UPLC-DAD法快速测定改善睡眠类保健食品中违法添加的14种精神药物

林 芳，李 涛*，李 继，朱小红，杨 淼

(陕西省食品药品检验所，陕西 西安 710061)

摘 要：建立超高效液相-二极管阵列检测方法，用于同时快速测定改善睡眠类保健食品中违法添加的14种精神药物(阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、地西泮、马来酸咪达唑仑、三唑仑、硝西泮、巴比妥、氯氮卓、劳拉西泮、异戊巴比妥、奥沙西泮、苯巴比妥、司可巴比妥钠)。采用ZORBAX SB-C18(2.1mm×100mm，1.8μm)色谱柱，流动相甲醇-0.2%乙酸溶液，梯度洗脱，流速为0.4mL/min。采集210nm(0～7.70min)、230nm(7.70～13.50min)色谱合成图进行初筛和定量。并根据14种药物的光谱特征建立光谱库，用于检出化合物的确证。结果表明：14种精神药物在13.5min内可有效分离，在5～50μg/mL或10～100μg/mL的线性范围内相关系数(r)均大于0.9995，平均回收率在固体基质中为80.4%～106.2%；在液体基质中为80.7%～102.3%，相对标准偏差(RSD)都小于7%，检测限为3～6ng。该方法简便、快速、灵敏度高且重复性好。可作为检测改善睡眠类保健食品中违法添加化学药物的快速测定方法。

关键词：保健食品；改善睡眠；违法添加；快速测定；超高效液相-二极管阵列

Rapid Determination of 14 Psychoactive Drugs in Sleep-Improving Health-Care Foods by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Photodiode Array Detection

LIN Fang，LI Tao*，LI Ji，ZHU Xiao-hong，YANG Miao

(Shaanxi Institute for Food and Drug Control, Xi’an 710061, China)

Abstract：A method of ultra performance liquid chromatography-photodiode array detection (UPLC-DAD) has been established for the rapid simultaneous determination of 14 psychoactive drugs (alprazolam, estazolam, clonazepam, diazepam, phenobarbital, midazolam maleate, triazolam, nitrazepam, barbital, secobarbital, chlordiazepoxide, lorazepam, amobarbital, and oxazepam) that are illegally added in sleep-improving health-care foods. A ZORBAX SB-C18 column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) was applied. Methanol-0.2% acetic acid was selected as the mobile phase in a linear gradient elution mode,with flow rate of 0.4 mL/min.
The detection wavelengths were 210 nm and 230 nm for rapid screening and quantitation. The results showed that the 14 psychoactive drugs could be effectively separated in 13.5 min, and the standard curves had good linearity over the concentration range of 5–50 μg/mL or 10–100 μg/mL. The correlation coefficients (r) were all above 0.9995. The average recoveries varied from 80.4%–106.2% and the detection limits were in the range of 3–6 ng for the psychoactive drugs. This developed method is characteristics of simple operation, rapid determination, high sensitivity and excellent reproducibility so that it is suitable for the rapid determination of d 14 illegal psychoactive drugs in sleep-improving health-care foods.

Key words：health-care food；sleep improvement；illegal addition；rapid determination；ultra performance liquid chromatography-photodiode array detection (UPLC-DAD)

中图分类号：TS207.7；O657.72 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0218-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322044

现代生活节奏越来越快，很多人面临失眠的困扰，改善睡眠类保健食品的市场需求日益增长。同时，一些不法商家为了增加疗效、牟取暴利，在部分产品中添加了可促进疗效的化学类精神药物。这类精神药物，如长期使用不当，将对人体造成极大的危害[1-3]。现有的国标检测方法[4] 采用液相双系统检测此类14种精神药物，每个样品的检测时间在100min左右，较为费时，对仪器、试剂的损耗均较大，不能满足市场监管时大量样品快速筛查及定量的需要。根据相关文献[5-19]报道，采用薄层色谱法、普通高效液相色谱法、色谱质谱联用等方法对该类非法添加物进行检测，存在检测种类有限，专属性、灵敏性等不强、操作较复杂或定性、定量不能同时完成等问题。如果能够快速有效地检测该类保健食品中的违法添加成分，将对加强市场监管和保障人民群众健康起到积极的作用。与传统的高效液相系统比，超高效液相系统具有更高的分离速度，分辨率和灵敏度高[20-21]。本实验结合DAD检测器的光谱特征分析，可以在一次运行中同时完成快速筛查、光谱确证、定量分析。本实验建立了快速筛查改善睡眠类保健食品中非法添加精神药物阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、地西泮、马来酸咪达唑仑、三唑仑、硝西泮、巴比妥、氯氮卓、劳拉西泮、异戊巴比妥、奥沙西泮、苯巴比妥、司可巴比妥钠的超高效液相-二极管阵列(ultra performance liquid chromatography-photodiode array detector，UPLC-DAD)检测方法。该方法可使上述14种精神药物在短时间内有效分离，线性及回收良好，简便、快速、灵敏度高且重复性好，可作为检测改善睡眠类保健食品中非法添加精神药物的快速筛查方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

