大庆自然发酵酸菜中乳酸菌的分离鉴定及
耐酸菌株初步筛选

李 欣，武俊瑞，田 甜，岳喜庆*

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

摘 要：从黑龙江大庆地区采集7份采用传统方法制作的自然发酵酸菜发酵液，从中分离和筛选出14株乳酸菌疑似菌株，提取其16S rDNA，并经测序、同源性分析和系统发育树构建等方法，对其属种进行鉴定。初步筛选出在pH值为2.5、3.0和3.5的酸性条件下均能够生长的耐酸菌株6株，并进一步利用活菌计数法得出菌株在pH3.0条件下的存活率。结果表明：14株菌株均为乳酸菌，其中4株为弯曲乳杆菌（HD12-1、HD13-5、HD14-1和HD15-1），1株为短乳杆菌（HD18-2），3株为清酒乳杆菌（HD12-2、HD13-1和HD16-5），1株为肠膜明串珠菌（HD18-3），5株为植物乳杆菌（HD14-3、HD15-2、HD16-2、HD17-3和HD17-4），且筛选出pH3.0条件下存活率在2%以上的6株菌株，分别为HD12-1、HD13-1、HD14-1、HD15-1、HD16-2和HD16-5。

关键词：酸菜发酵液；乳酸菌；耐酸；鉴定

Isolation, Identification and Preliminary Screening of Acid-Tolerant Lactic Acid Bacteria from
Naturally Fermented Pickle Juices from Daqing

LI Xin, WU Jun-rui, TIAN Tian, YUE Xi-qing*

(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Abstract: Fourteen strains of suspected lactic acid bacteria were isolated from 7 naturally fermented pickle juices gathered from Daqing, Heilongjiang Province. 16S rDNA was extracted from each of these bacterial strains using a bacterial genomic DNA extraction kit. The species were identified by DNA sequencing, homology analysis and phylogenetic tree. The results indicated that the all 14 strains belonged to lactic acid bacteria, including 4 strains of Lactobacillus curvatus (HD12-1, HD13-5, HD14-1 and HD15-1), 1 strain of Lactobacillus brevis (HD18-2), 3 strains of Lactobacillus sakei (HD12-2, HD13-1 and HD16-5), 1 strain of Leuconostoc mesenteroides (HD18-3), and 5 strains of Lactobacillus plantarum (HD14-3, HD15-2, HD16-2, HD17-3 and HD17-4). Among these strains, 6 strains, including HD12-1, HD13-1, HD14-1, HD15-1, HD16-2 and HD16-5, were able to grow at pH 2.5, 3.0 or 3.5, with a survival rate above 2% at pH 3.0.

Key words: pickle juice; lactic acid bacteria; acid tolerance; identification

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2014)01-0150-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401029

酸菜是我国一种传统的发酵食品，多年来深受百姓的欢迎，同时酸菜也是优良乳酸菌的丰富资源库。自然发酵的酸菜口味纯正，但制作工序繁琐，如何使工业生产的酸菜拥有自然发酵酸菜的口味一直是人们研究的课题[1]。乳酸菌是生产发酵乳制品必不可少的微生物菌种，它不仅可以改善食品风味，提高乳制品的营养价值、保藏性和附加值，而且乳酸菌的益生作用是十分突出的，乳酸菌对于肠道中的有益菌群具有多种保健功能[2]。目前普遍使用的乳酸菌鉴定方法有传统的生理生化方法和分子鉴定。但是传统的鉴定方法耗时费力，操作中不稳定性因素多，很容易造成鉴定结果不准确，近年来分子鉴定的手段被越来越多的采用[3]。16S rDNA序列同源性分析就是一种分子水平上鉴定乳酸菌菌种的手段，这种鉴定方法使我们能够从分子和基因水平上认识乳酸菌的多样性[4-7]。

本研究拟利用选择性培养，从7份采自黑龙江大庆地区农户采用传统方法制作的酸菜汁中分离出乳酸菌菌株14株，对其进行16S rDNA序列同源性分析，并进行耐酸菌株的初步筛选，为进一步进行深入的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品采自黑龙江省大庆地区农户采用传统方法制作的7份自然发酵酸菜汁样品。

MRS培养基参照文献[8-9]；细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、DNA Marker 北京天根生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XS-212型生物显微镜 南京江南永新光学有限公司；TGL-16G型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；PHS-25型pH计 上海雷磁仪器厂；Coolsafer55-4型冷冻干燥机 美国基因有限公司；DYY-8C稳流稳压电泳仪 普阳科学仪器研究所；DNA扩增仪 美国Bio-Rad公司；CR-21G冷冻离心机 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

从黑龙江省大庆地区采集7份农户采用传统方法腌制的酸菜发酵液，测定样品pH值和温度，并记录腌制时间，并将样品分装于灭菌的离心管中，采用冰盒保藏，运回实验室中于－80℃冰箱中保存。

