响应面法优化紫薇花色素提取工艺

晏 丽1,2，王立志1，麻明友3,*

(1.吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000；2.吉首大学城乡资源与规划学院，
湖南 张家界 427000；3.吉首大学实验设备与管理中心，湖南 吉首 416000)

摘 要：研究紫薇花色素的提取工艺。在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理采用三因素三水平响应面分析法，优化紫薇花色素超声强化提取工艺。结果表明：紫薇花色素溶液的吸收光谱在λ＝546nm处有明显吸收峰，可作为测定紫薇花色素溶液吸光度的特定波长。以体积分数50%乙醇溶液提取花色素的效果较好，超声波辅助提取色素的最佳提取条件为超声功率400W、超声时间22min、液料比45:1(mL/g)，在此条件下紫薇花色素吸光度的理论预测值为0.608，实际验证值为0.610，两者误差较小，表明该工艺条件合理可行。

关键词：紫薇花；色素；响应面；提取

Optimization of Pigment Extraction from Lagerstroemia indica Flowers by Response Surface Methodology

YAN Li 1,2，WANG Li-zhi1，MA Ming-you3,*

(1. Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China；

2. College of Resource and Planning Sciences, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China；

3. Experimental Equipments Administration Center, Jishou University, Jishou 416000, China)

Abstract：A three-variable, three-level Box-Behnken experimental design combined with response surface analysis was employed to optimize the conditions for pigment extraction from Lagerstroemia indica flowers. The extracted pigment was determined by measuring the absorbance at the maximum absorption wavelength of 546 nm. The best solvent for the extraction of pigment was found to be 50% ethanol. The optimal conditions for ultrasonic-assisted extraction were determined as 400 W ultrasonic power, 22 min irradiation time and a liquid-material ratio of 45:1 (mL/g). The predicted absorbance of pigment extracts under the optimized conditions was 0.608 and the actual value was 0.610, showing a small error between both. Thus, the optimized extraction conditions are reliable.

Key words：Lagerstroemia indica flowers；pigment；response surface methodology；extraction

中图分类号：TS202.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0059-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322012

色素分为天然色素和人工合成色素，广泛用于食品、医药、化妆品等轻工业领域。天然色素易变质、溶解度小但价格昂贵，因此生产商逐渐用无嗅无味、易溶、易调色、价格低廉的合成色素替代了天然色素，合成色素稳定性高，着色力强且成本低廉，但随着研究的深入，发现曾允许使用的人工合成食用色素中，很多都对人体有着或多或少的损害，特别是近年发现结构中含偶氮型的色素，有可能代谢为致癌物质，引起人们的高度警惕。在这种情况下，人们又将眼光从合成色素转向了天然色素[1-4]。

紫薇(Lagerstroemia indica)为千屈菜科(Lythraceae)紫薇属(Lagerstroemia)落叶灌木或小乔木，又名满堂红、百日红等，主要分布在吉林、广东、湖南等省，是著名的夏季观赏树种，在现代城市园林绿化中有着广阔的应用前景，其叶、根和树皮药用[5-9]。紫薇花色素是一种纯天然色素，该色素对人体无毒害作用，溶于水，呈紫色，色泽绚丽，是一种很好的食品着色剂；理化性质非常稳定，是一种可用做食品添加剂的天然色素；且紫薇花资源丰富，是一种极其具有开发利用价值的色素。目前国内外对紫薇花色素的提取及花青素成分做了大量的研究，陈洪等[10]对大叶紫薇花色素的提取及稳定性进行了研究；余凡等[11]采用微波法对紫薇花色素的提取工艺进行了研究；Saleh[12]最早对紫薇花青素组成进行研究，鉴定紫薇花瓣中含有飞燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、矮牵牛素-3-O-阿拉伯糖苷和锦葵素-3-O-阿拉伯糖苷；Egolf等[13]指明紫薇花瓣中所含色素分别是飞燕草素、矮牵牛素和锦葵素的3-O-葡糖苷，并且指出紫薇花瓣中只含有这种花青素糖苷；张洁[14]首次在紫薇花中发现矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。本实验选择用超声波辅助法提取紫薇花色素，并采用响应面法优化提取工艺，以期为紫薇花色素的利用提供科学依据。.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫薇花：2012年8月采摘于吉首大学张家界校区校园，样本经吉首大学廖博儒研究员鉴定为千屈菜科
(Lythraceae)紫薇属(Lagerstroemia)。

无水乙醇、浓盐酸均为国产分析纯；实验用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

JY92-ⅡDN超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；UV757 CRT紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；R215旋转蒸发仪 瑞士步琪有限公司；HH数显电热恒温水浴锅 江苏金坛金城国胜实验仪器厂；AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；LD5-2A型离心机 北京医用离心机厂。

