液相色谱-质谱联用检测农产品中磺草灵残留

张启凤1，松本和雄2，张茂强1，姜健美1，赵华锋1

(1.青岛诚誉食品检测有限公司，山东 青岛 266108；2.株式会社亚细亚食品安全研究中心，东京 1040045)

摘 要：建立农产品中前处理操作简单，易于进行液相色谱-质谱联用测定的磺草灵残留检测方法。用甲醇提取目标物，分取一定量的溶液进行浓缩，再用含1%乙二胺四乙酸二钠盐(EDTANa2)的0.1%甲酸溶液溶解。将溶解后的样品加载到预先平衡好的亲水亲脂平衡反相固相萃取柱(HLB)上，磺草灵则被保留在HLB上的吸附剂中。经淋洗后用50%甲醇溶液洗脱。将接收溶液用0.45μm的滤膜过滤至进样瓶中，用LC-MS-MS进行测定。6种农产品基体的平均回收率为70.6%～107.8%，相对标准偏差为1.0%～14.0%，日间精密度为4.4%～17.7%，基质回收率为81.4%～115.0%，基质效应影响不大。经实验验证，方法定量限为0.01mg/kg，精密度、灵敏度满足检测要求，操作简便、快捷，可用于农产品中磺草灵的残留检测。

关键词：磺草灵；残留检测；固相萃取柱；液相色谱-质谱联用；农产品

Determination of Asulam in Agricultural Products by LC-MS-MS

ZHANG Qi-feng1，KAZUO Matsumoto2，ZHANG Mao-qiang1，JIANG Jian-mei1，ZHAO Hua-feng1

(1. Qingdao Chengyu Food Testing Laboratory Co. Ltd., Qingdao 266108, China；

2. Asia Food Safety Research Center Inc., Tokyo 1040045, Japan)

Abstract：A simplified pretreatment coupled with reliable liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS) method has been developed for the determination of asulam in agricultural products. Samples were extracted with methanol, and then divided into equal portions. After evaporation, residues were dissolved in 0.1% formic acid solution containing 1% disodium ethylenediamine tetraacetic acid (EDTANa2). The sample was applied to a pre-conditioned hydrophilic lipophilic balanced reversed solid-phase extraction column (HLB). Under these conditions, asulam was retained in the adsorbent of HLB. After flushing of the column, asulam was eluted with 50% methanol solution. It was filtered through a 0.45 μm filter to a vial before analysis by LC-MS-MS. The average recoveries from 6 agricultural samples varied from 70.6% to 107.8%, the repeatability varied from 1.0% to 14.0%, the inter-day precision varied from 4.4% to 17.7% and the matrix recoveries varied from 81.4% to 115.0%, showing little matrix effect. The validation experiments showed that the method was simple, fast, accurate and sensitive and could meet the requirements for the determination and confirmation of asulam in agricultural products with a limit of quantification of 0.01 mg/kg.

Key words：asulam；determination；solid-phase extraction column；liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS)；agricultural products

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0277-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322056

磺草灵是氨基甲酸酯类的内吸传导型除草剂，对去除一年生[1]、多年生杂草及许多阔叶杂草都有非常好的效果，因具有高效、低毒、内吸、广谱等特点而被广泛用于多种农产品[2-3]。但除草剂的过度使用会对食品、土壤等造成污染，进而影响人类健康[4-5]。欧盟、美国、日本、澳大利亚等国家和地区都对磺草灵做了毒性评估和限量值的规定[6-7]。而且欧委会已向欧盟成员国正式发出指令，在2011年12月31日前撤销除草剂磺草灵登记[8]。我国对茶叶、香菇等农产品的限量值也有明确规定[9-10]。磺草灵的检测方法也因此而受到广泛关注。磺草灵的检测方法有薄层色谱法、毛细管电泳法、电化学法、液相(紫外)法和液相(荧光)法等[11-13]。这些方法存在灵敏度不足或因前处理需要衍生化而造成操作繁杂等问题。日本文献中对水中磺草灵的测定方法报道[14-17]较多，不适用于农产品的残留检测。日本通知法《食品中残留农药、饲料添加物或兽药成分物质的试验法》中规定了以农产品为对象的磺草灵实验法[18]。该法需要进行凝固处理、甲基化等，并且因目标物的极性问题，在乙酸乙酯与水进行液-液分配时难以得到理想的回收效果。另外，使用LC-MS-MS进行磺草灵检测的文献[19]也有报道，但因前处理方法未考虑磺草灵结构性质的特殊性，因而出现了在一些样品中回收率差的现象。本实验拟在前处理无需衍生化的前提下，使用LC-MS-MS进行目标物的测定，以期找到一个易于操作又适合于磺草灵性质的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用样品有洋葱、菠菜、马铃薯、花生、小麦粉、乌龙茶6种农产品和自来水，农产品为市场购买，自来水直接取自于自来水管。

