一株产L-木酮糖菌株的分离筛选及鉴定

张玉宝1,2,赵祥颖3,杨丽萍3,韩延雷3,刘建军1,3,*

1.山东农业大学食品科学与工程学院,山东 泰安 271018;2.山东省兽药添加剂工程技术研究中心,山东 济南 250306;3.山东省食品发酵工程重点实验室,山东 济南 250013)

 

摘 要:通过初筛和复筛从土壤中分离获得1株能够转化木糖醇生产一种稀有糖——L-木酮糖的芽孢杆菌ZN-14。利用该菌株的静息细胞以20g/L木糖醇为底物,在pH9.0、37℃条件下转化24h,转化率达到26.62%。通过对菌株ZN-14形态特征观察、生理生化特性鉴定以及16S rDNA基因序列同源性的分析,将其鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

关键词:L-木酮糖;巨大芽孢杆菌;生物转化

 

Isolation and Identification of a Novel L-Xylulose-Producing Strain

 

ZHANG Yu-bao1,2, ZHAO Xiang-ying3, YANG Li-ping3, HAN Yan-lei3, LIU Jian-jun1,3,*

(1. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China;

2. Shandong Veterinary Medicine Additive Engineering Technology Research Center, Jinan 250306, China;

3. Key Laboratory of Food and Fermentation Engineering of Shandong Province, Jinan 250013, China)

 

Abstract: A bacterium numbered as ZN-14 with the ability for efficient oxidization of xylitol to L-xylulose, a rare ketopentose, was isolated and purified from soil samples, through primary isolation and secondary screening. We have employed this isolated strain for the production of L-xylulose from xylitol by a resting cell reaction at 37 ℃ and pH 9.0. After 24 h, L-xylulose was produced at a yield of 26.62% when 20 g/L xylitol was utilized as the precursor. The strain was identified as Bacillus megaterium, based on the sequence analysis of 16S rDNA and the general morphological and biochemical characteristics.

Key words: L-xylulose; Bacillus megaterium; biotransformation

中图分类号:Q939.9 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)01-0199-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401039

L-木酮糖(L-xylulose)是存在于多种生物体代谢途径的戊酮糖[1],其在自然界中浓度很低,是一种稀有糖。口服L-木酮糖可以抑制肠道蔗糖酶和麦芽糖酶活性,能有效地抑制餐后血糖升高,是降血糖食品的理想活性成分[2]。此外,L-木酮糖可以作为其他稀有糖生产的前体物质。例如,L-木酮糖可以通过L-鼠李糖异构酶转化生产L-木糖和
L-来苏糖[3]。显然,为了更好地研究L-木酮糖在食品工业的应用,重要的第一步是批量生产L-木酮糖用于进一步研究。

国内目前还未见L-木酮糖的研究报道,国外主要以多元糖醇为原料,通过化学和生物法转化而成。化学法以D-山梨糖醇为原料合成L-木酮糖[4],但存在生产工艺复杂、副产物多及纯化繁琐等缺点。生物法转化L-木酮糖主要集中在利用菌体静息细胞氧化木糖醇生产L-木酮糖。迄今为止,仅发现噬夏孢欧文氏菌(后改名为菠萝泛菌(Pantoea ananatis))[5]、产碱杆菌(Alcaligenes)[6]、苍白芽孢杆菌(Bacillus pallidus)[7]3种细菌具有生物转化木糖醇生产L-木酮糖的能力。在上述3种细菌体内发现一种新型木糖醇-4-脱氢酶又称为L-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.10),专一作用于D-苏结构[8],转化木糖醇生产
L-木酮糖而后经过一系列转化进入糖酵解途径[9]。本实验从树林采集土壤样品,分离筛选到一株具有氧化木糖醇生产L-木酮糖的菌株并对其进行种类鉴定,旨在为进一步研究生物转化法制备L-木酮糖提供新材料。