1.3 方法

1.3.1 紫薇花红色素提取溶剂选择

准确称取1.000g花瓣样本9份，分别放入三角瓶中，依次加入蒸馏水(pH1.0)、体积分数为20%乙醇(pH1.0)、50%乙醇(pH1.0)、90%乙醇(pH1.0)、甲醇(pH1.0)、石油醚等溶剂各50mL，每种溶剂重复3次，室温(23℃左右)条件下振荡提取12h，并在400～700nm波长范围内分别测定不同提取剂在最大吸收波长处的吸光度。以吸光度为评价指标，吸光度越大，色素的提取效果就越好，考察不同的溶剂对紫薇花色素提取效果的影响[15]。

1.3.2 紫薇花色素的提取和测定[16]

工艺流程：紫薇花→解冻→称样→加溶剂超声辅助提取→定容→过滤→离心→测定吸光度。

操作要点：将采摘的紫薇花洗净后晾干置于－20℃条件下保存，备用。准确称取1.000g解冻的紫薇花瓣置于三角瓶中，在不同条件下进行超声波辅助提取，提取液过滤后定容到相同的体积，以相应体积分数乙醇溶液做对照，在最大吸收波长处测定吸光度。平行实验3次，取平均值。

1.3.3 单因素试验

考察超声功率、超声时间及液料比作为影响紫薇花色素提取效果的因素，以色素提取液吸光度作为评价指标。

1.3.3.1 超声功率对色素提取效果的影响

选择体积分数50%乙醇(pH1.0)为提取溶剂，在超声时间5min、液料比50:1(mL/g)的条件下，考察超声功率分别为100、200、300、400、500W时对紫薇花色素提取效果的影响。

1.3.3.2 超声时间对色素提取效果的影响

选择体积分数50%乙醇(pH1.0)为提取溶剂，在超声功率200W、液料比50:1(mL/g)的条件下，考察超声时间分别为5、10、15、20、25min时对紫薇花色素提取效果的影响。

1.3.3.3 液料比对色素提取效果的影响

选择体积分数50%乙醇(pH1.0)为提取溶剂，在超声功率200W、超声时间5min的条件下，考察液料比分别为20:1、30:1、40:1、50:1、60:1(mL/g)时对紫薇花色素提取效果的影响。

1.3.4 响应曲面优化试验

在单因素试验的基础上，运用Box-Behnken试验设计原理[17]，选取超声功率、超声时间及液料比为响应变量，紫薇花色素提取液的吸光度(Y)为响应值，采用三因素三水平的响应面分析方法，预测紫薇花色素提取的最优工艺[18-20]。响应面分析因素与水平表1。

表 1 响应面分析因素与水平

Table 1 Code values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的筛选

表 2 紫薇花色素在不同溶剂中的溶解性

Table 2 Solubility of the pigment extracted from Lagerstroemia indica flowers in different solvents

注：＋.可溶；－.不溶。

由表2可见，紫薇花色素易溶于水、乙醇、甲醇等极性较强的溶剂，不溶于氯仿、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯等极性较弱的溶剂；用不同体积分数的乙醇浸提的实验发现，50%乙醇溶液(pH1.0)的吸光度最大，所以在后续实验中选取体积分数50%乙醇溶液(pH1.0)为提取溶剂。从上面结果还可说明该色素属于水溶性、醇溶性色素。

将体积分数90%乙醇的紫薇花色素提取液(pH1.0)在400～700nm波长范围扫描，结果如图1所示。可见，紫薇花色素溶液的吸收光谱在λ＝546nm处有明显吸收峰，这也符合花色苷类色素的吸光特性。因此，可选取λmax＝546nm作为测定紫薇花色素溶液吸光度的特定波长。

图 1 紫薇花色素提取液的吸收光谱

Fig.1 Absorption spectrum of the pigment extracted from Lagerstroemia indica flowers

2.2 单因素试验

2.2.1 超声功率对提取效果的影响

图 2 超声功率对吸光度的影响

Fig.2 Effect of ultrasonic power on the absorbance at 546 nm of the pigment

由图2可知，随着超声功率的增大，浸提液的吸光度呈现上升的趋势；当超声功率为400W时，吸光度达到最大；如继续提高超声功率，浸提液的吸光度下降。其原因是由于超声波具有强烈的热效应，随着超声功率的增加，其热效应也增强，而色素作为热敏性物质，很容易造成色素分子结构的破坏，使得浸提液的吸光度降低。因此，本研究把超声功率300～500W作为响应面法的考察范围。

2.2.2 超声时间对提取效果的影响

由图3可知，在试验设计水平范围内，随着超声时间的延长，吸光度逐渐增大，在超声时间20min 时达到最大；而后随着超声时间的延长，吸光度有明显的下降趋势。这是由于紫薇花色素存在于细胞内，使细胞内部的色素逐渐溶出并达到一个动态平衡需要一定的时间，与此同时，随着超声时间的延长，提取液的温度也随之升高，从而造成色素的稳定性下降，导致吸光度下降，故不宜长时间超声浸提。因此，本研究选取超声提取时间 15～25min作为响应面法的考察范围。

