肠道微生物蛋白质的发酵与肠道健康的关系

周中凯，杨 艳，郑排云，张 岩，陈晓姗

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

摘 要：人体内蛋白质发酵主要发生于结肠末端，会产生一些不利于健康的代谢产物如氨类、胺类、酚类化合物和硫化物等。一些重要的肠道疾病如大肠癌、溃疡性结肠炎的发生都集中于结肠末端，这与在该部位的蛋白质的高度发酵有关。流行病学研究表明，高肉类食物通常与大肠癌的发生呈正相关性，这是因为高肉食的摄入不仅增加了蛋白质在大肠中的含量，而且还增加了脂肪、荷尔蒙和杂环胺的摄入，这些物质对大肠癌的发生也起到促进的作用。然而，肠道健康和蛋白质的发酵之间的潜在关系还没有得到充分的研究，本文就蛋白质在肠道发酵所产生的一些潜在危害化合物及其在体内代谢循环的研究进行综述。

关键词：大肠癌；遗传毒性；益生元；益生菌；蛋白质发酵

Relationship between Gut Microbial Fermentation of Proteins and Gut Health

ZHOU Zhong-kai, YANG Yan, ZHENG Pai-yun, ZHANG Yan, CHEN Xiao-shan

(College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Abstract: Protein fermentation mainly occurs in the distal colon, resulting in the production of potentially toxic metabolites such as ammonia, amines, phenols and sulfides. In addition, some important bowel diseases such as colorectal cancer (CRC) and ulcerative colitis (UC) appear most often in the distal colon, which are related to the high protein fermentation at these areas. Epidemiological studies revealed that diets rich in meat are associated with the prevalence of CRC, because the intake of meat not only increases thve fermentation of proteins, but also enhances the intake of fat, hormone and heterocyclic amines, which may also play an important role in the development of CRC. However, the relationship between gut health and protein fermentation has not been thoroughly investigated. In this review, the existing evidence regarding the potential toxicity of protein fermentation from in vitro animal and human studies is summarized.

Key words: colorectal cancer (CRC); genetic toxicity; prebiotics; probiotics; protein fermentation

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2014)01-0303-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401060

肠道微生物利用未消化的蛋白质进行厌氧发酵，这种发酵过程在总体上被认为是对宿主的健康不利的一种生物过程，蛋白质的发酵产生一系列的代谢产物，这些化合物与肠道的黏膜功能有关并且与黏膜细胞发生反应[1-2]。蛋白质发酵不仅与大肠癌发生的病理学有关并且与溃疡结膜炎（ulcerative conjunctivitis，UC）的发生密切相连，与人体生理衰老过程也有着极大的关系。蛋白质对肠道健康的研究也愈来愈受到人们的关注，这是因为目前在控制体质量和减肥等方面多采用高蛋白的食谱。

30年前人们就假设肠道蛋白质的发酵与大肠癌的产生有很大的关系[3]，Hill等[4]研究食物蛋白质代谢产物与肠道癌的病理学关系并提出肠道细菌可将胆汁酸转化成与致癌物性质相关联的化合物，然而，高肉食的摄入与增加大肠癌的几率关系似乎不能仅由在胆汁酸的浓度来解释，这是因为在高肉食摄入食谱研究对象中其肉食物对胆汁酸的排出起到很小的作用[3]。另外，蛋白质作为肉食的主要成分，其发酵的代谢物如氨、酚类化合物等被认为是潜在致癌物质，这些物质通过发酵所产生的一些代谢物可能与大肠癌的关系更为密切。

有关研究表明，肠道中微生物发酵对宿主肠道的健康影响是由于蛋白质在这些区域的代谢活性更为活跃，例如在大肠的末端，UC在直肠处开始然后扩散，大约60%的大肠癌的发生地带集中于结肠末端或直肠[5]。Chao等[6]通过延长高肉食摄入证实了红肉和加工肉制品可能会增加大肠末端区域的癌症的发生率。