1 材料与方法

1.1 材料

参照土样采集标准方法[8]采集土样,26个土壤样品分别采自济南、泰安、淄博、威海、大同等地,采集时间均为2011年9月15日—10月10日。

1.2 培养基

富集培养基(g/L):木糖醇10、酵母膏5、(NH4)2SO4 2.6、KH2PO4 2.4、K2HPO4 5.6、MgSO47H2O 0.1,pH7.0,121℃灭菌20min。

平板分离培养基(g/L):木糖醇10、酵母膏5、(NH4)2SO4 2.6、KH2PO4 2.4、K2HPO4 5.6、MgSO4•7H2O 0.1、琼脂20,pH7.0,121℃灭菌20min。

斜面培养基(g/L):木糖醇10、酵母膏5、蛋白胨5、NaCl 5、琼脂20,pH7.0,121℃灭菌20min。

种子培养基(g/L):木糖醇10、酵母膏5、蛋白胨5、NaCl 5,pH7.0,121℃灭菌20min。

发酵培养基(g/L):木糖醇30、酵母膏5、蛋白胨5、NaCl 5、KH2PO4 2.4、K2HPO4 5.6、MgSO4•7H2O 0.4、CaCl2•2H2O 0.03、MnSO4•H2O 0.04、FeSO4•7H2O 0.03,pH 7.0,121℃灭菌20min。

牛肉膏蛋白胨培养基(g/L):牛肉膏5、蛋白胨10、NaCl 5、琼脂20,pH 7.0,121℃灭菌20min。

1.3 试剂与仪器

木糖醇 山东福田药业有限公司;L-半胱氨酸盐酸盐、咔唑(均为分析纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司;木酮糖(纯度95%) 美国Sigma公司;乙腈(色谱纯) 美国天地试剂公司。

UltiMate3000型高效液相色谱仪 美国戴安公司;XW-80A 漩涡混合器 上海精科实业有限公司;HH-6数显恒温水浴锅 上海亚荣生化仪器厂;BH-2 Olympus显微镜 日本奥林巴斯光学有限公司;Anke TDL-5-A台式离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分离与筛选

1.4.1.1 平板分离

1g土样于30mL富集培养基中(250mL三角瓶),37℃、180r/min振荡培养2d。取1mL培养液转到新鲜富集培养基中,如此重复5次。富集样品进行10倍系列稀释,取10-4、10-6、10-8、10-10这4个稀释浓度的菌液1mL分别涂布分离培养基平板,每个稀释度3个平板,37℃培养2d。从平板上挑取单菌落,转接斜面保藏并进行菌种初筛。

1.4.1.2 菌种初筛

将分离得到的菌株斜面接种于30mL发酵培养基中(250mL三角瓶),37℃、180r/min振荡培养36h。取培养液离心洗涤得到静息细胞,加入10mL质量浓度为20g/L木糖醇溶液(称取20g木糖醇溶于1L、pH9.0的Tris-HCl缓冲液,下同)转化24h,离心10min,上清液半胱氨酸咔唑法显色[9],以目测法选出呈蓝紫色者,作为产L-木酮糖菌株,留作复筛用。

1.4.1.3 菌种复筛

将初筛所得菌株斜面取1环接种于30mL种子培养基中,37℃、180r/min培养16h。然后吸取1mL种子液接种于30mL发酵培养基中,37℃、180r/min振荡培养24h,每菌株平行3瓶。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测转化液中L-木酮糖含量,色谱柱:HYPERSIL C18柱(300mm×4.6mm,5μm);流动相:水-乙腈(体积比为2080);流速:0.5mL/min;检测器:示差折光检测器(RID,ShodexRI-100);柱温:50℃;进样量:25μL。使用圆盘旋光仪进一步检测转化液的旋光性。

1.4.2 酶活力和转化率的测定

取10mL培养24h的培养液,于4℃、8000r/min离心10min,得到菌体用Tris-HCl缓冲液(pH9.0,50mmol/L)洗涤2次,弃去上清即得到静息细胞,加入10mL木糖醇溶液,37℃、180r/min反应1h。然后于100℃沸水浴加热2min终止酶反应,待其冷却后,离心10min,取上清液,半胱氨酸咔唑法测定生成的L-木酮糖含量。

