高效液相色谱-质谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中叶酸、VB12和生物素

王凤玲，刘爱国，孙佳佳，彭 诚

(天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134)

摘 要：建立高效液相色谱-质谱法对婴幼儿配方奶粉中叶酸、VB12和生物素同时定性和定量分析方法。采用等电点沉淀(pH1.90/4.70)法提取样品，SB-Aq(2.1mm×100mm，1.8μm)色谱柱分离，0.1%(V/V)甲酸溶液和乙腈作流动相，等度(16.5:83.5，V/V)洗脱，质谱MRM检测。结果表明：叶酸、VB12和生物素在5min内得到很好的分离。线性范围分别为3.5～250ng/mL、0.8～5.0ng/mL、0.7～50ng/mL，加样回收率平均值分别为97.8%、102.3%、96.9%，RSD分别为1.33%、0.9%、1.37%。该方法具有较好的精密度和准确性、灵敏度高、操作简单快速，可以应用于婴幼儿配方奶粉中叶酸、VB12和生物素的含量同时测定。

关键词：叶酸；VB12；生物素；等电点沉淀；高效液相色谱-质谱

Simultaneous Determination of Folic Acid, Vitamin B12 and Biotin in Infant Formula by HPLC-MS-MS

WANG Feng-ling，LIU Ai-guo，SUN Jia-jia，PENG Cheng

(Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,
Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Abstract：A method using high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS) for simultaneous determination of folic acid, vitamin B12 and biotin in infant milk power was presented. Samples were sequentially extracted and then subjected to isoelectric precipitation (pH 1.90/4.70). The analysis was carried out on an SB-Aq column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) with isocratic elution using a mobile phase made up of 0.1% (V/V) aqueous formic acid and acetonitrile (16.5:83.5, V/V). The analytes were detected in the MRM mode. Folic acid, vitamin B12 and biotin in samples could be separately well within 5 min. The calibration curves were linear over the concentration range of
3.5 - 250 ng/mL for folic acid, 0.8 - 5 ng/mL for vitamin B12, and 0.7 - 50 ng/mL for biotin. The average recovery rates were 97.8%, 102.3% and 96.9%, with RSD of 1.33%, 0.9% and 1.37% for folic acid, vitamin B12 and biotin, respectively. The developed method is precise, accurate, sensitive, fast and simple, which can thereforebe applied for the analysis of folic acid, vitamin B12 and biotin in infant formula.

Key words：folic acid；vitamin B12；biotin；high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS)；isoelectric precipitation

中图分类号：TS252.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0269-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322054

婴幼儿配方奶粉又称为母乳化奶粉，添加的营养成分对婴幼儿快速发育的各种组织和器官具有十分重要的作用。叶酸、VB12和生物素是婴幼儿配方奶粉必需添加的维生素，且含量仅为10-9级，国家标准对乳制品中叶酸、VB12和生物素的测定采用微生物分析方法[1-3]，步骤繁多、实验周期长、环境要求高、影响因素多，且重复性稍差。

同时测定叶酸、VB12和生物素单种或其中的2种的高效液相色谱法(high performance liquid chromatograp，HPLC)[4-12]和高效液相色谱-质谱(HPLC-mass spectrometry-mass spectrometr，HPLC-MS-MS)[13-17]测定方法国内外已有报道。婴幼儿配方奶粉基质较多，3种维生素添加量又很少，HPLC法利用紫外检测器对3种维生素同时检测，灵敏度低、样品前处理复杂，且杂质峰干扰多。HPLC-MS-MS具有色谱分离和质谱鉴定的双重功能，在快速分离的同时可提供可靠、精确的相对分子质量及结构信息，灵敏度高。利用HPLC-MS-MS对基体复杂的婴幼儿配方奶粉中3种维生素进行同时分离测定得方法在国内外还未见相关报道，本实验采用HPLC-MS-MS对婴幼儿配方奶粉中叶酸、VB12和生物素进行了同时定性和定量分析。同时，由于婴幼儿配方乳粉富含蛋白质、糖类、脂肪等复杂基质，对3种维生素提取影响较大，实验对6种样品前处理方法[14-21]进行优化，建立了一种加标回收率高、检测结果准确的提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5种婴儿配方奶粉(样品A～E) 市购。

叶酸标准品(≥97%) 上海蓝季科技发展有限公司；VB12标准品(≥98%) 天津市光复精细化工研究所；生物素标准品(≥98%) 国药集团化学试剂有限公司；乙腈(色谱纯) 美国J.T.Baker公司；甲酸(色谱纯) 美国Alfa Aesar公司；实验室用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