磺草灵(标准品级，纯度97.4%) 德国Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈(均为色谱纯) 美国Tedia公司；EDTANa2(分析纯) 青岛化学试剂厂；Oasis HLB固相萃取柱(60mg，3mL) 美国Waters公司。

1.2 仪器与设备

API3200液相色谱-质谱联用仪(配有电喷雾离子源(electrospray ion source，ESI)) 美国AB Sciex公司；V-DX振荡器 日本Iwaki Sangyo公司；旋转蒸发仪 日本GL Sciences公司；AUW220D电子天平 日本岛津公司；Legend RT离心机 德国Kendro公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

精确称取10mg(精确至0.01mg)磺草灵标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，得到质量浓度1000mg/L的储备液。该溶液可在－18℃保存6个月以上。

用移液枪准确移取1000mg/L储备液10μL，加入990μL甲醇，配制成质量浓度10mg/L的工作液，待用。

1.3.2 样品溶液的制备

准确称量(精确至0.1g)经粉碎后的样品至100mL离心管，一般样品称取10g，谷物、豆类称取5g，茶叶及啤酒花等称取2.5g。向称取的样品中加入甲醇50mL，在振荡器上振荡30min。离心，将上清液转移至100mL容量瓶。向残渣中加入25mL甲醇，振荡30min，离心，将上清液转入之前的容量瓶，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成提取液。

用移液管准确移取提取液至50mL浓缩瓶中，一般样品移取2mL，谷物、豆类移取4mL，茶叶及啤酒花等移取8mL。减压浓缩至大约1mL，向浓缩瓶中加入含质量浓度1g/100mL EDTANa2的0.1%甲酸溶液9mL，摇匀。

将HLB分别用3mL甲醇和0.1%甲酸溶液平衡，将上步浓缩瓶中的样液加载到该柱上。加载完毕，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，V/V)3mL淋洗，抽干，用50%甲醇水溶液洗脱，接收，过0.45μm滤膜，待测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18填充柱(2.1mm×150mm，5µm)；流动相：水相(A)为0.01%甲酸溶液，有机相(B)为甲醇；流速0.2mL/min，进样量5µL，液相洗脱梯度：起始体积分数10% B，保持1min，7min内等速变到100% B，保持2min，此后瞬间变到10% B，保持5min。

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子源；离子源温度300℃；加热气气压60psi；碰撞气气压5psi；其他条件见表1，其中m/z 231＞156为定量离子，其他为定性离子。

表 1 磺草灵LC-MS-MS分析质谱测定参数

Table 1 LC-MS-MS parameters for the analysis of asulam

1.3.5 HLB柱净化条件的优化

选取4种加载净化溶液进行实验，甲醇-0.1%甲酸溶液分别为1:9、1:4、3:7和1:1(V/V)，每种溶液用量10mL，加载标准品质量浓度10μg/L，加载后直接接收测定。

将5mL洗脱溶剂(50%甲醇溶液)的用量分5次洗脱加载后的HLB，每次1mL，接收测定。

1.3.6 EDTANa2添加与否的确认

分别以自来水、洋葱、菠菜、马铃薯为对象进行添加回收对比实验。每种样品称取2份，1份在上HLB柱前加入EDTANa2，另1份不加EDTANa2，其他前处理步骤均按照1.3.2节实施。

1.3.7 添加回收实验与基质效应的确认

实验样品选用洋葱、花生、菠菜、马铃薯、小麦粉和乌龙茶6种基体。添加量选用日本肯定列表中最大残留限量的最小值0.02mg/kg以及该量的10倍0.2mg/kg。每次实验每个样品做3个平行，共做了3次(不同的日期)实验。实验步骤按1.3.2节方法。其中添加量为0.2mg/kg的样品经10倍稀释后测定。

用以上实验的样品空白配制了0.02mg/L的含有基质的标准溶液进行测定。

2 结果与分析

2.1 测定条件优化

磺草灵是两性化合物，既含有碱性基团，又含有酸性基团，结构式见图1。因此它在LC-MS-MS上使用正模式和负模式测定都有响应。

图 1 磺草灵化学结构式

Fig.1 Structure of asulam

为将正、负模式的质谱条件优化到最佳状态，分别用其对质量浓度0.1mg/L磺草灵标准品进行分析，谱图比较见图2。正模式的响应值是负模式的3～5倍，而保留时间、峰形等基本一致，因此质谱方面采用正模式分析。但负模式分析仍不失为一个很好的定性手段的补足。

a. 231.0＞156.0；b. 231.0＞108.0。

A.正模式

a. 229.0＞196.8；b. 229.0＞132.8。

B.负模式

图 2 0.1mg/L磺草灵正负模式响应

Fig.2 Response of 0.1 mg/L asulam in the positive and negative ion modes

为了改善目标物的峰形，流动相中的水相加入了甲酸。当甲酸体积分数由0.01%提升至0.1%时，目标物在分析柱C18上的保留时间没有明显变化，但响应却大大降低。因此水相选用体积分数0.01%甲酸溶液。有机相考察甲醇和乙腈，两者在保留时间和响应方面均无明显差异，从成本考虑选用甲醇。

