烟酰胺分子印迹电化学传感器研制

陈升龙，邵义娟，李建平*

(桂林理工大学化学与生物工程学院，广西 桂林 541004)

摘 要：为研制烟酰胺分子印迹电化学传感器，以邻苯二胺作为功能单体，烟酰胺为模板分子，在pH5.7醋酸盐缓冲溶液中采用循环伏安法在玻碳电极表面电聚合形成分子印迹敏感膜，并以此作为识别元件制备电流型烟酰胺分子印迹电化学传感器。结果表明：烟酰胺浓度在1.0×10-8～1.1×10-6mol/L的范围内与峰电流呈良好的线性关系，检出限达4.5×10-9mol/L。该传感器具有灵敏度高、选择性好、制备简单且成本低的优势，并可对饮料中微量的烟酰胺进行定量分析。

关键词：烟酰胺；分子印迹电化学传感器；饮料测定

Fabrication of Molecularly Imprinted Electrochemical Sensor for the Determination of Nicotinamide in Beverage

CHEN Sheng-long，SHAO Yi-juan， LI Jian-ping*

(College of Chemistry and Bioengineering, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China)

Abstract：In this study, a sensitive sensor based on molecularly imprinted polymer (MIP) of o-phenylenediamine as a functional monomer was designed, and its configuration and performance were explored. The progress of the electropolymerization was performed in an acetate buffer solution (pH 5.7) containing 1.0 mmol/L nicotinamide and 3.0 mmol/L o-phenylenediamine on the surface of a glassy carbon electrode. The molecularly imprinted polymer membrane was characterized using cyclic voltammetry (CV). The linear range was 1.0 × 10-8 ～ 1.0 × 10-6 μmol/L and limit of detection was 4.5 × 10-9 mol/L. The sensor was sensitive, selective, easy to use and cheap and could be applied to the determination of trace nicotinamide in beverage.

Key words：nicotinamide；molecularly imprinted electrochemical sensor；beverage assay

中图分类号：O657.1 文献标志码：B 文章编号：1002-6630(2013)22-0332-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322067

烟酰胺作为维生素B族中的一员，是美容皮肤科学领域公认的皮肤抗老化成分，研究表明烟酰胺具有抗氧化作用，很多维生素饮料中都含有烟酰胺，适量摄入对身体健康有益，但长期过量饮用会使人体内分泌系统紊乱，因此对烟酰胺进行检测具有十分重要的意义。目前，烟酰胺的测定方法主要有分光光度法[1]、液相色谱法[2]、超临界流体色谱法[3]、示差脉冲伏安法等[4]。分光光度法和伏安法虽然简单，但灵敏度不高，选择性不好；色谱法处理步骤过于冗长和费时。分子印迹技术具有对印迹分子“特异性识别能力”，目前分子印迹传感器已广泛应用于药物分析[5-9]、食品分析[10-14]和环境监测[15-18]中对电活性物质[19]以及非电活性物质[20]的测定。但烟酰胺分子印迹传感器尚未见报道。本实验以邻苯二胺作为功能单体，烟酰胺为模板分子，在醋酸盐缓冲溶液中采用循环伏安法在玻碳电极表面电聚合形成分子印迹敏感膜，并以此作为识别元件，旨在研制高选择性和高灵敏的烟酰胺分子印迹电化学传感器。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

乐百氏脉动维生素饮料购于超市。

铁氰化钾、亚铁氰化钾、烟酰胺、邻苯二胺、氯化钾、硝酸、硫酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、醋酸、醋酸钠(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；双蒸水。

CHI660D电化学工作站(以印迹膜修饰玻碳电极(d=2mm)作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极) 上海辰华仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 分子印迹膜的制备

