1株产酸性α-淀粉酶黑曲霉原生质体制备和
再生条件优化

王发祥，俞 健，王建辉，李向红，何纪华，刘永乐*

（长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114）

摘 要：通过单因素试验、Plackett-Burman（PB）试验和响应面优化获得产酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生质体制备和再生的最佳工艺参数：黑曲霉种龄72h、孢子浓度7.5×106CFU/mL、渗透压稳定剂甘露醇浓度0.85mol/L，以10g/L蜗牛酶＋10g/L纤维素酶＋10g/L溶菌酶为破壁酶、pH6.8、酶解温度37℃、酶解2h。在此条件下，原生质体制备率可达86.92%，再生率可达42.67%。

关键词：原生质体；酸性α-淀粉酶；黑曲霉；响应面法；制备；再生

Optimization of Protoplast Formation and Regeneration from an Aspergilli niger Strain
Producing Acid-Stable α-Amylase

WANG Fa-xiang, YU Jian, WANG Jian-hui, LI Xiang-hong, HE Ji-hua, LIU Yong-le*

(College of Chemistry and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

Abstract: The optimum conditions for formation and regeneration of protoplasts from Asperigillus niger with a high yield of acid-stable α-amylase were obtained using one-factor-at-a-time experiments, Plackett-Burman design and response surface methodology as follows: seed age of 72 h, spore concentration of 7.5 × 106 CFU/mL, stabilization of the osmotic pressure using 0.85 mol/L mannitol, and hydrolysis of cell walls with a mixture of snailase (10 g/L), cellulose (10 g/L) and lysozyme (10 g/L) at 37 ℃, pH 6.8 for 2 h. Under these conditions, the rates of protoplast formation and regeneration reached 86.92% and 42.67%, respectively.

Key words: protoplast; acid-stable α-amylase; Aspergilli niger; response surface methodology; formation; regeneration

中图分类号：Q93.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2014)01-0155-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401030

耐酸性α-淀粉酶是在低酸性条件下能水解淀粉的
α-淀粉酶。当前常用的中温和高温α-淀粉酶多为中性α-淀粉酶（最适pH6.0～7.0），在酸性条件下其酶活性明显降低，不能满足酸性条件下淀粉原料深加工工艺的要求[1-2]。目前，国内外很多研究团队已对耐酸性α-淀粉酶进行了大量研究，获得了一些产酸性α-淀粉酶的芽孢杆菌和曲霉，并进行了一些菌种选育和基因工程改造的研究[3-7]，但目前仍无法满足其产业化要求；很多国家也已有耐酸性α-淀粉酶的发酵产品，但其价格昂贵难以满足市场的需要。因此，开发酸性α-淀粉酶具有重要的现实意义。

微生物原生质体诱变技术是工业微生物育种的主要技术，相比常规诱变育种技术具有操作简单、诱变效果好等优点[8-9]。目前，原生质体诱变菌种选育的相关研究很多，并在产糖化酶、菊粉酶、β-葡萄糖甘酶、单宁酶、植酸酶等菌株选育中获得了一定成功[10-12]，但以该技术选育高产酸性
α-淀粉酶黑曲霉菌株的研究较少，本实验通过Plackett-Burman （PB）试验和响应面法，优化1株产酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生质体制备和再生的条件，为曲霉孢子原生质体制备提供了参考，也为其后续的原生质体诱变育种提供方便。

1 材料与方法

1.1 菌株、试剂与培养基

黑曲霉JC06，为本实验室筛选和保藏。

蜗牛酶、纤维素酶 上海索莱宝生物科技有限公司；溶菌酶 上海博奥生物科技有限公司；β-巯基乙醇、D-甘露醇、D-山梨醇 国药集团化学试剂有限公司。

低渗培养基（g/L）：可溶性淀粉10、蛋白胨10、酵母膏5、MgSO4 0.5、MnSO4 0.3、FeSO4 0.3、pH4.5；高渗（再生）培养基：低渗培养基中加入终浓度为0.8mol/L的甘露醇。