检测样品为2012年陕西省保健食品安全集中整治工作中，从全省11个市(区)抽查到的声称具有改善睡眠功能的保健食品和部分使用者、企业提供的改善睡眠产品，共计80余批。

甲醇、乙酸(HPLC级) 美国Tedia公司；三氯甲烷(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

对照品：阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、地西泮(纯度99.9%)、马来酸咪达唑仑(纯度99.9%)、三唑仑、硝西泮、巴比妥、氯氮卓(纯度99.7%)、劳拉西泮、异戊巴比妥、奥沙西泮 中国食品药品检定研究院；苯巴比妥、司可巴比妥钠 国家麻醉品实验室提供。

1.2 仪器与设备

1290 infinity超高效液相色谱仪(配有1290DAD二极管阵列检测器) 美国Agilent公司；HH-S6电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；AS20500B超声波清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱及光谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；进样量：2μL。流动相甲醇-0.2%乙酸溶液，梯度洗脱。

检测波长：0～7.70min检测波长210nm；7.70～13.50min检测波长230nm。参比波长500nm，参比带宽40nm。叠加后形成0～13.50min的色谱图。

光谱条件：光谱范围190～400nm，光谱步进值1.0nm，光谱采集模式：全部。

1.3.2 对照品溶液的配制

准确称取1.1节所述14种对照品各约20mg，分别置于25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得单标储备液，质量浓度约为0.8mg/mL。再从各单标储备液中准确移取1.5～3mL，置于同一个25mL容量瓶中，为消除样品基质的影响，采用阴性样品氯仿提取、甲醇转溶提取液(参照1.3.3节处理方法)定容至刻度，得混合标准储备液。再由混合标准储备液梯度稀释成标准曲线各点，同样采用阴性样品提取液作为溶剂，得14种精神药物的系列混合标准曲线溶液，质量浓度为5～100μg/mL。由于改善睡眠类保健食品制剂配方的多样性，本步骤所用的阴性样品为历次抽检中有代表性的固体样品，辅料成分有预胶化淀粉、硬脂酸镁等，经国家食品药品监督管理局批件2009024检测，不含14种精神药物。

1.3.3 样品前处理

样品前处理方法参考相关文献[5, 22-26]、国家食品药品监督管理局批件2009024[4]。取1.1节所述来源样品。固体样品：取样品5次口服剂量(片剂除去包衣，胶囊剂取内容物)，研细。精密称取相当于1次口服剂量样品，置50mL容量瓶中，加三氯甲烷适量，超声处理20min，放冷，加三氯甲烷定容至刻度，摇匀，静置5min。精密量取上清液20mL于蒸发皿中(如静置后仍较浑浊，可经铺有少量脱脂棉的漏斗滤过，再精密量取续滤液20mL)，置水浴中蒸去三氯甲烷，放冷。少量多次加入适量甲醇，使残渣溶解，转移置10mL容量瓶中。甲醇定容至刻度，摇匀，经0.22μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。液体样品：准确移取相当于一次口服剂量的溶液(含酒精样品需先水浴蒸去酒精)，置分液漏斗中，加15mL水稀释混匀，加三氯甲烷振摇提取4次(20、15、15、15mL)，收集三氯甲烷提取液于蒸发皿中，水浴蒸至近干，放冷，少量多次加入适量甲醇，使残渣溶解，转移置10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，经0.22μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。供试品溶液若检出药物含量过高，可根据具体情况再进行稀释。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

以ZORBAX SB-C18(2.1mm×100mm，1.8μm)作为分析柱。分别以乙腈0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH2.5)、乙腈0.2%乙酸溶液、甲醇-0.2%乙酸溶液作为流动相，等度及梯度洗脱，用含14种药物的低浓度混标溶液优化最佳分离条件。实验发现，以乙腈0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH2.5)及乙腈0.2%乙酸溶液为流动相，等度及梯度洗脱，均不能将混标准溶液中的14种药物有效分离(图1、2)。以A：甲醇， B：0.2%乙酸溶液作为流动相，梯度洗脱(表1)，可使14种药物保持足够的分离度和良好的峰形。经相同色谱条件下的对照品单标溶液定位，可确定14种药物的出峰顺序和保留时间，同时检测信号灵敏度较高，分离效果满足检测需要。此条件下梯度分析仅需13.5min。14种精神药物混标准溶液的分离效果见图3。

表 1 梯度洗脱条件

Table 1 Gradient elution conditions

图 1 流动相为乙腈-0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH2.5)梯度洗脱混标溶液分离效果

Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution separated by gradient elution using acetonitrile-0.01 mol/L phosphate buffer (pH 2.5) as the mobile phase