将玻碳电极在麂皮上分别用1.0、0.3、0.05μm氧化铝粉打磨和抛光，然后用蒸馏水将打磨抛光好的玻碳电极冲洗干净，用体积分数为50%的硝酸溶液(原硝酸视为100%)和无水乙醇依次浸泡3min。将玻碳电极浸入10mL含有3.0mmol/L邻苯二胺和1.0mmol/L烟酰胺的醋酸盐缓冲溶液中(pH5.7、25℃)，用循环伏安法扫描30圈，扫描速率0.05V/s，扫描范围－0.2～0.8V。电聚合以后，用甲醇溶液搅拌泡洗15min以除去模板分子烟酰胺及其他吸附物，制得有印迹孔穴的烟酰胺分子印迹膜传感器。采用同样的聚合方法制备非分子印迹膜传感器，区别是在电聚合的底液中不加入模板分子烟酰胺。

1.2.2 重吸附实验

将分子印迹传感器浸入到10mL含有1.0×10-8～
110×10-8mol/L的烟酰胺溶液中15min，进行重吸附实验。使得烟酰胺可以特异性识别进入印迹孔穴；然后取出传感器，用双蒸水冲洗其表面。

1.2.3 电化学测量方法

电化学测量均在10mL含有0.05mol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中进行。循环伏安法的扫描范围为
－0.2～0.6V，扫速50mV/s。以上实验均在室温(25℃)条件下进行。

2 结果与分析

2.1 电聚合分子印迹敏感膜

图 1 邻苯二胺分子印迹膜的聚合图

Fig.1 Electropolymerization of o-phenylenediamine molecularly imprinted polymer

分子印迹电聚合邻苯二胺的循环伏安图如图1所示。在0.37V处有一个不可逆的氧化峰，且峰高随着扫描圈数的增大而逐渐减小直到消失，表明邻苯二胺功能单体在电极表面发生了不可逆的氧化反应。当扫描圈数为30时，邻苯二胺氧化峰的电流变得很小，说明分子印迹敏感膜已经在电极表面形成。其原理是利用电极表面电荷转移使功能单体邻苯二胺发生氧化还原反应引发不可逆的聚合反应而沉积在电极上，而邻苯二胺与目标分子烟酰胺在聚合过程中是凭借氢键的相互作用形成具有多重作用位点的分子印迹膜。印迹膜形成后用甲醇溶液一方面破坏该氢键，另一方面利用其对烟酰胺的溶解作用，将模板分子从印迹膜中除去，得到具有三维印迹孔穴能识别模板分子的分子印迹膜。

2.2 分子印迹膜的识别能力

a.裸玻碳电极；b.电聚合后的玻碳电极；c.洗脱模板分子后的分子印迹传感器；d.重吸附烟酰胺的分子印迹传感器。

图 2 分子印迹膜聚合膜的循环伏安图

Fig.2 CV curves of molecular imprinted polymer (MIP)

a.裸玻碳电极；b.电聚合后的玻碳电极；c.洗脱液处理后的玻碳电极。

图 3 非印迹聚合膜的循环伏安图

Fig.3 CV curves of non-molecular imprinted polymer (nMIP)

在选取的电压范围内，烟酰胺没有自己的氧化还原峰，所以铁氰化钾/亚铁氰化钾被选为支持底液和分子印迹膜电极之间的探针，用于验证印迹膜对烟酰胺的特异性吸附作用。由于作为电子传质通道的印迹孔穴位于膜上，分子识别过程发生于这些通道中，阻碍或者堵塞了底液和电极表面之间电子传质的过程，改变了能够进出传质通道的电活性物质的量从而使电流发生相应的变化，所以能够得到支持电解质中分析物烟酰胺浓度与铁氰化钾/亚铁氰化钾氧化电流信号之间的关系。如图2所示，曲线a到曲线b是在裸玻碳电极上电聚合得到分子印迹膜的过程。由于分子印迹膜在电极表面的形成，造成铁氰化钾/亚铁氰化钾离子对探针在电极表面和底液间发生氧化还原反应难度的增大，因此铁氰化钾/亚铁氰化钾的峰高从曲线a的高度迅速降低到曲线b的高度；曲线b到曲线c的是印迹分子洗脱的过程，在此过程中，模板分子烟酰胺与分子印迹膜的非共价连接被打断而被洗脱下来，印迹膜上出现了具有选择特异性的分子印迹孔穴并成为探针离子传质通道，所以峰电流从曲线b增大到洗脱了模板分子的曲线c的电流，且接近曲线a的电流；曲线c到曲线d的是重吸附模板分子的过程，模板分子和分子印迹膜上的印迹孔穴再次发生作用，传质通道再次被堵塞。以上变化可以说明，分子印迹膜对模板分子烟酰胺有着特异性的识别能力。对于非分子印迹膜(图3)，因为膜的聚合过程没有模板分子的加入，所以洗脱时没有模板分子被洗下来，探针分子无法抵达电极表面形成电流响应，因此电流信号基本没有变化。由此可见，该分子印迹膜电极对模板分子烟酰胺具有识别响应。