1.2 方法

1.2.1 原生质体制备和再生

黑曲霉JC06接种于PDA斜面培养基，28℃培养一定时间，无菌水洗脱孢子，参考文献[9]方法制备孢子原生质体和再生。

1.2.2 单因素试验

按上述方法制备孢子原生质体和再生，计算制备率和再生率。分别考察不同种龄（36、48、60、72、84、96h）、孢子浓度（5×104、1×105、4×105、8×105、1.6×106CFU/mL）、渗透压稳定剂（蔗糖、NaCl、KCl、甘露醇、山梨醇、MgSO4，均为0.8mol/L）、复合破壁酶配比及酶质量浓度（20g/L蜗牛酶＋10g/L纤维素酶、20g/L蜗牛酶＋10g/L溶菌酶、10g/L蜗牛
酶＋20g/L纤维素酶、10g/L蜗牛酶＋10g/L纤维素
酶＋10g/L溶菌酶、20g/L蜗牛酶＋5g/L纤维素酶＋5g/L溶菌酶）、酶解时间（1、2、3、4、5h）、酶解温度（27、32、37、42℃）等条件对其制备率和再生率的影响。

1.2.3 PB试验设计

根据单因素试验结果，以Minitab 16软件按表1设计PB试验[13]，以原生质体制备率和再生率的乘积为响应值，确定对响应值影响显著的重要因素。

表 1 PB试验因素水平设计

Table 1 Factors and levels for PB experimental design

1.2.4 响应面法优化试验

根据单因素和PB试验结果，以原生质体制备率和再生率的乘积为响应值，利用Design-Expert 7.1.3软件设计Box-Behnken试验[14-15]，共15个试验点，其中3个为中心点，用以估计试验误差，因素水平如表2所示。

表 2 Box-Behnken试验因素水平设计及编码

Table 2 Coded and actual values for variables used in Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

单因素试验结果（部分结果略）表明，种龄、孢子浓度、渗透压稳定剂、复合破壁酶配比及酶质量浓度、酶解时间、酶解温度对黑曲霉孢子原生质体的制备和再生均有一定影响，而且对制备率和再生率的影响程度不一致。因此，本实验以制备率和再生率作为主要考察指标，筛选到的各因素最佳水平为种龄72h，孢子浓度为7.5×106CFU/mL，
甘露醇为酶解液和再生培养基的渗透压稳定剂（图1），以10g/L蜗牛酶＋10g/L纤维素酶＋10g/L溶菌酶为破壁酶
（图2），酶解温度为37℃，酶解时间为2h。

图 1 不同渗透压稳定剂对原生质体形成和再生率的影响

Fig.1 Effect of different osmotic stabilizers on protoplast formation and regeneration

A. 20g/L蜗牛酶＋10g/L纤维素酶；B. 20g/L蜗牛酶＋10g/L溶菌酶；C. 10g/L蜗牛酶＋20g/L纤维素酶；D. 10g/L蜗牛酶＋10g/L纤维素酶＋10g/L溶菌酶；E. 20g/L蜗牛酶＋5g/L纤维素酶＋5g/L溶菌酶。

图 2 不同酶组合对原生质体形成和再生率的影响

Fig.2 Effect of different enzyme combinations on protoplast formation and regeneration

2.2 PB试验结果

PB设计是一种两水平的试验设计方法，能以最少的试验次数在众多变量中筛选出对响应值影响的最重要变量[13,16]。PB试验设计和孢子原生质体制备率和再生率乘积见表3。