1200超高压液相色谱仪、6410B三重四极杆质谱仪、Ecliplus C18色谱柱、SB-Aq水相色谱柱 美国Agilent公司；ME215P电子天平 德国Sartorius公司；PHB-4 pH计 上海雷磁仪器厂；HC-2517高速离心机 科大创新股份有限公司；Milli-Q水纯化系统 美国Millipore公司。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-Aq(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：0.1%(V/V)的甲酸溶液-乙腈(83.5:16.5，V/V)，等度洗脱；流速0.2mL/min；柱温25℃；进样量10μL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)；正离子模式；毛细管电压4000V；干燥气流速11.0L/min；雾化气压力241kPa；干燥气温度350℃；扫描方式：多反应监测模式(multi-reactions monitoring，MRM)；3种维生素母离子、定量离子、碎裂电压、碰撞电压参数见表1。

表 1 仪器的质谱条件

Table 1 Instrumental settings of the mass spectrometry

1.4 样品预处理

称取5.0000g奶粉样品加20mL 60℃水，振摇溶解后，超声提取10min。降至室温后，用5mol/L的HCl溶液调节pH值至1.90，放置2min，再用5mol/L的NaOH溶液调节pH值至4.70，转移至50mL容量瓶中，用水定容并混匀。10000r/min离心10min，取上清液，用0.22μm水系滤膜过滤，待测。因水溶性维生素易见光分解，实验过程应避光，采用棕色器皿，样品需在4h内使用，且保存在4℃冰箱中，使用前恢复到室温。

1.5 方法

1.5.1 线性范围和最低检出限的确定

分别吸取质量浓度为200µg/mL的叶酸、VB12、生物素3种标准储备溶液，按质量比50:1:10取样置于25mL棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，混合均匀，得到混合标准储备溶液，铝箔做避光保护，放置在4℃冰箱中储存。

取混合标准储备液，配制叶酸质量浓度分别为3.5、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0ng/mL，VB12质量浓度分别为0.8、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0ng/mL，生物素质量浓度分别为0.7、5.0、10.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0ng/mL的标准溶液，按1.3节中的色谱和质谱条件进样分析，确定3种维生素的线性范围。最低检出限以3倍信噪比所对应的进样质量浓度求得。

1.5.2 精密度和重复性

取同一质量浓度维生素的混合标准溶液和样品溶液，每份进10μL，连续进样5次，分别计算3种维生素峰面积的相对标准偏差(RSD)，考察仪器、方法的精密度。精密称取同一样品共5份，按1.4节样品预处理方法制备，依1.3节方法测定，计算样品含量，考察样品提取和测定方法的重复性。

1.5.3 稳定性

精密吸取同一质量浓度混合标准溶液和样品溶液各10mL，每隔1h分别注入液相色谱-质谱仪，依法测定，以叶酸、VB12、生物素峰面积积分值为指标，测定其稳定性。

1.5.4 加样回收率

精密称取同法测定的已知含量样品共6份，分别精密加入3个不同浓度的混合标准应用液，按1.4节样品预处理方法制备，依1.3节方法测定，每个浓度测定5次(n=5)，计算回收率。

式中：C1为加入标准溶液后混合样品中维生素含量/
(μg/100g)；C2为原样品溶液中维生素含量/(μg/100g)；C为标准溶液中维生素含量/(μg/100g)。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

叶酸、VB12、生物素均为水溶性维生素。实验比较Ecliplus C18色谱柱和SB-Aq水相色谱柱分离3种维生素混合标准溶液和样品溶液，SB-Aq水相色谱柱分离效果明显好于Ecliplus C18色谱柱。分别对流动相甲醇-0.1%甲酸溶液(V/V)、乙腈-0.1%甲酸溶液(V/V)的不同比例等度洗脱和梯度洗脱体系及流速进行考察，乙腈和0.1%(V/V)的甲酸溶液(83.5:16.5，V/V)作流动相等度洗脱时，3种维生素完全分离，峰形好，丰度响应值大，无杂峰干扰，峰形对称。保留时间分别为：叶酸2.61min、VB12 3.01min、生物素3.84min，每个样品完全检出时间为5.0min(图1、2)。