2.3 实验条件的优化

2.3.1 缓冲溶液的优化

缓冲溶液种类的研究在10mL含有1.0×10-3mol/L烟酰胺和3.0×10-3mol/L邻苯二胺的不同种类缓冲溶液中进行。考察磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(PBS)、柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠作为缓冲底液，对分子印迹传感器敏感膜聚合的影响。研究发现分子印迹膜的电聚合在这3种缓冲溶液中都能顺利进行，但在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中制备的分子印迹传感器的洗脱和重吸附性能都明显优于其他两种。因此，醋酸-醋酸钠被选作聚合底液的缓冲液。

2.3.2 pH值的优化

pH值对邻苯二胺膜的电聚合有一定的影响，由印迹膜对铁氰化钾的电流响应评估了该实验的pH值范围，并在醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH值为3.6～6.0之间进行了优化，结果缓冲溶液pH值为5.7时有最优的电流响应信号。

2.3.3 功能单体与膜板分子浓度比例的优化

选择模板分子的浓度为1.0×10-3mol/L，分别考察功能单体与模板分子不同浓度比例时的性能，功能单体与模板分子浓度比例分别为8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3。结果发现当功能单体的浓度较大时，电聚合出来的膜不够稳定，洗脱时膜容易损坏。而当功能单体的浓度较低时，即功能单体与模板分子浓度比例低于3:1的时候，得到印迹位点的数量少，重吸附时不容易重吸附上。功能单体与模板分子浓度比例为3:1的时候，得到的印迹膜均匀、稳定且具有较好的选择性。所以选定功能单体与模板分子浓度比例3:1。

2.3.4 聚膜厚度的优化

实验通过改变扫描圈数控制印迹膜的厚度，考察聚合圈数在20～40圈时，印迹膜的洗脱和重吸附性能。结果发现聚合圈数在25圈以下时，印迹膜较容易部分或全部脱落下来，可能原因是膜厚度较小而不稳定；聚合圈数在35圈以上时，印迹膜不易洗脱，可能原因是膜厚度较大阻碍了探针离子的传质过程。所以30圈被选为电聚合的最佳圈数。

2.3.5 洗脱液种类的选择和洗脱时间的优化

由于模板分子烟酰胺与邻苯二胺印迹膜之间以非共价键自发形成具有多重作用位点的分子印迹膜，洗脱液选用具有能够打断氢键的物质甲醇溶液、乙醇溶液、甲醇-乙酸混合液、乙酸溶液，由印迹膜对铁氰化钾的电化学响应评估了洗脱液的种类。研究发现，选用乙醇溶液作洗脱液时，洗脱时间久且洗脱不彻底，分别选用甲醇-乙酸混合液和乙酸溶液时，洗脱时间短而不好控制。所以，甲醇溶液被选为最佳洗脱液。

洗脱时间的优化实验在甲醇溶液中进行。实验过程中，每隔1min将传感器置于铁氰化钾溶液中进行1次循环伏安扫描，发现循环伏安扫描图中的峰电流不断升高，当达到5min时峰电流趋于稳定，所以本实验选择5min作为洗脱时间。

2.3.6 重吸附时间的优化

重吸附时间的优化实验在10mL 5×10-4mol/L烟酰胺溶液中进行。在实验过程中，循环伏安扫描每隔3min进行1次，铁氰化钾的氧化还原峰电流不断增大到15min以后才趋于稳定，所以15min被选为重吸附实验的最优时间。

2.4 工作曲线的绘制

a～j分别为0、3×10-8、6×10-8、9×10-8、20×10-8、30×10-8、50×10-8、70×10-8、90×10-8、110×10-8mol/L烟酰胺溶液。