图 3 超声时间对吸光度的影响

Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the absorbance at 546 nm of the pigment

2.2.3 液料比对提取效果的影响

图 4 液料比对吸光度的影响

Fig.4 Effect of liquid-material ratio on the absorbance at 546 nm of the pigment

由图4可知，随着提取液用量的增大，吸光度逐渐增大，在40:1(mL/g)时达到最大；当提取液用量继续增大时，其吸光度反而下降。超声波具有强烈的机械效应和空化效应，当提取液用量增加时，变辐杆末端产生的机械作用和空化作用被分散，从而造成了提取效果的下降。因此，本研究把液料比30:1～50:1(mL/g)作为响应面法的考察范围。

2.3 响应面优化试验

2.3.1 试验结果及模型建立与检验

根据表1，进行超声功率、超声功率、液料比共3个因素与提取液吸光度之间的三因素三水平响应面法优化实验，其试验方案和结果见表3。利用Design Expert 7.0软件对表3数据进行二次多元回归拟合，得到超声波法提取紫薇花色素提取液的吸光度预测值Y对编码自变量X1、X2和X3的二次多项回归方程：Y = 0.6－6.25×10-4X1＋
0.012X2＋0.02X3＋0.027X1X2－6.25×10-3X1X3＋2.5×
10-3X2X3－0.028X12－0.028X22－0.03X32。

方差分析及显著性检验结果见表4，可知：该回归方程模型极显著(P=0.0006＜0.01)，回归模型的决定系数为R2= 0.9422，说明该模型能够解释94.22%的变化，失拟项P = 0.0517＞0.05，失拟性检验结果不显著。这一结果说明该模型与数据拟合程度较高，试验误差小，可用该模型分析和预测紫薇花色素超声强化提取的结果。对模型回归方程系数的显著性试验表明，一次项X2、X3，交互X1X2、二次项X12、X22、X32影响显著。

表 3 响应面试验方案及结果

Table 3 Box-Behnken experimental design and results

表 4 回归方程方差分析

Table 4 Analysis of variance for the developed regression model

注：*.差异显著(P＜0.05)；**.差异极显著(P＜0.01)。

2.3.2 响应面分析

响应曲面分析法优化图形为响应值(Y)与对应的因素间构成的三维图及在二维平面上的等高线图，综合直观地反映各因素对色素提取液吸光度的影响，每个响应面对其中两个因素进行分析，另外一个因素固定在零水平上，回归优化响应面图分别见图5。

图5直观地反映了各因素对响应值的影响，在试验设定的水平范围内，随着每个因素取值的增大，其响应面值相应也增大；但当响应值达到最大值后，其不再随因素取值的增大而增大。由图5可知，超声时间和超声功率之间的交互作用强，其根据等高线的形状可以反应出交互作用的强弱，椭圆形则交互作用强烈，圆形则反之；另外曲面的陡峭程度反映该因素的显著情况，超声时间和液料比对紫薇花色素提取效果影响显著，3个因素影响大小为液料比＞超声时间＞超声功率。

a.超声时间与液料比

b.超声时间与超声功率

c．超声功率与液料比

图 5 各两因素交互作用对吸光度影响的响应面图和等高线图

Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of extraction parameters on the absorbance of the pigment extracted from Lagerstroemia indica flowers

2.3.3 最佳工艺条件的验证

由Design Expert 7.0软件得到超声波辅助提取紫薇花色素的最佳提取条件为超声功率407.62W、超声时间21.31min、液料比43.3:1(mL/g)，在此条件下，紫薇花色素提取液的吸光度为0.608。为了便于实际操作的情况，将最佳工艺条件修正为超声功率400W、超声时间22min、液料比45:1(mL/g)，在此条件下，进行3次平行实验，得到紫薇花色素提取液的平均吸光度为0.610，与理论预测值的误差仅为0.3%，说明采用响应面法得到的优化结果可靠。

3 结 论

3.1 通过紫薇花色素在不同溶剂中的溶解性可知，该色素易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂，为水、醇溶性天然色素，体积分数50%乙醇溶液(pH1.0)为最佳提取溶剂；紫薇花色素提取液在可见光区的最大吸收波长是546nm。

3.2 在单因素试验的基础上，采用响应面法优化超声波辅助提取紫薇花色素的提取工艺参数，建立的二次多项数学模型具有显著性，模型与数据拟合程度较高。选择体积分数50%乙醇溶液为提取溶剂，超声波辅助提取紫薇花色素的最佳工艺条件为为超声功率400W、超声时间22min、液料比45:1(mL/g)，在此条件下测得紫薇花色素在546nm波长处吸光度为0.610，与理论预测值的误差为0.3%，验证结果与预测值偏差较小，说明采用响应面法得到的工艺参数是可行的。

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