1～3分别为叶酸、VB12、生物素。下同。

图 1 混合标准溶液MRM色谱图

Fig.1 MRM chromatograms of mixed standards

图 2 样品溶液MRM色谱图

Fig.2 MRM chromatograms of infant formula sample

2.2 质谱条件的选择

在电喷雾源(ESI)、正离子检测方式下，叶酸、VB12和生物素的准分子离子峰均为[M+＋H]+峰，m/z分别为442.4、678.6、245.3。适合的碎裂电压能提高母离子的丰度响应值，在不同碎裂电压下，对母离子做MS2 SIM扫描，根据峰面积大小确定叶酸、VB12、生物素的碎裂电压分别为120、135、120V。碰撞电压是对母离子做 Product Ion扫描，将母离子打碎，得到主要碎片离子响应丰度最大的电压分别为25、25、10V，最终确定定量检测离子对分别为m/z 442.4＞295.2、m/z 678.6＞147.2、m/z 245.3＞226.9。

2.3 样品前处理方法的优化

叶酸、VB12、生物素本身是水溶性维生素，易溶于热水，采用超声提取10min能够提取完全[7,13,22]。但婴幼儿配方乳粉中的蛋白质会影响提取效率，因此选择合适的蛋白沉淀剂十分重要。实验比较60%(V/V)高氯酸法、乙腈法、乙酸钠缓冲液(pH4.0)法、无水乙醇法、10%(m/m)硫酸锌法、等电点(pH1.90/4.70)法6种样品前处理方法对样品A中3种维生素的提取效果(表2)。发现60%(V/V)高氯酸法对叶酸提取效果较好，对生物素、VB12较差；乙腈法对3种维生素提取效果都比较差，质谱响应丰度低；乙酸钠缓冲液(pH4.0)法对叶酸、生物素的分离提取效果效果较好，但VB12峰值偏低；无水乙醇法对叶酸和VB12的分离提取效果都很差，生物素峰扩散且分裂；10%(m/m)硫酸锌法对VB12的提取效果较好，生物素峰分裂，对叶酸提取效果差；等电点(pH1.90/4.70)法对叶酸、VB12、生物素提取均较理想，因此本实验采用该法进行提取。

表 2 样品前处理优化实验结果

Table 2 Comparison of results obtained by different sample pretreatment methods

2.4 方法学评价

2.4.1 标准曲线和最低检出限

以标准溶液峰面积积分为纵坐标，维生素质量浓度为横坐标，分别绘制标准曲线。叶酸在3.5～250ng/mL
范围内的标准曲线方程为y=2.0984x＋2.6089；VB12在0.8～5.0ng/mL范围内的标准曲线方程为y=30.357x＋1.0304；生物素在0.7～50ng/mL范围内的标准曲线方程为y=11.712x－1.1146。3种维生素相关系数r均大于0.999。以3倍信噪比(RSN=3)为最低检出限，叶酸、VB12、生物素分别为1.05、0.24、0.21ng/mL；以10倍信噪比(RSN=10)为定量限，叶酸、VB12、生物素分别为3.5、0.8、0.7ng/mL。实验表明可以对3种维生素含量较低的样品进行定量分析。

2.4.2 精密度和重复性

取叶酸、VB12、生物素混合标准溶液3个质量浓度，每个质量浓度连续进样5次，保留时间RSD为0.14%～0.41%，峰面积RSD为1.0%～1.5%，可见仪器的精密度良好(表3)，适用于定性定量分析。以3种维生素含量为测定指标，对样品A考察方法的重复性，结果RSD为1.65%～2.81%，叶酸、VB12、生物素平均含量分别为80.1、1.68、14.7µg/100g，表明该方法重复性良好。

表 3 不同质量浓度精密度实验(n=5)

Table 3 Results of precision tests at various concentrations (n=5)

2.4.3 稳定性

新制备的样品溶液峰面积记为100%，以时间为横坐标，样品溶液中3种维生素积分面积变化百分比为纵坐标，稳定性曲线见图3，3种维生素在4h内稳定性好。

图 3 样品溶液中3种维生素稳定性

Fig.3 Stability of three vitamins in samples

2.4.4 加样回收率

样品A中分别添加3个不同质量浓度(表4)标准溶液进行提取测定，叶酸、VB12、生物素的平均回收率分别为97.8%、102.3%、96.9%，RSD分别为1.33%、0.90%、1.37%。表明本法准确性较好，方法可行，适合婴幼儿配方奶粉中3种维生素的定量分析。