图 4 在不同浓度烟酰胺溶液中重吸附后的循环伏安图和工作曲线图

Fig.4 CV and calibration curves of MIP-sensor after rebinding with nicotinamide at different concentrations

将洗脱后的印迹膜电极浸在不同浓度的烟酰胺溶液中重吸附，测量重吸附后的电流值，计算烟酰胺的含量。图4是循环伏安响应图以及烟酰胺浓度(c)与氧化峰电流(ΔI)的工作曲线图。可知随着烟酰胺浓度逐渐增大，印迹膜上越来越多的孔穴被烟酰胺填充。在1.0×10-8～
1.1×10-6mol/L浓度线性区间范围内分子印迹传感器的工作曲线方程为：ΔI=53.65－0.494c，R2=0.9962。检出限按下式计算：

DL=3δb/K

式中：DL为95%置信度时的检出限/(mol/L)；δb为空白样品检测的标准偏差/(mol/L)；K为工作曲线的斜率。

通过公式可以求出检出限DL＝4.5×10-9mol/L。

2.5 传感器的选择性

考察饮料样品中可能存在的干扰物质对烟酰胺测定的影响。在6×10-6mol/L烟酰胺溶液中分别加入0.3mol/L的VC；3×10-4mol/L的VB6；1×10-5mol/L的Ca2+、Mg2+和Zn2+；结果表明，烟酰胺分子印迹膜在上述溶液中重吸附后进行循环伏安法测试，响应电流与不含干扰物质时基本相同。说明此传感器具有很高的选择性，在实际应用中能有效抵抗干扰。

选择与烟酰胺结构相似浓度均为5×10-7mol/L的苯乙酮、烟酸、甲基丙烯酸进行结合实验，以判定分子印迹膜对烟酰胺的选择性。结果显示，分子印迹膜对浓度同样为5×10-7mol/L的烟酰胺的吸附量远高于对苯乙酮、烟酸、甲基丙烯酸的吸附量。相同浓度条件下烟酸、苯乙酮、甲基丙烯酸产生的ΔI与烟酰胺的ΔI的比值分别为4.6%、2.9%、3.8%。说明分子印迹膜的印迹效应发挥了重要的作用，使得印迹膜对烟酰胺表现出高选择性。

2.6 传感器的稳定性和重复性

长期稳定性即较长的使用寿命是衡量分子印迹传感器优劣的一项重要指标，这取决于分子印迹膜的稳定性。在非工作期间，传感器被储存于4℃的冰箱中，以确保其稳定性。实验结果表明，通过对5×10-7mol/L烟酰胺进行重吸附后检测得到的电化学信号变化的研究，一个月内电化学信号基本保持不变，50d后电化学信号降低了13%。

将同批次制备的5支传感器置于10mL含5×10-7mol/L
烟酰胺溶液重吸附15min后，放入铁氰化钾溶液中用循环伏安法测其峰电流。5支传感器所测得的峰电流值的相对标准偏差为1.6%。说明该分子印迹传感器的重复性良好。

2.7 样品分析与检测

表 1 饮料样品中烟酰胺含量分析表

Table 1 Precision and recovery of the method

脉动饮料标签中标识的烟酰胺有效成分为1mg/100mL。取样品10μL用双蒸水稀释到10mL即可得到用于检测的样品；同时做空白实验。分子印迹传感器在样品溶液中重吸附15min后利用循环伏安法检测。计算待测物含量并扣除空白值。如表1所示，该分子印迹膜传感器的回收率在96%～101.5%之间，相对标准偏差低于3.5%，可以证明该烟酰胺分子印迹膜传感器有良好的回收率以及实用性。

3 结 论

本实验利用循环伏安法电聚合邻苯二胺，在玻碳电极表面制备出了对烟酰胺具有特异性选择的分子印迹膜，该膜具有良好的稳定性。应用此印迹膜制成的烟酰胺分子印迹传感器具有高灵敏度、高选择性、响应快速等优点，在检测烟酰胺的应用上具有良好的前景。

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