方差分析（略）表明主效应在95%水平显著（P=0.016＜
0.05），其中因素种龄（A）、甘露醇浓度（C）的P值分别为0.010、0.002，在95%水平对结果影响显著，孢子浓度（P=0.058）、酶解时间（P=0.130）等其余因素不显著（P＞0.05）。另外，甘露醇浓度、种龄、pH值和温度为正效应，表明高水平相对较好；酶解时间、孢子浓度和酶质量浓度为负效应，表明低水平相对较好。各因素标准化效应的Pareto图如图3所示，各因素对响应值影响的重要性依次为：甘露醇浓度＞种龄＞孢子浓度＞酶解时间＞pH值＞复合破壁酶配比及酶质量浓度＞酶解温度，其中甘露醇浓度、种龄、孢子浓度在α=0.1水平对响应值影响显著，可作为决定黑曲霉孢子原生质体制备率和再生率的重要因素。

表 3 Plackett-Burman试验设计及结果

Table 3 Plackett-Burman experimental design and results

图 3 各因素标准化效应的Pareto图（α=0.10）

Fig.3 Pareto chart for standardized effect of each factor (α=0.10)

2.3 响应面法优化试验结果

根据PB试验确定的重要因素以及单因素试验结果，进一步以响应面法优化黑曲霉孢子原生质体制备和再生的条件，以制备率和再生率的乘积（Y）为响应值，结果见表4。

表 4 响应面试验设计及结果

Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

对表4试验结果进行二次多元回归拟合，获得回归模型方程为：Y =36.94＋1.54X1＋0.69X2＋3.66X3－3.03X1X2－
1.45X1X3－2.11X2X3－9.10X12－5.05X22－7.31X32，方差分析（表5）显示该模型显著（P=0.0007＜0.05），失拟项不显著（P=0.0539＞0.05），R2为0.9829，说明回归方程能较好地预测实验结果。根据回归方程作出等高线图及响应面图，由图3可以直观看出各因素及其交互作用的变化趋势对制备率和再生率乘积的影响，且回归模型存在最大值。每个响应曲面均有明显的峰，说明甘露醇浓度、种龄及孢子浓度3个因素的最佳取值较好地落在设计范围内[17]，结合等高线图，其最佳取值分别位于0.8～0.9mol/L、69～78h、7.0×106～8.0×106CFU/mL范围；而且甘露醇浓度和孢子浓度对应的曲面比较陡峭，说明这两个因素相对于种龄对结果影响更加显著[18-19]，这与方差分析的结果（表5）一致。

表 5 方差分析

Table 5 ANOVA for the response surface quadratic regression model

注：*.P＜0.05，表示差异显著。

图 4 3种重要因素对原生质体制备和再生率的响应面图

Fig.4 Response surface plots showing the effects of three experimental conditions on protoplast formation and regeneration

为了进一步确定变量的最佳取值点，通过模型方程求导[15,20]，得到原生质体制备率和再生率乘积有最大响应值时3个因素的取值，即孢子浓度7.66×106CFU/mL、种龄71.97h、甘露醇浓度0.85mol/L。该条件下预测得原生质体制备率和再生率乘积为37.44%。考虑到实际操作的便利，将最优条件修正为孢子浓度7.5×106CFU/mL、种龄72h、甘露醇浓度0.85mol/L，在该优化条件下进行3次验证实验，测得实际原生质体制备率为（86.92±2.25）%，再生率为（42.67±1.30）%，二者乘积为37.09%，略低于预测值，说明用该回归方程分析所得优化提取条件是可信的。

3 结 论

通过单因素试验、PB试验和响应面法优化产酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生质体制备和再生的条件，获得的最佳工艺参数为：黑曲霉种龄72h、孢子浓度7.5×106CFU/mL、渗透压稳定剂甘露醇浓度0.85mol/L，以10g/L蜗牛酶＋10g/L纤维素酶＋10g/L溶菌酶为破壁酶、pH6.8、酶解温度37℃、酶解时间2h。在此条件下，原生质体制备率可达86.92%，再生率可达42.67%，较以前类似报道[8-9]有一定提高。本研究为后续的酸性α-淀粉酶高产黑曲霉菌株的原生质体诱变选育工作提供实验依据。

参考文献：

[1] 刘永乐, 李忠海, 杨培华, 等. 产耐酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其固态发酵条件的优化[J]. 中国酿造, 2007(8): 29-32.