2.2 标准曲线、仪器定量限

用50%甲醇溶液配制1、2、5、10、25、50、100μg/L的系列标准品，用上述条件在LC-MS-MS上进行测定。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。线性方程为y=1.47×103x－585，线性相关系数r为0.9997，结果表明在1～100μg/L范围内呈良好的线性关系。采用信噪比RSN=10计算仪器定量限为1μg/L。

2.3 HLB柱净化条件的确定

选用HLB柱净化磺草灵时，净化原理是：选用合适的加载溶剂让目标物呈现分子状态并有效保留于HLB柱体上，用淋洗液淋洗去除无机盐、糖及其他极性杂质，最后用洗脱溶剂洗脱目标物。

根据结构特征，磺草灵有两个解离常数(pKa)，分别是1.29和4.68。当pH值为3左右，它主要呈现为分子状态。因此加载溶液中甲酸的体积分数为0.1%(pH值约为3)时可将目标物有效调整为分子状态。

净化溶液中甲醇的比例与回收率的关系见表2。在用甲醇-0.1%甲酸溶液(1:4，V/V)加载时部分目标物已随杂质一同流出，而两者体积比为1:9时，目标物没有流出，因此将加载条件定为甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，V/V)，加载完毕后用其进行淋洗净化，以便目标物能够有效保留于HLB上。

表 2 HLB上不同净化溶液的磺草灵回收率

Table 2 Recovery of asulam with different clean-up solvents on HLB

由表2可知，甲醇-0.1%甲酸溶液(1:1，V/V)可将目标物基本全部洗脱下来，说明甲醇-水(1:1，V/V)具有足够的洗脱强度。如果洗脱溶剂同加载溶剂一样也含有0.1%甲酸，那么洗脱目标物的同时会洗脱部分碱性化合物杂质，因此将洗脱溶剂定为50%甲醇溶液。

表 3 HLB洗脱溶剂用量的优化

Table 3 Optimization of elution solvent volume on HLB

洗脱溶剂(50%甲醇溶液)的用量与回收率的关系见表3。由实验结果可知，前面2mL洗脱溶剂基本将目标物完全洗脱下来。如增大洗脱溶剂的用量，同时会洗脱更多的杂质，因此洗脱溶剂的用量定为2mL。

2.4 EDTANa2的作用

根据文献[20]报道，因为金属离子的影响，在对自来水进行磺草灵检测时，回收率偏低。EDTANa2分子中含有络合能力很强的配位原子，可以与金属离子进行配位形成络合物，进而降低金属离子对实验的干扰。EDTANa2对4种样品中磺草灵的测定影响见表4。自来水中因大量金属离子的影响，磺草灵的回收率较低；而EDTANa2的加入，消除了金属离子对磺草灵的测定干扰，因此明显改善了回收率。但是在洋葱、菠菜、马铃薯3种样品中却并未得到类似的结果，EDTANa2添加与否并未对结果造成明显差异，而且回收率也在正常范围内。由此说明这些样品中所含有的干扰金属离子不多，未对实验结果造成很大影响，因此EDTANa2的作用没有表现出来。但为了安全起见，在以后的实验中均使用了EDTANa2。

表 4 添加或未添加EDTANa2 4种样品中磺草灵的回收率

Table 4 Recovery of asulam from 4 samples with or without EDTANa2

2.5 回收率、精密度和方法定量限

表 5 磺草灵在6种样品中的回收率和精密度

Table 5 Recovery and precision of asulam from 6 samples

表 6 磺草灵在6种样品中的基质效应

Table 6 Matrix effect of asulam in 6 samples

由表5可知，6种样品的回收率在70.6%～107.8%，相对标准偏差(RSD)为1.0%～14.0%，日间精密度为4.4%～17.7%。未知样品中均无目标物检出，并且对于定量、定性离子，均无干扰峰出现。根据仪器定量限及前处理过程中的稀释倍率，方法定量限为0.01mg/kg。方法的准确度和精密度均满足实际检测工作的需要。

另外，确认了6种样品对磺草灵产生的基质效应，结果见表6。基质回收率为81.4%～115.0%，相对标准偏差(RSD)为4.9%～11.1%，可以认为没有明显的基质影响。