本文提供了蛋白质在体内外模型的发酵并概述了蛋白质发酵对宿主健康影响的一些研究证据。对蛋白质作为人体必需营养素，在人体营养素的代谢中起到重要作用，如肌肉生长、人体免疫系统和细胞再生等[7]，在本文中不再进行讨论。

1 影响蛋白质发酵的因素

大约15%～20%的能量是通过摄入蛋白质供给的，进入大肠的蛋白质含量取决于食物中蛋白质的含量和蛋白质的消化率，来源于动物的蛋白质（如乳品和动物蛋白）其消化率可能高达90%，高于植物蛋白的70%～90%。来源于乳品的蛋白质（如乳清蛋白、酪蛋白）的消化率略高于肉类蛋白质[8]，使用同位素技术，Evenepoel等[9]比较生的和蒸煮的鸡蛋蛋白的消化率，发现进入大肠的蛋白质的量和发酵代谢产物取决于蛋白质的消化率。酪蛋白经过较强热处理（加热到180℃、1h）后显著地降低了蛋白质的消化率，但增加了蛋白质发酵的程度[10]。然而，在大肠切除患者当中，不同来源的蛋白质的消化率又呈现出相似性，在小肠排泄物中氮的排出量与膳食中氮的摄入呈很好的线性关系，这个研究结果表明，正常情况下的饮食中蛋白质的量而不是其来源决定了其进入大肠的量。

2 蛋白质发酵产物

大肠中将蛋白质降解成寡肽类和氨基酸类的水解过程是在细菌分泌的蛋白酶和肽酶的共同作用下发生的，这些酶在中性和碱性条件下活性最大。在大肠的初始区域，pH值偏酸性，这是因为碳水化合物发酵产生短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）的缘故，随着向大肠后端的迁移，碳水化合物的发酵终结，pH值上升，蛋白质的发酵则变为活跃。

尽管SCFA是碳水化合物发酵的主要终端产物，其也可以通过蛋白质的还原脱氨基作用而生成[11]，SCFA能快速被吸收并且对人体产生有利的影响。作为SCFA主要成分之一，丁酸是肠道细胞最重要的能量来源，在细胞繁殖和分化中起到重要的作用[12]，其功能还包括抑制肠道癌细胞和肠道炎症的发生，降低氧化压力，加强结肠的防御屏障[13]。

与SCFA相比，支链脂肪酸（branched chain fatty acid，BCFA）仅仅是由支链氨基酸所发酵产生的，例如，异丁酸、异戊酸和2-甲基丁酸乙酯，分别由缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸发酵产生[14]。

NH3是在细菌作用下将氨基酸脱氨基得到的，一小部分是由细菌脲酶催化尿素水解得到[11]，在肠道中大约每天可产生3.5～4.0g的NH3[15]，导致肠道中NH3的浓度可达到60mmol/kg肠内物[16]，NH3还可被细胞利用从而进入代谢循环用于蛋白质的合成，另外，它可被大肠吸收转变为尿素并以尿的形式排出。

芳香族氨基酸在大肠被微生物发酵后可产生酚类和吲哚类化合物（图1），酪氨酸的降解产物包括对羟苯基丙酮酸双氧化酶、4-羟苯基乙酸盐、4-羟基苯丙酸和羟基苯乙酸，还有苯酚、甲酚、乙基苯酚。苯丙氨酸经细菌代谢物也会产生相类似的衍生物如酮酸、苯乳酸、乙酸苯酯等。色氨酸降解产生吲哚、3-甲基吲哚、吲哚醋酸盐和吲哚丙酸盐，酚类化合物大部分在肠道中被吸收，在肠道黏膜和肝脏中通过葡糖甘酸和硫酸盐的共轭作用被脱毒，最后以尿液形式排出，大约90%尿液中酚类化合物以甲酚形式排出体外[17]。

图 1 芳香族氨基酸酪氨酸（A）、苯丙氨酸（B）和色氨酸（C）的降解路径

Fig.1 Degradation pathways of the aromatic amino acids tyrosine (A), phenylalanine (B) and tryptophan (C)