[2] 杨培华, 李忠海, 刘永乐, 等. 耐酸性α-淀粉酶的开发与应用[J]. 食品与机械, 2006, 22(5): 132-136.

[3] YASUJI M, MOTOO A. Acid-stable-amylase of black aspergilli part Ⅱ[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1968, 32(1): 104-109.

[4] 张丽苹, 徐岩, 金建中. 酸性α-淀粉酶的研究与应用[J]. 酿酒, 2002, 29(3): 19-22.

[5] LIU Yihan, LU Fuping, LI Yu, et al. Acid stabilization of Bacillus licheniformis alpha-amylase through introduction of mutations[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 80: 795-803.

[6] 姚婷, 李华钟, 房耀维, 等. 定点突变提高Thermococcus siculi HJ21高温酸性α-淀粉酶的催化活性[J]. 食品科学, 2011, 32(15): 148-152.

[7] 曾庆梅, 魏春燕, 靳靖, 等. 黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[J]. 食品科学, 2011, 32(17): 219-224.

[8] 张卫兵, 甘伯中, 李帆, 等. 产植酸酶黑曲霉Px原生质体的制备与再生[J]. 中国饲料, 2010(18): 39-41.

[9] 潘力, 李立风, 彭昶, 等. 酱油曲霉孢子原生质体的制备与紫外诱变育种[J]. 食品与发酵工业, 2006, 32(8): 1-4.

[10] 李文利, 曹泽虹, 董玉玮, 等. 黑曲霉原生质体诱变选育内切型菊粉酶生产菌株[J]. 食品科学, 2012, 33(9): 144-148.

[11] 李秀珍, 杨平平, 王燕. 黑曲霉原生质体诱变育种技术研究进展[J]. 中国酿造, 2007(12): 1-5.

[12] CAO Junwei, CHEN Shuyun. Ultraviolet mutagenesis of the cellulase producer Aspergillus niger using protoplasts[J]. FEMS Microbiology Letters, 1988, 50: 1-4.

[13] STANBURY P F, WHITAKER A, HALL S J. Principles of fermentation technology[M]. Oxford: Pergamon Press, 1986: 93-122.

[14] FERREIRAA S L C, BRUNSB R E, FERREIRA H S, et al. Box-Behnken design: an alternative for the optimization of analytical methods[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 597(2): 179-186.

[15] 王满生, 刘永乐, 王发祥, 等. 响应曲面法优化草鱼肉冷杀菌工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(20): 48-51.

[16] ZHOU Jiangya, YU Xiaojuan, DING Cong, et al. Optimization of phenol degradation by Candida tropicalis Z-04 using Plackett-Burman design and response surface methodology[J]. Journal of Environmental Sciences, 2011, 23(1): 22-30.

[17] FRANCIS F, SABU A, NAMPOOTHIRI K M, et al. Use of response surface methodology for optimizing process parameters for the production of α-amylase by Aspergillus oryzae[J]. Biochemical Engineering Journal, 2003, 15: 107-115.

[18] GANGADHARAN D, SIVARAMAKRISHNAN S, NAMPOOTHIRI K M, et al. Response surface methodology for the optimization of alpha amylase production by Bacillus amyloliquefaciens[J]. Bioresource Technology, 2008, 99: 4597-4602.

[19] 周婷婷, 郑杨, 吕茜, 等. 响应面法优化高溶解性花生蛋白提取工艺[J]. 食品科学, 2012, 33(22): 22-26.

[20] 胡晓静, 谢英利, 叶群, 等. 响应面法优化以中药为基质的灰树花菌丝体发酵培养基[J]. 食品科学, 2012, 33(9): 127-130.