酶活力单位定义:在上述条件下,每毫升发酵液每分钟产生1μg L-木酮糖的酶量为1个酶活力单位,以U/mL表示。

509928.jpg

式中:m为L-木酮糖质量/μg;V为发酵液体积/mL;t为反应时间/min。

转化率计算:在上述条件下,以生成的L-木酮糖与底物木糖醇的质量之比表示。

1.4.3 生物量的测定

按细菌生长曲线的测定方法[8],以660nm波长处的光密度值表示。

1.4.4 菌种鉴定

1.4.4.1 形态特征观察

将目的菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上进行稀释涂布,37℃培养箱中恒温培养24h,观察并记录其菌落特征;同时挑取平板上单菌落(37℃,24h)进行革兰氏染色,10×100倍油镜观察并记录观察菌体形态。

1.4.4.2 生理生化实验

进行淀粉水解实验、葡萄糖产气实验、V.P.实验、柠檬酸盐利用实验、H2S实验、硝酸盐还原实验、M.R.实验、明胶水解实验、糖醇类发酵,分别参照文献[11-12]方法进行。

1.4.4.3 16S rDNA的克隆及序列测定

将菌株接种于种子培养基中,37℃振荡培养16h,收集菌体。按照UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书操作。扩增引物序列:正向引物为5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’,反向引物为5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。取DNA模板1μL,10×Taq缓冲液2.5μL,上下游引物(10μmol/L)各0.5μL,dNTP 0.5μL,Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL,反应体系加超纯水补足至25μL。PCR扩增条件为94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火35s,72℃延伸1min,循环数35,72℃延伸8min。UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物后经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,回收目标片断。由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI中用BLAST在线同源性查询软件与GenBank中已登录的16S rDNA基因序列进行同源性比较,用系统发生推断软件包MEGA 5.1进行系统发育分析,并以Neighbor-Joining法构建系统发育树,确定该菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离纯化

木糖醇是一种多数微生物不能利用的稀有糖醇,因此选择木糖醇作为唯一碳源和能源,有利于直接分离筛选出具有多元糖醇氧化能力的菌株。样品经富集培养后稀释涂布平板,共分离得到菌种287株,初步确定这些菌株具有以木糖醇为唯一碳源和能源生长的能力,转入斜面保藏以进行进一步筛选。

2.2 产L-木酮糖菌株的初筛

表 1 土样分离菌株的转化能力

Table 1 The biotransformation capacity of stains isolated from soil

菌株编号

半胱氨酸咔唑反应显色程度

 

菌株编号

半胱氨酸咔唑反应显色程度

ZA-7

++

 

ZC-7

++

ZK-3

+++

 

ZK-4

+++

ZK-8

 

ZK-9

ZL-2

 

ZL-4

ZL-5

++

 

ZM-3

++

ZN-2

++

 

ZN-14

+++

ZN-16

++

 

ZO-2

ZP-5

++

 

ZP-8

+++

 

注:“+++”、“++”和“+”分别表示反应显色程度由深到浅。

 

采用摇瓶培养方法对分离得到的287株菌株进行产酮糖能力初筛,结果如表1,用半胱氨酸-咔唑法对转化液进行显色后,有16株菌株出现了的蓝紫色变化,其中,蓝紫色较深的菌株有4株,分别为ZK-3、ZK-4、ZN-14、ZP-8,表明可能出现较大量的L-木酮糖。将这4株作为复筛实验用菌株。

2.3 产L-木酮糖菌株的复筛

表 2 L-木酮糖菌株发酵及转化结果

Table 2 Formentation and biotransformation capacities of selected strains

菌株编号

OD660nm

L-木酮糖产量/(g/L)

转化率/%

酶活力/(U/mL)

ZK-3

0.453

3.92

19.60

1.9

ZK-4

0.235

2.31

11.55

1.2

ZN-14

0.593

5.32

26.62

2.6

ZP-8

0.483

3.55

17.75

1.6

 

