乳清蛋白酶解物促干酪乳杆菌生长作用的研究

韦慧娟1,陈树兴1,*,李丽丽2,陈建坡1,任发政3

(1.河南科技大学食品与生物工程学院,河南 洛阳 471003;2.农业部畜牧总站全国奶牛生产性能测定标准物质制备
实验室,北京 101300;3.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

 

摘 要:为探讨乳清蛋白酶解物促干酪乳杆菌生长的影响,首先通过正交试验筛选胰蛋白酶酶解乳清浓缩蛋白的条件;然后,分析不同酶解时间的乳清蛋白酶解物(WPH)对干酪乳杆菌(L. casei Shirota)的促生长作用;进一步使用超滤膜将WPH分离为不同分子质量的3个部分(E、F、G),比较它们对干酪乳杆菌的促生长作用。结果表明:在乳清蛋白质量浓度4.0g/100mL、胰蛋白酶与乳清蛋白比([E]/[S])3%、pH8.0、酶解温度53℃的条件下,水解度达到较高,为12.67%;添加不同酶解时间的WPH均对干酪乳杆菌有促生长作用,5h和7h酶解得到的WPH增菌效果更显著;SDS-PAGE电泳分析表明,随酶解时间的增加,更多的蛋白被酶解成了小片断;超滤部分(F、G)均表现了增菌作用,分子质量3kD以下的酶解产物增菌作用最强。结论:乳清蛋白酶解物对干酪乳杆菌具有促生长作用,其中低分子肽(小于3kD)是促进干酪乳杆菌生长的主要成分。本研究结果将为乳清蛋白的有效利用、干酪乳杆菌高浓度培养技术的完善提供一定的数据支持。

关键词:胰蛋白酶; 乳清蛋白酶解物(WPH);干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Shirota);促生长

 

Effect of Whey Protein Hydrolysate on Growth of Lactobacillus casei Shirota

 

WEI Hui-juan 1,CHEN Shu-xing1,*,LI Li-li2,CHEN Jian-po1,REN Fa-zheng3

(1. College of Food and Biotechnology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China;
2. The Laboratory of Dairy Herd Improvement and Preparation of Standard Material of National Husbandry Service, Ministry of Agricuture,

Beijing 101300, China;3. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

 

Abstract:In order to explore the impact of whey protein hydrolysate (WPH) on the growth of Lactobacillus casei Shirota (LCS), hydrolysis conditions were screened through an orthogonal array design. The growth-promoting effect of WPH obtained from different hydrolysis time on LCS was analyzed. WPH was separated into three parts (E, F, and G) with different molecular weights through ultrafiltration, and their promotion effects on the growth of LCS were compared. The results showed that higher hydrolysis degree of 12.67% was obtained under hydrolysis conditions of 4 g/100 mL WPC, trypsin-to-WPC ratio ([E]/[S]) of 3.0%, pH 8.0, and hydrolysis temperature of 53 ℃. Supplementation of different WPH showed a promoting effect on LCS growth, and WPH obtained from 5 h and 7 h hydrolysis possessed better growth-promoting effect. Along with an increase in hydrolysis time, more proteins were hydrolyzed into small pieces, as confirmed by SDS-PAGE gel electrophoresis. Both ultrafiltration portions (F and G) of WPH promoted LCS growth, and fraction G with molecular weight less than 3 kD showed the strongest promoting effect on LCS growth. These results will provide data support for efficient utilization of whey protein and improvement of high-concentration LCS cultivation.

Key words:trypsin;whey protein hydrolysate;Lactobacillus casei Shirota;growth promotion

中图分类号:TS252.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)21-0188-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321039

干酪乳杆菌作为益生菌的一种,能够耐受胃酸和胆汁酸,有调节肠内菌群平衡、维持人体NK-细胞活性[1],促进人体消化吸收、降低胆固醇[2],预防癌症等益生保健作用,且干酪乳杆菌还有调节人体血压的作用[3]。

