次甲基蓝显色法定量海参硫酸软骨素

续晓琪，薛长湖，张翠玉，于 龙，王彦超，常耀光*

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

摘 要：提取仿刺参、海地瓜、梅花参、美国肉参及北大西洋瓜参5种海参中的海参硫酸软骨素作为标准品，以次甲基蓝与阴离子聚合物形成显色的超分子复合物为理论基础，建立一种海参硫酸软骨素的定量方法。将1.00mL质量浓度适当的海参硫酸软骨素溶液与8.00mL 5mmol/L 磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH7.0)及1.00mL次甲基蓝溶液(0.18mg/mL)混合，其后立即测定545nm波长处的吸光度，吸光度代入对应标准曲线即可计算得出样品质量浓度。该方法操作简便，检出限为1.6～1.8μg/mL，定量限为5.2～6.2μg/mL，精密度、回收率高，可实现对海参硫酸软骨素的快速定量测定。

关键词：海参；海参硫酸软骨素；次甲基蓝；比色；测定

Determination of Chondroitin Sulfate from Sea Cucumber by Methylene Blue Colorimetry

XU Xiao-qi，XUE Chang-hu，ZHANG Cui-yu，YU Long，WANG Yan-chao，CHANG Yao-guang*

(College of Food Science and Engineering, Ocean Universitity of China, Qingdao 266003, China)

Abstract：In this study, employing sea cucumber chondroitin sulfate standard samples extracted from 5 species of sea cucumber, an efficient and rapid colorimetric method for determination of chondroitin sulfate from sea cucumber was established based on the theory that methylene blue and anionic polymer can form supramolecular complex. The colorimetric method was determined as follows: detection at 545 nm immediately following mixing of 1.00 mL of sea cucumber chondroitin sulfate solution with 8.00 mL of 5 mmol/L pH 7.0 K2HPO4/KH2PO4 buffer and 1.00 mL of methylene blue (0.18 mg/mL) and subsequent calculation of chondroitin sulfate concentration from the absorbance using the pre-prepared calibration curve. This method proved to be simple, accurate and high-recovery and allow rapid quantitative determination of sea cucumber chondroitin sulfate.

Key words：sea cucumber；sea cucumber chondroitin sulfate；methylene blue；colorimetry；determination

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0246-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-20132249

海参(Holothurian，sea cucumber)是我国传统海产珍品及滋补食品，其营养功能日益受到重视，需求量不断增加，已成为我国重要的经济水产品[1]。海参硫酸软骨素(sea cucumber chondroitin sulfates，SC-CHS)是存在于海参体壁中的一种酸性多糖，由硫酸软骨素骨架及硫酸酯化L-岩藻糖支链组成，可归属为类硫酸软骨素化合物[2]。SC-CHS已被证实具有抑制动物肿瘤生长[3-4]、抗凝血[5-6]、抗胃溃疡活性[7]等多种生理功效，在功能食品开发中展现出良好的应用潜力。

现阶段对SC-CHS使用的测定方法主要包括硫酸-咔唑法[8]、Elson-Morgan法[9]、酶解-高效液相色谱法[10-12]等。其中，硫酸-咔唑法及Elson-Morgan法利用强酸将硫酸软骨素水解成单糖，然后分别使己糖醛酸及氨基己糖显色，继而推算出硫酸软骨素的量，这两种方法简便易行，但灵敏度较低且重复性较差；酶解-高效液相色谱法以硫酸软骨素ABC酶为工具，将硫酸软骨素酶解成其重复结构单元-二糖，再通过高效液相色谱定量二糖从而计算出硫酸软骨素的量，该方法准确度高、特异性好，但是预实验中尝试使用目前市售的各种硫酸软骨素酶降解SC-CHS均未见寡糖产生，这可能是由二者的结构差异(SC-CHS含有支链等)造成。次甲基蓝(methylene blue)是一种醌亚胺类染料，能与聚阴离子发生可逆的静电相互作用形成超分子复合物，在此过程中其颜色从蓝色变为紫色[13-16]。

由于不同海参品种中SC-CHS的结构存有差异[17]，且目前尚无市售的SC-CHS标准品，如使用硫酸软骨素等试剂作为品标准建立方法将不可避免带来误差。鉴于此，本研究选择5种常见市售海参并提取其中的SC-CHS，以此作为标准品，基于次甲基蓝的显色特性，旨在建立一种有效的SC-CHS测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