 

对初筛所得菌株进行了摇瓶复筛,用HPLC检测反应液中L-木酮糖含量。由表2可知,菌株ZN-14转化液中
L-木酮糖含量最高,达到5.32mg/mL,转化率为26.62%,酶活力为2.6U/mL。10℃室温检测质量浓度为1g/L转化液,旋光性为左旋,旋光度为28°。菌株ZN-14转化液HPLC图谱、木酮糖标样HPLC图谱和木糖醇标样HPLC图谱见图1、2(ZK-3、ZK-4、ZP-8菌株转化液HPLC结果在此略去)。

509959.jpg 

1. L-木酮糖;2.木糖醇。

图 1 菌株ZN-14静息细胞转化生产L-木酮糖的HPLC图谱

Fig.1 HPLC profiles showing the production of L-xylulose by resting cells of ZN-14

509977.jpg 

510000.jpg 

A. L-木酮糖标样;B.木糖醇标样。

图 2 L-木酮糖和木糖醇标样HPLC图谱

Fig.2 HPLC profiles of mixed standards of L-xylulose and xylitol

2.4 菌种鉴定

2.4.1 菌株ZN-14形态学特征

菌株ZN-14在牛肉膏蛋白胨固体培养基上37℃倒置培养24h后,菌落呈乳白色,个体较大,圆形,表面湿润有光泽,不透明,无褶皱,边缘整齐,如图3所示。菌株ZN-14经结晶紫染色后显微镜下观察菌体呈杆状散布或成串分布,革兰氏染色呈阳性,芽孢呈椭圆形,中生,孢囊不膨大,如图4所示。

510030.jpg 

图 3 菌株ZN-14菌落培养特征

Fig.3 Colonial characteristics of strain ZN-14

510046.jpg 

图 4 菌株ZN-14细胞形态图(×1000)

Fig.4 Morphological characteristics of strain ZN-14 (×1000)

2.4.2 菌株ZN-14生理生化鉴定

表 3 菌株ZN-14的生理生化特征

Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain ZN-14

特征

结果

 

 

特征

结果

淀粉水解

 

糖醇类

发酵

葡萄糖

葡萄糖产气

 

木糖

V.P.实验

 

乳糖

柠檬酸盐利用

 

蔗糖

H2S

 

麦芽糖

硝酸盐还原

 

山梨醇

M.R.实验

 

甘露醇

明胶水解

 

木糖醇

 

注:+.阳性;-.阴性。

 

对该菌株进行生理生化特征鉴定,结果见表3。菌株ZN-14能发酵葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇,葡萄糖产气实验、V.P.测定为阴性,H2S实验、硝酸盐还原实验、M.R.实验、柠檬酸盐利用实验、淀粉和明胶水解均为阳性。对照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》,初步将菌株ZN-14归入芽孢杆菌属。

2.4.3 菌株16S rDNA序列测定与系统发育分析

为了进一步确定菌株ZN-14的分类学位置,PCR获得菌株ZN-14的16S rDNA基因的部分片段,长度为800bp,测定其16S rDNA基因序列。将该序列与美国国家生物信息中心收录的DNA序列进行比对,发现ZN-14与芽孢杆菌属的16S rDNA序列自然聚类。选取14株同属内同源性高的不同菌株的16S rDNA基因序列进行分子系统发育分析,如图5所示,ZN-14与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)IAM13418聚成一分支,序列相似性高达99%,表明ZN-14与巨大芽孢杆菌的亲缘关系最近。

510061.jpg 

图 5 菌株ZN-14及相关菌株16S rDNA基因序列分析聚类结果

Fig.5 Phylogenetic tree of strain ZN-14 based on 16S rDNA sequences

3 结 论

从土壤中分离细菌样品,以木糖醇为唯一碳源和能源,经过定向筛选,得到1株可氧化木糖醇转化生产
L-木酮糖的菌株ZN-14。利用该菌株的静息细胞以木糖醇溶液(20g/L,pH9.0)为底物在37℃转化24h,转化率达到26.62%,酶活力为2.6U/mL。通过对该菌株形态学特征观察、生理生化特性鉴定以及16S rDNA基因序列同源性的分析,将其鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