乳清是生产干酪或干酪素的副产品。化学成分主要包含乳清蛋白、乳糖和灰分。学者们认为添加乳清成分能促进某些益生菌的生长。Christopherson等[4]的研究表明,保持较高pH值的无蛋白乳清较复原脱脂乳,更适合作为增菌培养基来培养嗜温乳酸链球菌。单继勋等[5]利用乳清粉作为基质成分来培养保加利亚乳杆菌,结果表明,活菌数高达0.46×109CFU/mL,接近相同条件下以脱脂乳为培养基的活菌数。这些研究表明,利用乳清为基质培养基能够降低成本,同时也减少了乳清排放对环境的污染。乳清蛋白作为乳清中的一种主要成分,其必需氨基酸种类齐全,容易消化吸收,具有丰富营养价值和独特保健功能[6]。但乳酸菌自身蛋白水解能力很弱,因此学者们研究了蛋白酶解物对益生菌的促生长作用。St-Gelais等[7]的研究表明,添加酪蛋白酶解物能显著促进乳酸球菌Wg2的生长,且分子质量分布小于2kD肽段所含的成分,是促使Wg2菌增殖显著的主要成分。张清丽[8]的研究表明,添加小于3kD肽段的酪蛋白酶解物,能显著促进嗜热链球菌对数期活菌数的增加。白凤翎等[9]的研究表明,乳清蛋白酶解物与超滤后的分离物对嗜酸乳杆菌B均有一定增殖作用,其中分子质量1kD以下的产物促生长效果更为显著。

本研究选用乳清蛋白浓缩物(WPC-80)为原料,用胰蛋白酶进行酶解,探讨乳清蛋白酶解物对干酪乳杆菌的促生长作用,并利用膜分离技术,将乳清蛋白酶解物分离成不同分子质量的部分,探讨各成分对干酪乳杆菌的促生长作用,希望能找出乳清蛋白酶解物中促进干酪乳杆菌生长的主要成分,同时为乳清蛋白的有效利用、干酪乳杆菌高浓度培养技术的完善提供一定的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

WPC80 北京科百奥生物科技有限责任公司。

胰蛋白酶 北京世纪华林生物科技有限公司;氢氧化钠、茚三酮、过硫酸铵、丙烯酰胺、N,N’-甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、N-三羟甲基氨基乙烷(简称Tris)、β-巯基乙醇、甘油、溴酚蓝、甘氨酸、考马斯亮蓝G-250、丙三醇、乙醇、冰醋酸、甲醇,以上皆为分析纯;BCA蛋白定量试剂盒 北京康为世纪生物科技公司;电泳中所用低分子质量标准蛋白 美国Sigma公司。

1.2 菌株与培养基

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Shirota),由中国农业大学食品学院教育部功能乳品重点实验室提供,以甘油管保存。使用前,从甘油管挑取一环菌斜面划线活化,然后从斜面挑取一个单菌落于MRS液体培养基中37℃培养24h,再以3.0%接种量于25mL液体MRS培养基中,37℃培养过夜。每次使用前进行2次活化培养,待菌种活力充分恢复后用于后续实验。

MRS(琼脂)培养基、MRS肉汤培养基 北京路桥技术有限公司。

1.3 仪器与设备

雷磁pHS-3D型pH计 上海精密科学仪器有限公司;UV-4802S紫外-可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;Amicon Ultra-15 北京科百奥生物科技有限责任公司;5417R小型台式高速离心机 北京科宇翔贸易有限公司;MLS-3750型高压灭菌锅 创博环球(北京)生物科技有限公司;DL-CJ-2N型生物洁净工作台 北京晨曦勇创科技有限公司;HY-2型调速多用振荡器、DNP-9082型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;DYCZ-24A型电泳槽、DYY-6B型稳压稳流电泳仪 南京普阳科学仪器研究所;GelDoc-XR凝胶成像分析系统 北京凯慕生物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 胰蛋白酶酶解条件的筛选

参考张洁等[10]的研究,进行单因素试验。分别考察酶解时间(1、3、5、7、9h)、酶解温度(38、43、48、53、58℃)、pH值(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)、底物质量浓度(0.5、2.5、4.0、5.5、7.0g/100mL)、酶与底物比([E]/[S])
(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)对水解度(DH)的影响。其中DH的测定参考李晓东等[11]所报道的方法。

在上述研究基础上,以水解度为指标,对酶解温度、pH值、底物质量浓度和[E]/[S],采用四因素三水平的L9(34)正交试验进行了最佳组合筛选,固定酶解时间为5h。