1.3.2 乳酸菌的分离纯化

取酸菜发酵液样品过滤除杂后，吸取1mL采用倾注培养法接种于含有体积分数2% CaCO3的MRS固体培养基中，于30℃厌氧培养36～48h后，挑取有溶钙圈的单个菌落接种于MRS固体培养基，37℃厌氧培养24～36h，划线分离2～3次，取白色或乳白色单个菌落观察其菌落特征和菌体特征，并作记录，选取革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的单个菌落[10-13]，分别进行4℃斜面短期保藏[14]和冷冻干燥长期保藏[10-13]。

1.4 16S rDNA序列分析

1.4.1 菌株DNA的提取

将供试菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养18～24h后，4000r/min离心10min收集菌种，并用灭菌生理盐水洗涤，传代培养2～3次后，利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取菌体DNA，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.4.2 16S rDNA基因序列PCR扩增

PCR扩增采用细菌通用引物。正向引物为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物为1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR扩增体系总体积50.0μL，包括1.0μL基因组DNA，5.0μL 10×Buffer（含2.5mmol/L Mg2+），1.0μL Taq聚合酶（5U/μL），1.0μL dNTP（10mmol/L），1.5μL正向27F引物，1.5μL反向1492R引物，39.0μL ddH2O。采用超纯无菌水替代基因组DNA作为PCR阴性对照。

PCR扩增反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1.5min，72℃终延伸7min，共进行45个循环[15-17]。

PCR扩增产物由1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送往北京擎科新业生物公司进行序列测定。

1.4.3 同源性分析与系统发育分析

登陆NCBI（www.ncbi.nlm.gov/blast/）网站，进行同源性分析，并采用MEGA 5.0软件将测得序列与GenBank中的模式菌株16S rDNA序列进行分析，得到系统发育树，获得目的菌的分类地位或它的系统发育地位[18-20]。

1.5 耐酸菌株的初步筛选

将分离鉴定得到的14株菌株分别接种于pH值为2.5、3.0和3.5的MRS液体培养基中，37℃培养24h，观察菌株生长情况，能生长的菌株作为可能具有潜在耐酸特性的菌株。选取在pH值为2.5、3.0和3.5条件下均能生长的菌株，制备纯净的菌悬液，并将菌悬液以2%的接种量接种到pH3.0的MRS液体培养基中，37℃培养2h，分别取0h和2h的菌液倾注平板进行活菌计数，并计算存活率，以此判断菌株在pH3.0条件下的耐酸能力[21]。

2 结果与分析

2.1 样品采集情况

从大庆所采集7份样品的pH值、温度、腌制时间等情况如表1所示。所采集7份样品的pH值在3.8～6.2，温度在3.4～20.0℃，腌制时间在55～80d。发酵液均偏酸性，温度和腌制时间存在差异。

表 1 样品采集

Table 1 Pick juices from different fermentation conditions

2.2 菌落及菌体特征

2.2.1 菌落特征

从7份样品中分离得到14株直径在1.0～2.0mm、乳白色圆形菌落的乳酸菌疑似菌株，对其编号，观察并记录各株菌菌落特征，如表2所示，部分菌株菌落形态如图1所示。由表2可知，从7份样品中选取14个疑似乳酸菌菌落，其菌落直径均在1.1～2.0mm，且均为边缘规则、乳白色的圆形菌落。其中，HD12-1、HD12-2、HD13-1、HD13-5这4个菌落表面较湿润，其余菌落表面均湿润；HD12-1、HD12-2、HD13-5、HD14-1、HD14-3、HD18-3这6个菌落表面不光滑，其余菌落表面均光滑。

表 2 供试菌株菌落特征

Table 2 Colony characteristics of 14 suspected strains

a. HD12-1；b. HD12-2；c. HD14-3；d. HD18-2；e. HD18-3。图2同。

图 1 部分菌株菌落照片

Fig.1 Colonies of five of the suspected strains

2.2.2 菌体特征

表 3 供试菌株菌体特征

Table 3 Bacterial characteristics of 14 suspected strains

分别对上述14株菌进行革兰氏染色、过氧化氢酶实验，并于100倍光学显微镜下观察革兰氏染色结果、菌体形态及特征，如表3所示，部分供试菌株革兰氏染色结果如图2所示。14株菌株均为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的单一菌株，其中HD18-2为极短杆菌，HD18-3为球菌，其他菌株均为短杆菌，且菌体的排列方式有链状和单个排列。

图 2 部分菌株革兰氏染色照片

Fig.2 Observation of Gram-stained strains

2.3 16S rDNA序列同源性分析

2.3.1 菌株基因组DNA提取

1. HD12-1；2. HD12-2；3. HD13-1；4. HD13-5；5. HD14-1；6. HD14-3；7. HD15-1；8. HD15-2；9. HD16-2；10. HD16-5；11. HD17-3；12. HD17-4；13. HD18-2；14. HD18-3。图4同。

图 3 DNA检测电泳图

Fig.3 Electrophoresis of genomic DNA samples isolated from 14 suspected strains

采用试剂盒提取菌株基因组DNA，产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测电泳图有且只有一个条带，则可进行16S rDNA基因序列PCR扩增，如图3所示，各菌株DNA提取产物条带单一，可以满足PCR扩增的要求。