由于人体内的酶不产生BCFA、酚类和吲哚，此类化合物在大肠中的生成可以说是完全由肠道微生物发酵所产生的，因此此类化合物的产生可以用来作为评估大肠中蛋白质发酵程度的一个标记[18]。

H2S是一个对人体毒性很强的化合物，其是由硫酸黏蛋白和含硫氨基酸如蛋氨酸、胱氨酸、牛磺酸等化合物通过硫酸盐还原细菌的发酵所产生，其在大肠中的浓度可达1.0～2.4mmol/L。含硫氨基酸的量随着蛋白食物的摄入而上下波动，结果表明粪便中硫化物的含量与摄入了蛋白质含量呈显著性关系（P＜0.001）[19]。

氨基酸的脱羧基作用也可产生胺类，胺类和多胺类的产生多来源于内源性的分泌、膳食中未被吸收的多胺类以及脱落的细胞中[11]，存在于肠道黏膜的一元胺二胺氧化镁酶可将肠道微生物所产生的胺类进行脱毒。另外，在酸性或中性pH值的环境中，由于细菌酶的催化作用，胺类通过二级胺和亚硝酸盐的缩合来合成亚硝胺类化合物[20]。

3 蛋白质发酵的潜在毒性

3.1 体外实验模型

蛋白质的发酵对大肠的影响体外模型大多采用肠道细胞，让这些组织/细胞暴露于一些有害的代谢产物的环境中，然后研究细胞代谢状况。

3.1.1 氨类

由于细菌降解以及内源性氮的循环，结肠上层细胞长期置于含NH3的环境中[14]，Topping等[21]发现NH3的存在可刺激嘧啶的合成及其与大肠上皮细胞RNA的交互作用，分离小鼠末端大肠在NH3（75mmol/L）中培养可刺激上皮细胞增殖[22]。

核苷标记也用来研究氨对来自结肠组织的影响，所用材料为10mmol/L的丁酸铵和等物质量的丁酸钠，结果标记因子无变化，这可能是由于氮的毒性效果被丁酸的正效应所中和的缘故。

3.1.2 甲酚和苯酚

从人体组织中分离的大肠上皮细胞浸于1.25mmol/L的苯酚发现其生存能力降低，从生理学相关浓度来看，降低HT-29细胞的生存能力要求的苯酚的浓度为20mmol/L[23]。Caco-2细胞的在氨（10～100mmol/L）、苯酚（1～10mmol/L）和一级、二级胆汁酸（50～250μmol/L）进行培养的上皮细胞的抗性降低。苯酚在SK-CO15细胞中对细胞透性有影响，这种影响强度与剂量有关并随着浸泡时间的延长而加强。Cerini等[24]证实上皮细胞浸泡在甲酚（10～50μg/mL）中其通透性也会发生显著性的降低。黏膜层的变薄或通透性的增加可显著增加一系列化合物对肠道黏膜的通透性，这些化合物也包括毒性的化合物。

3.1.3 H2S

H2S对肠道细胞的潜在危害性研究比较广泛。Attene-Ramos等[25]在一系列体外实验研究结果表明H2S对细胞的影响途径与在结肠相似，硫化物在浓度为250μmol/L时能使结肠癌细胞（HT-29细胞）基因组DNA结构受到损伤。硫化物处理后，一系列的氧化性增强了，与丁基羟基茴香醚一种游离基清除剂共同培养可降低由H2S诱发的DNA损伤的程度，表明了这种损伤是由于自由基调控的。在人体上皮细胞中，有关细胞周期进程、炎症和DNA修复这些基因的表达由硫化物调控。在大多数大肠癌患者中，COX-2基因的表达显著性上调[26]。