1.4.2 不同水解度WPH的增菌效果研究

按照以上正交试验筛选出的条件,对WPC80进行酶解,其酶解工艺参照Kim等[12]的研究。在酶解的不同时间点(0、1、3、5、7h)条件下分别取出3份大于后面试验用量的WPH,灭酶后放入0~4℃冰箱备用。1)取适量不同水解度的WPH参照吕媛等[13]所报道的方法,进行蛋白定量。分离胶12%,浓缩胶5%,进行SDS-PAGE电泳实验[14],分析WPH的分子质量分布。2)从冰箱中取出适量WPH,按体积分数10%的量,添加到液体MRS培养基中,121℃灭菌15min;接入3.0%干酪乳杆菌培养10h;然后,采用MRS琼脂培养基,37℃、24h培养,平板计数记录活菌总数。以上实验均重复3次。

1.4.3 WPH不同超滤成分的增菌作用

将5h酶解后(按照1.4.2节制备)的WPH使用0.45µm的滤膜进行抽滤。然后参照文献[15],选择合适的温度、转速,借助离心机将滤过液通过分子质量为8kD的Amicon Ultra-15滤膜进行一级超滤。一级滤液用3kD滤膜进行二级超滤,最后分别收集3个分子质量范围的酶解物(依次标记为E、F、G),放入0~4℃冰箱备用。超滤组分固形物含量的测定参照食品安全国家标准[16]进行实验和分析;为了测定不同超滤组分的增菌效果,将每个分子质量范围的WPH各取3份,均按0.1g/100mL的量,添加于液体MRS培养基中,然后将3.0%的干酪乳杆菌分别加入到MRS、MRS+E、MRS+F、MRS+G培养基中,培养4h后取样,测定活菌数、pH值,以观察前期干酪乳杆菌快速生长、发酵的情况;培养12h后进行同样的取样和测定,以判定WPH对干酪乳杆菌的增菌效果。

1.5 统计分析

所有统计分析均采用DPS软件分析。

2 结果与分析

2.1 胰蛋白酶酶解条件的筛选

2.1.1 单因素试验结果

2.1.1.1 酶解时间对水解度的影响

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图 1 酶解时间对水解度的影响

Fig.1 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis (DH)

在酶解温度53℃、pH8.0、底物质量浓度5.5g/100mL、[E]/[S] 2%条件下,分别选取时间1、3、5、7、9h酶解乳清浓缩蛋白(WPC),研究酶解时间对水解度(DH)的影响。由图1可知,开始酶解时,蛋白和酶的接触面较大,酶解迅速,水解度呈直线上升趋势。5h后变化缓慢,因此可以初步得出5h是该条件下筛选出的较适时间。

2.1.1.2 pH值对水解度的影响

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图 2 pH值对水解度的影响

Fig.2 Effect of pH on DH

选择酶解时间5h、酶解温度53℃、底物质量浓度5.5g/100mL、[E]/[S] 2%,考察pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5对DH的影响。由图2可知,选取pH6.6~8.5的范围进行pH值标定。pH值为6.5时,胰蛋白酶酶活性较低,导致水解度值也低;pH值在7.0~8.0之间,水解度呈直线上升趋势;超过8.0时水解度值迅速下降,在确保胰蛋白酶的最大活性条件下,为减少反应产生较多的盐,则选用较佳pH值为8.0。

2.1.1.3 温度对水解度的影响

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图 3 温度对水解度的影响

Fig.3 Effect of temperature on DH

在酶解时间5h、pH 8.0、底物质量浓度5.5g/100mL、[E]/[S] 2%条件下,分别选取温度38、43、48、53、58℃酶解WPC,研究温度对DH的影响。由图3可知,起初随温度的升高水解度稳步上升,当温度升到53℃时,水解度达到一个最值。温度在53~58℃时,水解度呈陡然下降趋势。初步筛选53℃为较合适的温度。

2.1.1.4 底物质量浓度对水解度的影响

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图 4 底物质量浓度对水解度的影响

Fig.4 Effect of substrate concentration on DH

在酶解时间5h、pH 8.0、酶解温度53℃、[E]/[S] 2%条件下,分别选取底物质量浓度0.5、2.5、4.0、5.5、7.0g/100mL酶解WPC,研究底物质量浓度对DH的影响。由图4可知,底物质量浓度在0.5~4.0g/100mL时,水解度迅速增大。此后继续增大底物质量浓度,乳清蛋白水解度呈缓慢下降趋势。表明蛋白质量浓度大于4.0g/100mL时,体系中胰蛋白酶底物中的肽键处于过饱和的状态。因此选择4.0g/100mL为较合适的底物质量浓度。