生物法转化木糖醇生产L-木酮糖的菌株已有报道,然而使用巨大芽孢杆菌静息细胞转化生产L-木酮糖未见相关研究,为生物转化法制备L-木酮糖提供了新材料。静息细胞转化法应用于稀有糖生产同化学法相比,成本低、方法简单、转化率高并且没有副产物的干扰。通过对菌株发酵和反应工艺条件的优化以及菌种改良等措施,进一步提高L-木酮糖的产量是我们今后工作的方向。

参考文献:

[1] GORO T, WAYPOON P, KENJI M, et al. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2010, 74(9): 1807-1813.

[2] HEINZ F, HERTEL S, VOGEL M. Composition to reduce the level of sugar in the blood: German, WO98/20882[P]. 1998-05-22.

[3] TOM B G, GORO T, KENJI M, et al. L-xylose and L-lyxose production from xylitol using Alcaligenes 701B strain and immobilized L-rhamnose isomerase enzyme[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2005, 36: 976-981.

[4] LARSON H W, BLATHERWICK N R, BRADSHAW P J, et al. Metabolism of L-xylulose[J]. Biological Chemistry, 1941, 138: 353-360.

[5] REED D, ROBERT M. Characterization of xylitol-utilizing mutants of Erwinia uredovora[J]. Applied and Environmental Microbiology , 1985, 49: 158-162.

[6] ANISUR R K, HIASHIRO T, KAORII Y, et al. Conversion of xylitol to L-xylulose by Alcaligenes sp. 701B-Cells[J]. Fermention Bioengineering, 1991, 72(6): 488-490.

[7] WAYPOON P, GORO T, KENJI M, et al. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40: 1206-1212.

[8] WAYPOON P, GORO T, KENJI M, et al. Polyol conversion specificity of Bacillus pallidus[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2008, 72(1): 231-235.

[9] ANDERSON R L, WOOD W A. Pathway of L-xylose and L-lyxose degradation in Aerobacter aerogenes[J]. Biological Chemistry, 1962, 237: 296-303.

[10] 诸葛健, 王正祥. 工业微生物实验技术手册[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1994: 335-364; 383-400.

[11] DISCHE Z, BORENFREUND E. A new spectrophotometric method for the detection of keto sugars and trioses[J]. Biological Chemistry, 1951, 192: 583-587.

[12] DISCHE Z, SHETTLE L B. A new spectrophotometric test for the detection of methylpentose[J]. Biological Chemistry, 1951, 192: 579-582.

[13] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 63-64.

[14] 布坎南R E, 吉本斯N E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组, 译. 北京: 科学出版社, 1984: 729-794.

[15] USVALAMPI A, KIVIHARJU K, LEISOLA M, et al. Factors a vecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli[J]. Microbiol Biotechnol, 2009, 36: 1323-1330.

[16] 李良智, 芮新生, 万屹东. 微生物及其酶法生产稀有L-戊糖[J]. 化工进展, 2007, 26(5): 750-753.

[17] ZAKARIA A. Production of natural rare pentoses using microorganism and their enzymes[J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2001, 4: 103-111.

[18] TOM B G, GORO T, MASAAKI T, et al. A novel and complete strategy for bioproduction of rare sugars[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004, 97: 89-94.

[19] BEST D. Rare monosaccharides and biologically active iminosugars from carbohydrate chirons[D]. Oxford: University of Oxford, 2010.

[20] REED D, ROBERT M. Production of D- and L-xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwina uredovoru[J]. Applied and Environmental Microbiologyl, 1985, 49: 158-162.

 

收稿日期:2012-12-18

作者简介:张玉宝(1988—),女,硕士,研究方向为发酵工程。E-mail:zhangyubao0201@163.com

*通信作者:刘建军(1962—),男,教授,博士,研究方向为资源微生物开发与利用。E-mail:liujj-2000@163.com