3 结 论

本方法用甲醇提取样品中的磺草灵，用固相萃取柱HLB净化，有效去除基质中的干扰，最后用LC-MS-MS分析测定。方法操作简便，避免了前处理衍生化的复杂操作以及给结果带来的不稳定因素。在验证实验中目标物表现出了良好的重复性和再现性，基质影响很小，结果准确，在6种有代表性的样品中回收率良好。该方法比日本公定法中的磺草灵试验法在时间上节约了一半，而灵敏度却提高了1倍。方法限为0.01mg/kg，可以满足国内外现行法规的要求，可用于农产品中磺草灵的检测。关于EDTANa2的使用，对含金属离子较多的自来水效果明显，对农产品的效果需要对更多的样品进行确认。

参考文献：

[1] 丁旭峰. 磺草灵钠盐水剂防治甘蔗田一年生杂草试验[J]. 浙江农业科学, 2010(2): 382-383.

[2] 宋晓青, 刘树深, 刘海玲, 等. 部分除草剂与重金属混合物对发光菌的毒性[J]. 生态毒理学报, 2008, 3(3): 237-243.

[3] 刘洁, 慕小倩, 丁秀丽, 等. 新化合物P0603的除草活性测定[J]. 西北农业学报, 2007, 16(3): 281-284.

[4] 刘艳霞. 除草剂应用中出现的问题及发展新动向[J]. 现代农村科技, 2010(16): 22-23.

[5] KAUFMANN A, KAENZIG A. Contamination of honey by the herbicide asulam and its antibacterial active metabolite sulfanilamide[J]. Food Additives and Contaminants, 2004, 21(6): 564-571.

[6] European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance asulam[R]. Parma: EFSA, 2010.

[7] PAKEMAN R, LEDUC M, MARRS R. An assessment of aerially applied asulam as a method of long-term bracken control[J]. Journal of Environmental Management, 1998, 53(3): 255-262.

[8] 欧盟决定撤销除草剂磺草灵登记[J]. 农药研究与应用, 2012, 16(1): 31.

[9] 李宁, 赵志强, 王小骊, 等. DB33/T 675—2008 茶叶安全生产种植技术规范[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[10] 傅丹萍, 刘璇, 王小骊, 等. DB33/T 676—2008 香菇安全生产技术规范[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[11] MASAYUKI S, SHINJI T, KAZUHITO N. Determination of asulam in food using Sep-Pak C18 cartridge for clean-up[J]. Hokkaido Institute of Public Health Journal, 1998, 48: 77-78.

[12] SANCHEZ F G, DIAZ A N, BRACHO V, et al. Automated determination of asulam by enhanced chemiluminescence using luminol peroxidase system[J]. Luminescence, 2009, 24(6): 448-452.

[13] 李薇, 韩红娥, 王彩玲, 等. 磺草灵原药的液相色谱分析方法研究[J]. 农药科学与管理, 2005, 26(4): 6-8.

[14] HUERTAS-PÉREZ J F, GARCÍA-CAMPAÑA A M. Determination of N-methylcarbamate pesticides in water and vegetable samples by HPLC with post-column chemiluminescence detection using the luminol reaction[J]. Analytica Chimica Acta, 2008, 630(2): 194-204.

[15] CHICHARRO M, ZAPARDIEL A, BERMEJO E, et al. Simultaneous UV and electrochemical determination of the herbicide asulam in tap water samples by micellar electrokinetic capillary chromatography[J]. Analytica Chimica Acta, 2002, 469(1): 243-252.

[16] Li T L, Lee W C, Chang P C, et al. High performance chromatographic determination of asulam residue in agricultural products[J]. Journal of Food and Drug Analysis, 2001, 9(1): 40-44.

[17] Chivulescu A, Catalá-Icardo M, Garc??a Mateo J V, et al. New flow-multicommutation method for the photo-chemiluminometric determination of the carbamate pesticide asulam[J]. Analytica Chimica Acta, 2004, 519(1): 113-120.

[18] 王大宁. 磺草灵检测方法(农产品)[M]//日本厚生劳动省食品中农用化学品残留检测方法(增补本1). 北京: 中国标准出版社, 2007: 60-61.

[19] LEHOTAY S, KOK A, HIEMSTRA M, et al. Validation of a fast and easy method for the determination of residues from 229 pesticides in fruits and vegetables using gas and liquid chromatography and mass spectrometric detection[J]. Journal of AOAC International, 2005, 88(2): 595-614.

[20] AIZAWA S, NAKAMURA M, ASUKAWA T, et al. Fluorometric determination of asulam in water by using solid-phase extraction[J]. Japan Analyst, 2000, 49(1): 65-68.