仿刺参(Apostichopus japonicus)、海地瓜(Acaudina molpadioides)、梅花参(Thelenota ananas)、美国肉参(Isostichopus badionotus)及北大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)干品均购于青岛南山水产市场；次甲基蓝 上海试剂三厂。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外-可见分光光度计 日本岛津公司； 1100型高效液相色谱仪 美国Agilent公司；TSKgel Super AWM-H色谱柱、TSK guard column Super AW-H色谱柱 日本东曹公司；FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；飞鸽牌离心机 上海安亭科学仪器厂；Starter3C实验室pH计 奥斯特仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海参硫酸软骨素的制备

按照实验室前期建立的方法[18]提取5种海参体壁中的SC-CHS：干海参体壁经粉碎、丙酮脱脂、蛋白酶酶解、氯化十六烷基吡啶沉淀、复溶脱盐及离子交换色谱纯化后得到SC-CHS组分。以高效凝胶排阻色谱(high-performance size-exclusion chromatography，HPSEC)法测定获得的SC-CHS的纯度，色谱条件为：色谱柱：TSKgel Super AWM-H柱(6.0cm×150mm)；保护柱：TSK guard column Super AWM-H柱(4.6cm×35mm)；流动相(NaCl溶液)0.2mol/L；流速
0.6mL/min；柱温40℃；检测器为示差检测器。

1.3.2 次甲基蓝显色方法的建立

先以仿刺参SC-CHS为样品对方法条件进行优化。

1.3.2.1 测定波长的确定

分别移取1.00mL质量浓度为0、20、40、60、80μg/mL
及100μg/mL的仿刺参SC-CHS溶液，加入8.00mL 5mmol/L
磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH7.0)及1.00mL次甲基蓝溶液(0.18mg/mL)，混匀后于500～580nm范围内进行波谱扫描，计算各波长处标准曲线的R2值及吸光度的相对标准偏差(RSD)，选择吸光度大、R2值高、RSD低的波长作为测定波长。

1.3.2.2 pH值的确定

取1.00mL仿刺参SC-CHS溶液(60μg/mL)多份，分别加入8.00mL 5mmol/L不同pH值的缓冲液(pH3.0～5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH6.0～8.0的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液；pH9.0～11.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液及1.00mL次甲基蓝溶液，混匀后测545nm波长处的吸光度，考察pH值对显色的影响并确定最适pH值。

1.3.2.3 显色时间的确定

取8份1.00mL仿刺参SC-CHS溶液(60μg/mL)，各加入8.00mL 5mmol/L磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH7.0)及1.00mL次甲基蓝溶液，混匀后分别放置0、15、30、45、60、75、90、105min及120min，测定545nm波长处的吸光度，考察时间对显色的影响。最终综合各条件，确定显色方法。

1.3.3 标准曲线的绘制

取1.00mL 0～100μg/mL SC-CHS溶液按照建立的方法进行显色，分别绘制仿刺参、海地瓜、梅花参、美国肉参、北大西洋瓜参SC-CHS的标准曲线，建立回归方程。

1.3.4 方法特性考察

分别对次甲基蓝显色法定量5种海参SC-CHS的方法特性进行考察，检出限(limit of detection，LOD)及定量限[19] (limit of quantification，LOQ)按式(1)、(2)计算：

LOD=kSniS (1)

式中：k为置信因子，k=3；Sni为空白标准偏差；S为标准曲线斜率的倒数；样本数为10。

LOQ =3.33LOD (2)

取6份1.00mL 60μg/mL SC-CHS溶液，显色后测定吸光度，计算RSD，以考察测定方法的精密度。

取5、20、60μg/mL SC-CHS 1.00mL作为低、中、高质量浓度试样溶液，分别添加10μg SC-CHS，配制成相应质量浓度的加标试样溶液，显色后求算各溶液的SC-CHS质量浓度，计算加标回收率，以各质量浓度条件下加标回收率的平均值评价方法的可靠性[20]。

