行连续滴定，采用NaOH（0.25mol/L）和HCl（0.025、0.25mol/L）溶液，使体系pH值从8.0逐步降到2.0以下，以pH值为横坐标，ξ为纵坐标绘制电位滴定曲线，测定温度为25℃。所用He-Ne激光光源输出功率为4mW，检测角为17°，检测波长为633nm。

1.3.4 浊度的测定

配制不同比例的明胶-甜菜果胶混合体系，分别称取10g，添加适量的葡萄糖酸内酯，混合均匀后，在25℃条件下，用TU-1900双光束紫外-可见分光光度计于500nm波长处测定吸光度，监测吸光度随时间的变化，以蒸馏水为对照。

1.3.5 散射光强和流体力学半径的测定

配制一系列不同比例的明胶-甜菜果胶混合体系，分别称取10g，添加适量的葡萄糖酸内酯，混合均匀后，用Nano ZS激光纳米粒度及电位滴定分析仪测定酸化过程中随时间的变化体系的光散射强度和流体力学半径。所用He-Ne激光光源输出功率为4mW，检测角为173°，检测波长为633nm，在25℃条件下测定。

1.3.6 光学显微镜观察

配制明胶-甜菜果胶（质量比1∶1）混合物，称取10g，添加适量的葡萄糖酸内酯，混合均匀后，在25℃条件下，每隔30min用吸管吸取少量混合液置于载玻片上，用BT-1600图像颗粒分布系统监测液滴的形态变化，放大倍数为10倍。该系统由光学显微镜（Nikon YS100）、数字CCD摄像头（HV2001UC）、图像处理与分析软件等部分组成。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖酸内酯水解酸化

图 1 明胶-甜菜果胶（质量比1∶1）混合物pH值随酸化时间的变化

Fig.1 Change in pH of gelatin-SBP (1∶1) as the change of acidification time

图1为添加0.5g/100mL葡萄糖酸内酯后，混合质量比为1∶1的明胶-甜菜果胶体系的pH值随时间的变化曲线。葡萄糖酸内酯遇水发生水解后释放出葡萄糖酸，使体系的pH值不断降低，直至趋于稳定。添加葡萄糖酸内酯后，混合物初始pH值迅速降低，随后缓慢下降，在200min左右，pH值达到2.7左右，基本趋于稳定不变。

2.2 ξ的测定

r为明胶与甜菜果胶的质量比。下同。

图 2 明胶-甜菜果胶混合物ξ随pH值的变化

Fig.2 Change in ξ-potential of gelatin-SBP mixtures as the change of pH

在明胶-甜菜果胶的不同混合比例条件下，体系ξ随pH值变化如图2所示。总质量浓度为0.1g/100mL，纯明胶溶液的等电点为4.79，与文献报道的结果一致[26]。纯甜菜果胶溶液，pH值在5.0以上时，ξ在－40mV左右，pH值在2.0以下时，ξ趋于0。甜菜果胶在葡萄糖酸内酯的水解酸化下，羧基被质子化，分子所带电荷逐渐被中和。混合体系在酸化过程中，ξ在－40～25mV之间，呈“S”形。随着pH值的降低，ξ先缓慢增加，pH值在4.5～3.0范围内，ξ迅速增加，随后ξ为正值。当pH＜2.6时，ξ变化趋于平稳。随着明胶-甜菜果胶比例的降低，混合物等电点逐渐降低。

2.3 浊度和散射光强的测定

在明胶-甜菜果胶分散体系中，由pH值诱导的复合物结构转变点可以采用互补法测定，比如散射光强和浊度。由于光散射对于分子水平上的结构变化比较敏感，而浊度对于相对较大的颗粒（如微米级别）比较敏感，因此可以综合光散射和浊度的变化趋势来反映不尺寸的多糖-蛋白质分子复合物的结构形成，如可溶性分子复合物和不溶性分子复合物的形成[27-28]。

图 3 明胶-甜菜果胶混合物的散射光强度随pH值的变化

Fig.3 Light scattering intensity as a function of pH in gelatin- SBP mixtures

图 4 明胶-甜菜果胶混合物的浊度随pH值的变化

Fig.4 Turbidity as a function of pH in gelatin -SBP mixtures

由图3、4可知，在pH值降低的初期，溶液的散射光强与浊度基本不变。随着葡萄糖酸内酯的水解酸化，pH值逐渐降低，散射光强先开始缓慢增加，可溶性复合物形成，随后浊度才开始增加，不可溶性复合物开始形成。由于分子间作用力比较弱，所形成的可溶性复合物比较小，散射光强对分子水平的小颗粒敏感程度高于浊度，所以散射光强先开始增加，随后浊度才开始增加当r=1时，散射光强在pH4.8左右时开始上升，而浊度在pH4.2左右才开始增加。随着葡萄糖酸内酯的进一步水解酸化，散射光强在pH3.7左右时达到最大，而浊度在pH3.3左右时才达到最大，随后开始降低，原因是由于分子间作用力加强，颗粒尺寸增大，颗粒数量减少。

该实验的结果还显示，随着明胶-甜菜果胶混合比例的变化，混合溶液达到最大的散射光强和浊度所对应的pH值也在变化。同ξ变化趋势一样，随着明胶-甜菜果胶比例的降低，散射光强和浊度达到的最大值所对应的pH值也逐渐降低，这可能是由于随着甜菜果胶质量的增加，所带负电荷随之增加，就需要明胶携带更多的正电荷来中和，所需pH值也就逐渐降低。