除了诱发DNA损伤外，硫化物还会阻碍大肠内丁酸的氧化作用，把小鼠的大肠暴露于硫化物（0～2.5mmol/L）中会使丁酸氧化受阻。丁酸氧化受阻最终导致能量的缺乏，从而导致钠的吸收降低、黏蛋白的分泌减少以及结肠的生命期缩短。H2S也能抑制细胞呼吸，至少在一定程度上起到抑制细胞色素c氧化酶的作用，这种酶是合成三磷酸腺苷的关键酶之一，在大肠上皮细胞的匀浆中，加入浓度0.5～5μmol/L的NaHS可有效地抑制细胞色素c氧化酶的活性。

3.2 动物实验

3.2.1 蛋白质发酵产物的影响

以盐溶液处理作对照，往小鼠大肠灌入35mmol/L醋酸铵/氯化物发现其显著地诱发组织黏膜的损伤以及黏液的减少，在小鼠模型中使用化学试剂（甲基吗啉、亚硝基胍）可诱发大肠癌的发生，52周之后，灌入直肠的醋酸铵溶液会导致肠道恶性肿瘤的增加[27]。

有关实验也证实了硫化物在UC的发病机理中起到损伤剂的作用。在动物实验模型中，其可能诱发相类似的病理状态，与使用2种难消化的硫酸盐，即葡聚糖硫酸酯、含有卡拉胶的硫酸盐的结果相类似[11]。在小鼠胃中置于NaHS（10～30mmol/L）环境下，经4d（急性）或90d（慢性）处理，丁酸氧化都表现出明显的降低。

3.2.2 蛋白质摄入的影响

Corpet等[10]研究了在肠道中蛋白质的发酵产物与大肠癌之间的关系。酪蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白经过热处理降低其消化率然后加入到小鼠的饲料中，将酪蛋白加热1h可增加蛋白质发酵的程度，这种增加效果可通过测定粪便中氨和尿中的酚类来衡量。然而，加热2～4h导致蛋白质发酵减速。相反，大豆蛋白和鸡蛋白的热处理可增加大肠蛋白质发酵情况。

使用不同来源和数量的蛋白质观察对大肠癌发生的影响，经一系列小鼠动物实验进一步证实了蛋白质发酵对大肠癌发生风险的关系，相对于正常摄入蛋白质量（15%酪蛋白）的标准，当摄入高蛋白质量（酪蛋白25%、大豆蛋白25%、白肉25%、红肉35%）会显著增强大肠基因的损伤，而这种情况在25%的乳清蛋白中并无体现出来，与白肉相比，红肉诱发更多的基因损伤，这种区别可能是因为红肉中含有更多的亚铁血红素的缘故，亚铁血红素能刺激人体肠道基因毒性物质内源性亚硝基化合物的合成[28]。

与15%酪蛋白食谱相比，在配料中摄入高酪蛋白（25%）能显著提高粪便中甲酚的含量，另外，甲酚的含量与基因损伤有显著性关系。同时，在摄入高红肉和白肉的配料后，盲肠和粪便中的甲酚的含量也显著增加。尽管没有明确的数据范围来显示基因损伤的程度，但这些研究数据表明蛋白质的发酵与基因的损伤有密切的关系。

在小鼠配料中，如果用土豆蛋白代替酪蛋白，将会明显的增加尿液中甲酚的含量，这是因为土豆蛋白的消化率低于酪蛋白，同时肠道中的支链脂肪酸也显著提高。这些指标均与增加肠道的肿瘤发生相关联[2]。摄入土豆蛋白主要体现在提升小肠肿瘤细胞的风险，因此，尽管结果显示有害发酵产物是发生在大肠内，它们也可能会系统性地影响到小肠细胞。

另外，高蛋白摄入所增加的DNA损伤与结肠黏膜屏障变薄密切相关，这种情况对于摄入动物蛋白更为显著。在另一小鼠实验研究中，摄入20%大豆蛋白和20%酪蛋白，上皮细胞的损伤和增殖以及粪液细胞毒性均有所提高[29]。然而，Vis等[30]在小鼠实验中发现摄入25%的大豆蛋白比摄入25%的酪蛋白具有一定的保护作用，而不是刺激大肠癌危险因素的上升。