2.1.1.5 [E]/[S]对水解度的影响

在酶解时间5h、酶解温度53℃、pH8.0,底物质量浓度4.0g/100mL条件下,分别选取[E]/[S]为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%酶解WPC,研究酶与底物比对DH的影响。由图5可知,[E]/[S]在1%~3%时,酶解液水解度随[E]/[S]的增大而增大,超过3%,增加趋势趋于平缓。综合成本方面的考虑,选择[E]/[S]为3%更为合适。

471256.jpg 

图 5 [E]/[S]对水解度的影响

Fig.5 Effect of [E]/[S] on DH

2.1.2 正交试验结果

表 1 胰蛋白酶酶解乳清蛋白的L9(34)正交试验设计结果

Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of hydrolysis of whey protein by trypsin

试验号

A酶解温度/℃

B pH

C底物质量浓度/(g/100mL)

D [E]/[S]/%

水解度/%

1

1(48)

1(7.5)

1(3.0)

1(1)

8.58

2

1

2(8.0)

2(4.0)

2(2)

8.00

3

1

3(8.5)

3(5.0)

3(3)

8.98

4

2(53)

1

2

3

12.05

5

2

2

3

1

10.43

6

2

3

1

2

7.01

7

3(58)

1

3

2

6.55

8

3

2

1

3

9.74

9

3

3

2

1

10.31

K1

25.56

27.18

25.33

29.32

 

K2

29.49

28.17

30.36

21.56

 

K3

26.60

26.30

25.96

30.77

 

极差R

3.93

1.87

5.03

9.21

 

因素主次

RD>RC>RA>RB

较优组合

A2B2C2D3

 

 

胰蛋白酶酶解乳清浓缩蛋白条件的正交试验结果如表1所示,影响酶解的因素主次,依次是[E]/[S]、底物质量浓度、温度和pH值。由于筛选出来的条件在正交设计表中没有出现,因此通过验证实验,进一步确定了合理的酶解条件为:酶解温度53℃、pH8.0、[E]/[S] 3%、底物质量浓度4.0g/100mL。在该条件下的水解度达12.67%。

由方差分析得出,所选因素对指标影响都很显著。特定酶都有各自酶解肽段的识别,酶解肽段的分析也各不相同,本试验所选的胰蛋白酶也有着自身的特点。由于蛋白质很难完全酶解成游离氨基酸,酶解产物中更多的是小分子肽;酶解程度越高,小分子肽含量也越多[17]。而研究证明,小分子肽是促进益生菌生长的主要成分[8]。本试验所选的条件得到了较高水解度,其目的也是为了得到较多的小分子肽。

2.2 不同水解度WPH的增菌效果

不同酶解时间WPH的SDS-PAGE分析结果如图6所示,展示了酶解各组分肽段的大致分子质量范围。随着酶解时间延长,大分子质量肽段含量逐渐减少。到达5h时,产物不能呈现蛋白条带,可以推测蛋白质大部分变成了小分子肽和氨基酸。此结论与Liu Lijun [18]等研究结果一致。蛋白质经蛋白酶酶解后,转化成小的片段。酶解足够长时间后,蛋白质大部分变成了小分子肽和氨基酸。

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0、1、3、5、7依次表示酶解0、1、3、5、7h的WPH。

图 6 不同酶解时间的WPH的SDS-PAGE图

Fig.6 SDS-PAGE of whey protein hydrolysates from different hydrolysis time

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图 7 干酪乳杆菌在添加不同酶解时间WPH的MRS培养基中的活菌数

Fig.7 Viable counts of LCS in MRS medium with WPHs from different hydrolysis time