2.4 pH值诱导复合物结构转变点的确定及其相图的构建

r=1。

图 5 明胶-甜菜果胶混合物散射光强度（I173°）、浊度（τ）、流体力学半径（Rh）随pH值的变化情况

Fig.5 Change in turbidity (τ), light scattering intensity at (I173°), and hydrodynamic radius (Rh) as the change of pH in gelatin-SBP mixtures

A. pH 4.2；B. pH 3.8；C. pH 3.72；D. pH 3.5；E. pH 3.23；F. pH 2.8。

图 6 明胶-甜菜果胶混合物相图

Fig.6 Phase diagram of gelatin-SBP system

影响蛋白质与多糖相互作用的因素比较多，如pH值、蛋白质与多糖的比例、溶液体系质量浓度等，其中pH值起着关键的作用。两个比较重要的参数就是pHc和pHφ。pHc表示混合体系相互作用开始发生，散射光强缓慢增加，可溶性复合物开始形成，pHφ表示混合体系散射光强达到最大，浊度显著增加，不可溶性复合物开始形成[27-28]。以r=1为例，明胶/甜菜果胶混合物散射光强、浊度、流体力学半径随pH值变化，确定pH值关键转折点，经归一化处理，结果如图5所示。根据不同明胶/甜菜果胶混合比例下pHc、pHφ和明胶等电点（pI）绘制相图，如图6所示。结合图2、5、6可以看出：（Ⅰ）当pH值高于明胶等电点（pI 4.79）时，甜菜果胶的ξ＜－32mV，甜菜果胶与所带负电荷的明胶产生静电排斥作用，阻止彼此靠近，体系以单个高分子存在而无复合物形成；（Ⅱ）pH值介于pI与pHc时，在低比例条件下，少量明胶会络合到甜菜果胶上，发生了分子内局部相互作用，但
ξ＜－30mV，甜菜果胶之间仍以排斥力为主，体系仍然相对稳定，此时发生分子内相互作用；（Ⅲ）pH值介于pHc与pHφ时，甜菜果胶与明胶作用力加强，甜菜果胶分子上面络合的明胶逐渐增加，甜菜果胶分子间短程吸引力可以克服远程排斥力，发生分子间相互作用。体系混合物的ξ处于－25～－15mV之间，此时不足以保证溶液具有完全的稳定性，处于亚稳定状态[29]；（Ⅳ）当pH值低于pHφ时，明胶所带正电荷逐渐增加，甜菜果胶与明胶间吸引力进一步加强，甜菜果胶上面络合的明胶迅速增加，混合物ξ大于－10mV，处于极不稳定状态，浊度显著升高，流体力学半径开始迅速增加，颗粒明显增大，此时溶液颗粒相互聚集。

2.5 光学显微镜观察

A

B

C

D

E

F

A. pH 4.2；B. pH 3.8；C. pH 3.72；D. pH 3.5；E. pH 3.23；F. pH 2.8。

图 7 不同pH值的明胶-甜菜果胶混合物光学显微观察

Fig.7 Optical microscopic images of gelatin-SBP mixtures at different pH levels

光学显微镜是一种研究复合物结构的重要工具，可以监测复合物形成过程中颗粒的不同形态和聚状态。明胶-甜菜果胶混合物总质量浓度为0.1g/100mL，混合质量比为1∶1，在葡萄糖酸内酯缓慢酸化后，不同pH值条件下溶液聚集状态如图7所示。结合图6、7可知，当pH值处在相图区域（Ⅲ）pH4.2（图7A）时，为分子间可溶性复合物区；当pH值到达pH3.8（图7B）时，此时体系为亚稳定状态，出现少数不溶性复合物颗粒；当pH值降到pH3.72（图7C）时，不溶性复合物颗粒数量逐渐增多，此时散射光强达到最大，浊度显著增加；随着葡萄糖酸内酯的进一步酸化，pH值由pH3.5（图7D）降到pH3.23（图7E）时，流体力学半径显著升高，颗粒分子尺寸迅速增大，小颗粒聚集成大颗粒，颗粒数量不断降低，到pH3.23时浊度达到最大；当体系的pH值进一步降低到pH2.8（图7F）时，分子间作用力逐渐增加，颗粒间不断聚集，当达到一定程度，在自身重力作用下，从体系中析出。

3 结 论

由于蛋白质和多糖的复合凝聚驱动力主要是来自静电相互作用，所以影响这种静电相互作用的物理化学参数（如pH值、离子强度、多糖的电荷密度、多糖质量浓度、多糖与蛋白质的比例等）会极大地影响复合物的形成。在复合物形成过程中，pH值起着关键作用，因为它影响着生物大分子功能基团的解离度（即氨基和羧基）。由于这个原因，在明胶与甜菜果胶混合物中，pH值在明胶等电点（pI=4.79）以下时，两个生物大分子带有相反电荷，可以发生不同程度的相互作用。实验发现：明胶/甜菜果胶混合物，在pH＞pI时，为高分子可溶物区；在pI＜pH＜pHc时，为分子内可溶性复合物；在pHc＜pH＜pHφ时，为分子间可溶性复合物；在pH＜pHφ时，为不稳定区。

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