表 4 回收率实验结果

Table 4 Results of recovery tests

2.5 实际样品测定

对5例市售婴幼儿配方乳粉样品用所建立的方法测定，每个样品3份平行，测定3次，结果取平均值，采用标准曲线法计算(表5)。

表 5 婴幼儿配方奶粉测定结果

Table 5 Analytical results for infant formula samples by HPLC-MS-MS

3 结 论

实验采用了HPLC-MS-MS的方法，对婴儿配方奶粉中的叶酸、VB12和生物素同时测定。婴儿配方奶粉中3种维生素含量极低(国家标准要求叶酸大于40μg/100g、VB12大于1.2μg/100g、生物素大于9.0μg/100g)，且基质复杂，利用三重四极质谱的MRM高选择性检测，避免了固相萃取带来的回收率低、分析时间长、耗材成本高的问题，简化了实验步骤，为质量监控提供了有效的检测手段。采用所建立的方法对3种市售婴幼儿配方乳粉进行定量检测实验，结果与食品标签标识含量接近，且精确度、稳定性、重复性较高，适合婴幼儿配方奶粉中叶酸、VB12和生物素3种维生素的分析定量研究。

参考文献：

[1] 中华人民共和国卫生部. GB 5413.19—2010 婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[2] 中华人民共和国卫生部. GB 5413.16—2010 婴幼儿食品和乳品中叶酸的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[3] 中华人民共和国卫生部. GB 5413.14—2010 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[4] 成志强, 孙成均, 黎源倩. 反相高效液相色谱法同时测定食品和多维片中8种水溶性维生素[J]. 分析化学, 2001, 29(9): 1068-1071.

[5] AURORA-PRADO M S, SILVA C A, TAVARES F M, et al. Determination of folic acid in tablets by microemulsion electrokinetic chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2004, 1051(1/2): 291-296.

[6] 包怡红, 石丹, 贾云虹, 等. 固相萃取-反相高效液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中叶酸的含量[J]. 营养学报, 2009, 31(3): 289-292.

[7] 周迅雷, 褚庆环, 张志国, 等. 高效液相检测婴儿配方乳粉中的维生素B12[J]. 食品工业科技, 2009, 30(6): 330-335.

[8] 刘娜, 陈大舟, 汤桦, 等. 婴儿配方奶粉中8种水溶性维生素的高效液相色谱同时测定[J]. 分析测试学报, 2008, 27(4): 408-411.

[9] 雷涛, 张辉, 韩惠雯, 等. 婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素的检测方法研究[J]. 乳业科学与技术, 2007, 30(2): 81-83.

[10] 石丹, 包怡红, 贾云虹, 等. 反相高效液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中叶酸的含量[J]. 食品工业科技, 2009, 30(3): 319-321.

[11] 商允鹏, 张志国, 韩建春, 等. SPE-HPLC法检测婴幼儿配方乳粉中生物素的质量分数[J]. 中国乳品工业, 2009, 37(2): 53-56.

[12] 刘波, 王晓工, 王心祥, 等. 高压液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸[J]. 中国乳品工业, 2003, 31(3): 39-40.

[13] 刘娜. 食品中水溶性维生素B分析方法的研究[D]. 北京: 北京化工大学, 2008: 52-56.

[14] ALBALA-HURTADO S, VECIANA-NOGUES M T, IZQUIERDO-PULIDO M, et al. Determination of water-soluble vitamins in infant milk by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 1997, 778(1/2): 247-253.

[15] LEPORATI A, CATELLANI D, SUMAN M, et al. Application of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method to the analysis of water-soluble vitamins in Italian pasta[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 531(1): 87-95.

[16] 喻凌寒, 苏流坤. 婴幼儿配方食品中生物素的高效液相色谱-质谱联用测定[J]. 分析测试学报, 2009, 28(2): 231-234.

[17] 郎昭滨, 程纲领, 马世波. 婴幼儿配方食品和乳粉中串联四级杆质谱的检测方法[J]. 中国乳品工业, 2009, 37(9): 39-42.

[18] 王竹. 样品前处理对食物中叶酸测定的影响[J]. 卫生研究, 2000, 29(6): 404-406.

[19] 刘莉治, 罗晓燕, 周洪伟, 等.高效液相柱后衍生法测定婴幼儿食品中的叶酸[J]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(7): 1179-1180.

[20] 陈稚, 揭新明, 蔡康荣. 高效液相色谱与电喷雾电离质谱联用测定婴儿配方奶粉中的牛磺酸和维生素[J]. 广东医学院学报, 2007, 25(3): 252-254.

[21] 王一红, 冯家力, 潘振球, 等. 液相色谱-串联质谱法分析10种水溶性维生素[J]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(7): 1160-1162.

[22] 郝岩平, 姜金斗, 房玉国. HPLC法测定婴幼儿配方奶粉复合维生素添加剂中维生素B12方法的研究[J]. 中国食品添加剂, 2004(2): 93-96.