在MRS培养基中添加不同水解度胰蛋白酶酶解液,接入3.0%干酪乳杆菌培养10h,活菌数计数结果见图7。可以看出,有乳清蛋白及其酶解物添加的组,活菌数都显著高于对照组(MRS);尤其是添加酶解物的组,其促生长作用更显著,说明蛋白酶解物能促进某些益生菌的发酵、产酸,这与赵红宇等[19]的研究结果相一致。其主要原因可能是干酪乳杆菌在多肽和蛋白质共存时,优先利用多肽;随着酶解乳清浓缩蛋白时间的增加,干酪乳杆菌活菌数也随之增加,尤其是5h酶解液的添加,使活菌数高达8.79(lg(CFU/mL)),是对照组活菌数的1.1倍。在添加5、7h酶解WPH于液体MRS的培养基中,干酪乳杆菌的活菌数不存在显著差异,因此选择5h酶解的WPH进行后续实验。

2.3 WPH不同超滤成分的增菌作用

添加不同质量范围(E、F、G)的WPH于液体MRS培养基中,干酪乳杆菌在培养4h和12h时的生长情况如表2所示,培养4、12h时,E+MRS和MRS组之间的活菌数均差异不显著(P>0.05);两个时间点下:E+MRS和F+MRS组,F+
MRS和G+MRS组之间的活菌数均差异显著(P<0.05)。即,在MRS中添加E之后的干酪乳杆菌活菌数与对照组活菌数比较,数目上没有显著变化;将F、G分别添加于液体MRS中,活菌数较对照组都有显著增加,说明后面两组组分的添加,对干酪乳杆菌都有一定的促生长作用,其中以G添加后的促生长作用更为显著。随着分子质量的降低其促生长作用逐渐增强,表中显示,小于3kD的肽段对干酪乳杆菌的促生长起了主要作用。

表 2 干酪乳杆菌在添加不同乳清蛋白酶解液超滤组分的MRS培养基中的生长情况(n=3)

Table 2 Growth of LCS in MRS medium with different ultrafiltration portions of WPH (n=3)

MRS-增菌

培养基

4h

 

12h

活菌数(lg(CFU/mL))

pH

 

活菌数(lg(CFU/mL))

pH

MRS

6.87±0.07c

6.11±0.01a

 

8.50±0.06c

4.63±0.01a

E+MRS

6.90±0.10c

6.04±0.02b

 

8.54±0.05c

4. 60±0.02b

F+MRS

7.05±0.04b

5.79±0.02c

 

8.72±0.04b

4.46±0.03c

G+MRS

7.32±0.06a

5.71±0.02d

 

8.89±0.03a

4.42±0.02c

 

注:同行字母不同表示差异显著(P<0.05)。

 

正常情况下,对数期的末期干酪乳杆菌活菌数达到最高值以后,则无明显增长。由表2可知,4h时G的添加使得活菌数达7.32(lg(CFU/mL)),而对照组是6.87(lg(CFU/mL)),12h时G的添加使活菌数高达8.89(lg(CFU/mL))约是对照组的1.1倍。综合以下两个指标得出,F、G分别添加于MRS后,加快了发酵进程,而且能够得到较高的活菌数,为发酵剂大规模生产的可能性提供了一定的科学依据。

3 结 论

通过正交试验对酶解条件进行筛选,在乳清蛋白质质量浓度4.0g/100mL、胰蛋白酶与乳清蛋白比([E]/[S])
3%、pH8.0、酶解温度53℃的条件下,胰蛋白酶酶解乳清浓缩蛋白5h,水解度达到较高的12.67%。

不同酶解时间下WPH的蛋白定量和SDS-PAGE电泳综合表明,随酶解时间的增加,大分子质量肽段含量逐渐减少。酶解5h后,蛋白质大部分变成了小分子肽和氨基酸。不同酶解时间的WPH对干酪乳杆菌都具有促生长作用,随着酶解时间的延长,WPH的促生长效果更加显著。酶解5h的乳清浓缩蛋白酶解物,对干酪乳杆菌促生长效果最为显著。

乳清蛋白酶解液的8、3kD超滤部分对干酪乳杆菌均表现了促生长作用,小于3kD超滤部分的促生长作用最强,表明3kD以下的小分子肽是促干酪乳杆菌生长的主要成分。

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收稿日期:2013-02-04

基金项目:“十一五”国家奶业专项基金项目(2006BAD04A06)

作者简介:韦慧娟(1986—),女,硕士研究生,研究方向为乳品科学。E-mail:weihuijuan3@163.com

*通信作者:陈树兴(1965—),男,副教授,博士,研究方向为功能性乳制品及干酪加工技术。E-mail:chenshuxing1@163.com