图 2 流动相为乙腈-0.2%乙酸溶液梯度洗脱混标溶液分离效果

Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution separated by gradient elution using acetonitrile-0.2% acetic acid as the mobile phase

同时，结合文献[3-4,20]分别在210nm和230nm波长处对14种精神药物进行检测。结果发现0～7.70min，210nm检测波长条件下分离的前8种精神药物响应较高，7.70～13.50min，230nm检测波长条件下分离的后6种精神药物响应较高(图4、5)。最后确定为0～7.70min采集210nm波长图谱，7.70～13.50min采集230nm波长图谱，再通过Agilent 1290 Chemstation软件合成为一张图谱，作为检测结果图谱(图3)。

1.巴比妥；2.苯巴比妥；3.马来酸咪达唑仑；4.氯氮卓；5.异戊巴比妥；6.硝西泮；7.氯硝西泮；8.司可巴比妥钠；9.艾司唑仑；10.奥沙西泮；11.劳拉西泮；12.三唑仑；13.阿普唑仑；14.地西泮。

图 3 流动相为甲醇-0.2%乙酸溶液梯度洗脱混标溶液分离效果

Fig.3 Chromatogram of mixed standard solution separated by gradient elution using methanol-0.2% acetic acid as the mobile phase

出峰顺序同图3。

图 4 检测波长210nm条件下混标溶液色谱图

Fig.4 Chromatogram of mixed standard solution at 210 nm

出峰顺序同图3。

图 5 检测波长230nm条件下混标溶液色谱图

Fig.5 Chromatogram of mixed standvard solution at 230 nm

2.2 线性关系、定量限和检测限

将1.3.2节得到的14种精神药物的系列混合标曲溶液，按2.1节色谱条件进行检测，以对应的色谱图峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x，μg/mL)进行回归分析。结果表明，14种精神药物在该范围内呈良好的线性关系，线性相关系数(r)均大于0.9995，说明本方法适用于保健食品中14种违法添加精神药物的定量分析。

表 2 14种精神药物的线性方程、相关系数、线性范围、定量限、检测限

Table 2 Calibration curves, correlation coefficients (r), linear ranges, limits of quantification (LOQs), and limits of detection (LODs) for14 psychoactive drugs

表 3 14种精神药物在不同基质的改善睡眠类保健食品中的
加标回收率和精密度(n=6)

Table 3 Recoveries and precision (RSD) of 14 psychoactive drug spiked in different sleep-improving of health-care foods (n =6 )

在本实验条件下，将混合标曲最低点作为本方法的定量限浓度。定量限浓度结合本方法的进样体积，得到本方法定量限(LOQ)。在本实验条件下，将混合标曲溶液连续稀释，以对应色谱峰响应值大于3倍信噪比(RSN)的质量浓度，作为本方法的检测限浓度。检测限浓度结合本方法进样体积，得到本方法的检测限(LOD)。本方法检测限为3～6ng，结果见表2。

由表3所示，14种精神药物，3个添加水平在固体基质中的回收率为80.4%～106.2%；在液体基质中的回收率为80.7%～102.3%，其相对标准偏差(RSD)都小于7%。

2.3 光谱确证分析

分析同时采集190～400nm光谱图，根据14种精神药物的特征吸收光谱建立光谱库(图6)，当样品色谱图中有与对照品色谱图保留时间一致的色谱峰时，即与该保留时间的相应对照品进行光谱匹配度检索，匹配度达90%以上，且峰纯度较高(＞90%)时，可判断该类保健食品中添加了某种精神药物(必要时可用LC-MS-MS进行确证)，同时可计算出该类药物的添加量。下图为14种精神药物建立的光谱库。

图 6 14种精神药物的特征吸收光谱库

Fig.6 Characteristic absorption spectral library of 14 psychoactive drugs

2.4 样品的测定

图 7 检出阳性样品色谱图

Fig.7 Chromatogram of a positive sample

取1.1节中所述样品，按照1.3.3节方法进行提取，并按本实验色谱条件进行检测。共检出非法添加样品3批，某阳性样品色谱图如图7所示，检出添加物与氯氮卓保留时间一致且与氯氮卓对照品光谱匹配度达99%，确定为样品添加有氯氮卓光谱对比图见图8。

A.氯氮卓对照品光谱

B. 阳性样品光谱

图 8 对照品与检出阳性样品光谱对比图

Fig.8 Comparstive spectra of a standard sample and a positive sample

3 结 论

本实验建立了一种用于同时快速测定改善睡眠类保健食品中非法添加的14种精神药物的UPLC-DAD方法。该方法简便、快速、灵敏度高、重复性好。实现了一个液相系统有效分离14种精神药物，样品初筛、光谱确证、含量测定能同时完成，满足市场监管的需要，适合该类保健品中违法添加物的检测。

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