最近的小鼠动物实验表明，喂食高达53%的蛋白质含量的饮食配方与喂食14%的正常蛋白质的饮食配方相比，前者明显降低了大肠刷状缘细胞膜（P = 0.0001）的高度，而这种改变又恰好与肠道中高蛋白酶的活性（P = 0.01）相一致，并且小鼠大肠腔内（P = 0.0008）NH3的含量也显著增加[31]。

3.3 人体实验模型

3.3.1 流行病学研究

流行病学研究发现摄入肉类特别是红肉对增加腺瘤和大肠癌的风险有显著性作用。只有少数几个研究报道蛋白质的消耗和大肠癌风险并无显著的关系。除了蛋白质影响外，其他膳食因素以及生活方式等均会影响最终结果，例如红肉中会含有饱和脂肪酸、血红素铁、杂环胺（肉类烧烤中产生），所有这些因素均会增加大肠癌的风险。由于将这些因素从理论上绝对分开是不现实的，因此也不可能很准确的分析每一成分对增加大肠癌风险的贡献程度。世界癌症研究基金/美国癌症研究中心报道红肉和加工肉制品类的摄入与大肠癌呈正相关，然而对肉食各成分针对性的研究还不充分。

蛋白质发酵与大肠癌炎症疾病的关系还没有进行深入的研究。然而有些实验研究了饮食与疾病的关系，例如其中一项研究针对67000名女性在摄入高蛋白质的条件下，尤其是动物蛋白，可显著增加节段性回肠炎（crohn’s disease，CD）和UC的风险。在最近一篇综述中分析了19个研究结果，其共采用了2609个大肠癌炎症疾病患者和超过4000个对照人群，发现在膳食中高摄入肉食蛋白能够显著增加CD和UC发生的风险[32]。

另外，在一个前瞻性群组研究中，高肉膳食（尤其是红肉和加工肉类）以及饮酒都会增加UC患者病症的复发，这是因为红肉含有高含量的含硫氨基酸，而加工的肉类和酒精饮料含有大量的硫酸盐或亚硫酸盐。高硫饮食在体内会生成H2S以导致大肠黏膜的损伤，与对照组相比，未处理的UC病人粪便中含有更高浓度的H2S（0.55mmol/L对0.25mmol/L，P=0.027）[33]。

3.3.2 交叉研究

交叉研究中经常采用Comet分析来揭示粪液中的基因毒性以此作为生物标记来研究饮食和大肠癌的关系。使用这个技术，发现健康人体摄入高脂、高蛋白和低膳食纤维的食物中几乎可使粪液中基因毒性增加一倍[34]。含乳品丰富的饮食结构与蛋白质少量降低的饮食对比，后者粪液细胞毒性也有了显著的增加，然而基因毒性却相似，这可能是由于摄入钙的显著性减少而使细胞毒性增加的缘故[35]。

采用12个健康男性通过60g/d的红肉饮食（包含65g蛋白质）、420g/d的红肉饮食（含有143～150g蛋白质）、素食饮食（含有143～150g蛋白质）3组实验比较粪液中基因毒性，结果发现并无明显不同。尽管如此，与60g/d红肉饮食组相比，经过142g/d红肉饮食和素食饮食的蛋白质发酵程度更高[36]。

Benassi-Evans等[37]通过一个减肥的饮食配方来研究高蛋白质和红肉（35%的蛋白质）、高碳水化合物（17%的蛋白质）的粪液基因毒性，将发酵代谢产物作为生物标记来描述肠道健康，12周之后在减肥食谱中发现总DNA损伤程度显著降低，这表明控制摄入热量可降低粪液中的基因毒性。尽管排泄物中的苯酚或甲酚的分泌没有改变，但通过减少能量摄入来控制排泄物中基因毒性的影响还需做进一步的研究。

4 影响蛋白质发酵的机制

减少蛋白质发酵对人体产生潜在的有害化合物最简单的方法就是减少饮食中蛋白质的摄入[1,18]。另一措施包括加入益生元、益生菌或合生元。在食谱中加入益生元、益生菌或合生元，糖分解发酵的增强的同时也会伴随着蛋白水解发酵作用的减小（表1）。