2 结果与分析

2.1 高纯度海参硫酸软骨素的制备

从仿刺参、海地瓜、美国肉参、北大西洋瓜参、梅花参中提取SC-CHS组分，产物纯度的鉴定结果如图1所示。各SC-CHS的HPSEC图谱呈单一峰，且峰形尖锐、对称，表明其纯度理想。

a.仿刺参

b.海地瓜

c.梅花参

d.美国肉参

e.北大西洋瓜参

图 1 5种高纯度海参SC-CHS的高效凝胶排阻色谱图

Fig.1 HPSEC chromatographs of SC-CHS standards

2.2 次甲基蓝显色方法的建立

A. 20μg/mL；B. 40μg/mL；C. 60μg/mL；D. 80μg/mL；E. 100μg/mL。

图 2 不同质量浓度仿刺参海参硫酸软骨素显色后的光谱扫描图

Fig.2 Absorption spectra of methylene blue with different concentrations of SC-CHS

由图2可知，不同质量浓度SC-CHS显色后的最大吸收波长有一定的差异，但均集中在540～545nm之间。

图 3 各波长处显色标准曲线的R2值

Fig.3 R2 of standard curves of methylene blue colorimetry at different scanning wavelengths

由图3可知，在535～570nm范围内，R2均在0.99以上，说明在此范围内显色程度与样品质量浓度的线性关系较好。

图 4 各波长处吸光度的相对标准偏差

Fig.4 RSD of absorption spectra of methylene blue at different scanning wavelengths

由图4可知，高质量浓度样品的RSD在测定波长范围内均较低，低质量浓度样品RSD高于高质量浓度样品，并在545nm波长处出现最低值。综合以上结果，将测定波长确定为545nm。

图 5 pH值对显色效果的影响

Fig.5 Effect of pH on the absorbance of SC-CHS by methylene blue colorimetry

由图5可知，pH值在3.0～7.0范围内时吸光度随pH值的增大而增强，次甲基蓝与阴离子聚合物通过静电相互作用等方式发生结合[13]，此范围内pH值的改变可能影响到SC-CHS的电离，从而影响显色的程度；当pH值在7.0～11.0范围内时，吸光度的变化不显著。相较其他条件，pH7.0时吸光度的数值较高且误差小，最终将缓冲液体系确定为pH7.0的5mmol/L 磷酸氢二钾-磷酸二氢钾。

图 6 显色时间对显色效果的影响

Fig.6 Effect of color development time on the absorbance of SC-CHS by methylene blue colorimetry

由图6可知，SC-CHS与次甲基蓝的显色在120min内无显著变化，这说明该显色体系稳定性好。在此背景下，选择混匀后立即比色，这为SC-CHS的快速测定提供了基础。

综上，将显色方法确定为：将1.00mL适当质量浓度的SC-CHS溶液与8.00mL 5mmol/L pH7.0 磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH7.0)及1.00mL次甲基蓝溶液(0.18mg/mL)
混合，然后立即测定545nm波长处的吸光度。

2.3 标准曲线的绘制与方法特性考察

表 1 次甲基蓝显色法的方法特性

Table 1 Characteristics of methylene blue colorimetry

注：y.待测样品的吸光度；x.样品中SC-CHS的质量浓度/(μg/mL)。

由表1可知，建立方法的线性范围较大，5种海参SC-CHS显色标准曲线的R2均大于0.999，表明线性关系理想。值得注意的是，5种海参SC-CHS显色回归方程的斜率并不一致，前期研究表明SC-CHS的硫酸根含量及硫酸酯化位点存在种间差异[2]，这可能导致不同品种海参的SC-CHS与次甲基蓝分子间的相互作用行为有所不同，最终表现为显色程度的差别。

方法的检出限在1.6～1.8μg/mL范围内，定量限在5.2～6.2μg/mL范围内，表现出良好的灵敏度[21]。检测5种
SC-CHS的精密度均小于4%，表明方法精密度较高。回收率反映物质在整个实验处理过程中的损失情况，回收率高时方法准确度高[22]，方法的平均加标回收率在101.02%～105.48%之间，表明方法回收率良好、准确可靠。

3 结 论

本研究制备了5种海参的高纯度SC-CHS，在此基础上优化确立了一种SC-CHS的定量方法：1.00mL适当质量浓度的SC-CHS溶液与8.00mL 5mmol/L 磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH7.0)及1.00mL次甲基蓝溶液(0.18mg/mL)混合后立即测定545nm波长处的吸光度，吸光度带入各自的标准曲线，计算可得SC-CHS的质量浓度。该方法操作简便，灵敏度、精密度、回收率高，能够实现对SC-CHS的快速定量测定。

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