2.3.2 16S rDNA基因序列PCR扩增

将各菌株基因组DNA进行16S rDNA基因序列PCR扩增，同时进行PCR阴性对照实验，扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。PCR阴性对照无条带，各菌株PCR产物条带单一，在1500bp处有特异性条带，满足测序的要求。

M. Marker；0.阴性对照。

图 4 PCR产物检测电泳图

Fig.4 Electrophoresis of PCR products

2.4 16S rDNA序列分析与系统发育树的建立

2.4.1 16S rDNA同源性对比

利用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），将所测定的14株菌株的16S rDNA序列，与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知细菌的16S rDNA/rRNA序列进行比较鉴定，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种，结果如表4所示。

表 4 16S rDNA同源性序列对比结果

Table 4 Alignment of homologous 16S rDNA sequences among 14 suspected strains

将14株菌的16S rDNA序列与GenBank中的已知序列进行对比可知，菌株HD12-1、HD13-5、HD14-1和HD15-1等4株菌与弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）同源性最高；菌株HD18-2与短乳杆菌（Lactobacillus brevis）同源性最高；菌株HD12-2、HD13-1和HD16-5等3株菌与清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）同源性最高；菌株HD18-3与肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）同源性最高；菌株HD14-3、HD15-2、HD16-2、HD17-3和HD17-4等5株菌与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）同源性最高，且14株菌株的同源性均可达到99%以上。

2.4.2 构建系统发育树

图 5 菌株系统发育树

Fig.5 Phylogenetic tree for 14 lactic acid bacteria (LAB) and other related bacteria based on their 16S rDNA sequences

将测定菌株构建系统发育树，如图5所示，菌株HD12-1、HD13-5、HD14-1和HD15-1等4株菌与弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）系统位置最为接近，HD12-2、HD13-1和HD16-5等3株菌与清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）系统位置最为接近，菌株HD18-2与短乳杆菌（Lactobacillus brevis）系统位置最为接近，菌株HD14-3、HD15-2、HD16-2、HD17-3和HD17-4等5株菌与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）系统位置最为接近。根据16S rDNA同源性对比结果和系统发育树，菌株HD12-1、HD13-5、HD14-1和HD15-1等4株菌鉴定为弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus），HD12-2、HD13-1和HD16-5等3株菌株鉴定为清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei），菌株HD18-2鉴定为短乳杆菌（Lactobacillus brevis），菌株HD14-3、HD15-2、HD16-2、HD17-3 和HD17-4等5株菌株鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

近年来，对于乳酸菌的研究越来越受到关注，研究的技术方法也日趋成熟。张杨[11]、陈晓平[1]、张鲁冀[22]等从自然发酵酸菜汁中分离鉴定出干酪乳杆菌、短乳杆菌、棒状乳杆菌、植物乳杆菌、米酒乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和肠膜明串珠菌。其中，陈晓平等[1]从自然发酵酸菜汁中分离出3株高产酸菌株分别为肠膜明串珠菌、短乳杆菌和植物乳酸杆菌。乌日娜[15]、艾日登才次克[18]等将酸马奶等内蒙古传统乳制品中分离得到的乳酸菌菌株进行分子生物学鉴定。

2.5 耐酸菌株初步筛选

将14株乳酸菌菌株分别接种于pH值为2.5、3.0和3.5的MRS液体培养基中培养，观察生长情况，初步判定其是否具有耐酸特性，如表5所示。

表 5 菌株在不同pH值条件下的生长情况

Table 5 Growth of 14 LAB strains at pH 2.5, 3.0 and 3.5

注：－.不生长；＋.生长情况一般；＋＋.生长情况良好。

选取在pH值分别为2.5、3.0和3.5条件下均能生长的菌株HD12-1、HD13-1、HD14-1、HD15-1、HD16-2、HD16-5进行pH3.0条件下存活率实验，如表6所示。

表 6 菌株在pH3.0条件下存活率

Table 6 Survival rates of six selected strains at pH 3.0

由表6可知，菌株在pH3.0条件下培养2h后，菌落数均有所下降。存活率最高的乳酸菌菌株为HD16-2，达到10.73%，存活率最低的菌株为HD14-1，2.45%。6株乳酸菌菌株的存活率均在2%以上，可以作为具有潜在益生特性的耐酸乳酸菌菌株。

3 结 论

本实验从7份采自黑龙江大庆地区的传统酸菜发酵液中提取出14株菌株，对其进行16S rDNA序列同源性分析，并进行了耐酸特性的筛选。结果表明，14株菌株中包括4株弯曲乳杆菌、1株短乳杆菌、3株清酒乳杆菌、1株肠膜明串珠菌和5株植物乳杆菌，其中6株菌株在pH3.0条件下生存能力较强。本实验筛选出的乳酸菌菌株来源于传统的自然发酵制品，且经过筛选均为具有潜在益生特性的菌株，为进一步研究奠定基础。

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