将抗性淀粉（resistant starch，RS）加入到小鼠配料中显著地降低了尿液中甲酚的含量以及尿中氮的排泄，同时通过低聚果糖或木聚糖也减少了尿中氮的排泄并且增加了粪便中的氮排泄。食用高RS含量的食物时，粪便中的氨和粪便中的甲酚、苯酚和总酚类含量显著性地降低。在健康人群中，摄入消耗RS3型比摄入RS2型更能显著降低粪便中氨的含量。消耗乳果糖或乳糖醇4周将会导致粪便中甲酚、对甲酚、吲哚和粪臭素的浓度的显著减少，而其他糖醇的摄入并不影响粪便中氨和对甲酚的含量。

在饮食中加入菊粉、低聚果糖-菊粉、阿拉伯糖基木聚糖、低聚糖和乳果糖会减少蛋白质发酵情况。为了研究结肠氨代谢，使用15N标记氨并且追踪尿液和粪便中15N的排泄量。加入的益生元、益生菌或合生元能刺激细菌同化氨的作用，一大部分细菌固定的NH3上的[15N]从粪便排出，一小部分标记出现在尿液中[40]。在健康人群中发现，乳杆菌和双歧杆菌能显著降低尿中甲酚含量并且能有利于氨代谢，另外摄入乳酸杆菌4周后能减少尿中对甲酚的含量[47]。

通过使用代谢组学的方法，对粪便采样，摄入合生元前、后（0.5g低聚糖、109CFU双歧杆菌和109CFU嗜酸乳杆菌）30d，1H-NMR和多元统计分析表明对人体有益的肠道代谢，由蛋白质发酵过程向碳水化合物发酵过程转变。相似的研究也证实了这一点，即摄入1个月的合生元（0.5g低聚果糖、109CFU B. longum和109CFU瑞士乳杆菌）也获得类似的结果。代谢物与合生元呈正相关，主要是短链脂肪酸的含量增加，而1-辛醇、噻吩和壬烷的浓度在摄入之后明显降低。

供给合生元同时加入低聚果糖-菊粉（2×10g/d）和干酪乳杆菌（2×6.5×109/d）之后蛋白水解发酵转变为糖发酵这一情况也被证实。另外通过来苯基丙氨酸降解产物乙烷、三硫化物、乙苯的减少进一步证实了蛋白质发酵程度的降低。加入益生元、益生菌或合生元之后的蛋白质发酵降低，大量的动物实验研究还发现加入益生元、益生菌或合生元能降低肿瘤和癌前期病变的发生率[53]。

加入益生元、益生菌或合生元对粪液毒性还有正影响。摄入酸奶和混有乳酸杆菌145、双歧杆菌913的酸奶后，收集这两种样本的粪液毒性进行比较，发现在含有益生菌的酸奶中基因毒性显著地降低。在息肉切除术病人和大肠癌的病人作空白对照的随机实验中，摄入合生元（鼠李糖乳杆菌GG、双歧杆菌Bb12和低聚果糖-菊粉）12周之后结果显示，在息肉切除术病人中其DNA损伤有轻微的降低，在息肉切除术病人中，这些物质的摄入也显著地降低了结肠癌细胞的扩散并提高对上皮细胞的屏障作用[51]。

5 结 语

肠道内蛋白质发酵代谢产物如NH3和H2S等存在一定的潜毒性，加之尿液中的对甲酚和苯酚的浓度高低也是衡量蛋白质发酵程度的尺度，从目前研究结果来看，这些指标可作为评价大肠健康的部分生物标记物。大量摄入高蛋白与DNA损伤有密切关系，因为肠道蛋白质发酵的程度主要依靠蛋白质的摄入量，也因此可推断蛋白质发酵与增加大肠癌风险有密切关系。加入益生元、益生菌可减少蛋白质发酵程度和粪液的基因毒性，进一步说明了在蛋白质发酵和DNA损伤之间存在关系，但仍需从机理上进一步探索。

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