响应面优化超声波提取猕猴桃根熊果酸工艺

杨 艳，任亚梅*，马 婷，周九庆，查 晶，张哲学

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

摘 要：为优化猕猴桃根熊果酸的超声波提取最佳工艺，在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度为自变量，熊果酸得率为响应值，利用中心组合试验法和响应面分析法，研究各自变量交互作用及其对熊果酸得率的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。结果表明：当超声功率225 W、超声频率40kHz时，超声波提取熊果酸工艺最佳条件为乙醇体积分数73.8%、液料比7.80∶1（mL/g）、提取时间23.2 min、提取温度79.1 ℃。此提取条件下，熊果酸得率达到2.014%，与模型预测值之间具有较好的拟合性，且提取液中熊果酸的纯度为49.7%。

关键词：猕猴桃根；熊果酸；超声波提取；响应面分析

Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Ursolic Acid from Roots of Actinidia chinensis
Using Response Surface Analysis

YANG Yan, REN Ya-mei*, MA Ting, ZHOU Jiu-qing, ZHA Jing, ZHANG Zhe-xue

(College of Food Science and Engineering, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China)

Abstract: In this study, the conditions for ultrasonic-assisted extraction of ursolic acid (UA) from the roots of Actinidia chinensis were optimized by response surface methodology. On the basis of single-factor experiments, a mathematical regression model was established indicating the effect of ethanol concentration, solvent/solid ratio, extraction time and temperature on the extraction yield of UA by response surface central composite design. Under the conditions of 225 W and 40 kHz, the optimum extraction conditions determined were as follows: 73.8% ethanol concentration, 7.80:1 solvent/solid ratio (mL/g), 23.2 min and 79.1 ℃. Under these conditions, the experimental extraction yield of UA was 2.014%, which is well matched with the predicted value, and the purity of UA in the extract was 49.7%.

Key words: Actinidia chinensis root; ursolic acid; ultrasonic-assisted extraction; response surface analysis

中图分类号：TQ929.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）04-0044-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201404010

猕猴桃根是一种肉质根，多为侧根和水平根，无主根[1]。根中主要含有β-谷甾醇、抗坏血酸、熊果酸、齐墩果酸、琥珀酸和胡萝卜苷等成分，并富含Fe、Cu、Mn和Se等元素。猕猴桃根具有清热消毒、利尿和活血消肿的功效，民间常用于治疗肝炎、水肿、跌打损伤、风湿关节痛、乳汁不足、淋虫、带下、疮疖和瘰疬等疾病[2]。目前，与国内外对猕猴桃、猕猴桃籽油等研究的比较广泛和深入相比，猕猴桃根方面的研究便显得十分有限。

熊果酸（ursolic acid，UA）又称为乌苏酸或乌索酸，是一种弱极性的五环三萜酸。其分子式为C30H48O3，相对分子质量为456.68，在自然界分布很广，并且是多种天然产物的功能性成分。熊果酸在山茱萸、山楂、猕猴桃根、车前草、女贞子等药用植物中广泛分布[3-4]。已有研究[5-12]表明，熊果酸具有较广泛的药理和生物学作用，如降血脂、抗菌、抗病毒、抗癌、抗艾滋病、免疫活性等作用。熊果酸的传统提取方法有索氏提取、回流提取等，近年来在提取工艺方面引入了一些新方法如超临界CO2流体萃取[13]、微波提取[14]、超声提取[15-17]、分子蒸馏技术等。超声提取作为一种先进的提取方法，具有提取时间短、能耗低、效率高等特点。目前采用响应面设计优化熊果酸提取工艺的报道较少。本研究以农民入冬前修剪的秦美猕猴桃根粉为原料，对秦美猕猴桃根粉乙醇溶液进行超声波处理，利用超声波的空化作用、热效应、机械作用加速细胞壁的破碎，促进细胞内物质的释放、扩散及溶解，缩短提取时间[17]，以熊果酸得率为评价指标，在乙醇体积分数、液料比、提取时间、超声功率、提取温度等单因素试验基础上，利用响应面分析法优化超声波提取熊果酸的工艺条件，以期为开发利用猕猴桃根资源及工业化生产熊果酸提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秦美猕猴桃根，于2011年10月采自陕西省周至县丁麻村一管理良好的猕猴桃园。首先，将猕猴桃根用清水冲洗3遍；然后，将根茎切至5cm以下，60 ℃恒温干燥48h，控制其含水量为8%；最后，用多功能中药粉碎机粉碎，粉体过60目筛，将筛下物用0.05mm厚的PE密封袋包装，在低温（0～10 ℃）条件下保存。

熊果酸标准品 上海金穗生物科技有限公司；无水乙醇、香草醛、冰醋酸、乙酸乙酯、高氯酸、石油醚均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WFJ7200紫外分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；HWSYⅡ-K恒温水浴锅 北京长风仪器仪表公司；DGG-9140B电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；KQ 250DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ⅲ（A）循环水真空泵 河南省太康县科教仪器厂；FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

猕猴桃根→清洗→粉碎→过筛（60目）→除杂→乙醇溶解→超声波提取→静置→抽滤→稀释→定容→待测提取液

1.3.2 提取方法

分别称取2.00 g过60 目筛的除杂后的猕猴桃根粉，加入一定量、一定体积分数的乙醇浸提液，置于250mL三角瓶中摇匀，在一定功率条件下超声波（频率为40kHz）处理一定时间后，静置lh，抽滤得含有熊果酸的乙醇溶液上清液，取0.5mL上清液移至10mL容量瓶中，并用相应提取体积分数的乙醇溶液定容。取0.2mL的稀释液移至试管中，置于90 ℃水浴锅中使乙醇蒸干，得到猕猴桃根中熊果酸粗提物的待测样品。

1.3.3 熊果酸测定

称取熊果酸标准品0.0100g，用无水乙醇定容至100mL容量瓶中，即得0.1mg/mL的熊果酸标准溶液。精确取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL熊果酸标准溶液分别于具塞试管中，各具塞试管均放入90℃水浴锅中，挥发掉具塞试管中的乙醇溶剂，各具塞试管中分别加入5%香草醛-冰醋酸0.3 mL和高氯酸0.7 mL，置于60 ℃水浴中加热15 min，取出冷却后移至5 mL聚酯试管中，用99.5%的乙酸乙酯定容至5 mL，摇匀后在549nm波长处测定吸光度[18]。以吸光度为纵坐标，熊果酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出熊果酸标准回归方程为：Y=0.045X－0.0122（R2=0.9986），熊果酸标准品在6～20μg/mL质量浓度范围内呈线性关系。将超声波提取后的样品，按以上测定方法，以无样品液的实验做空白参比，测定吸光度，由熊果酸标准曲线得出待测溶液中熊果酸的质量浓度ρ。熊果酸得率的计算公式为：

X/%=（ρ×D×V/m）×100

式中：X为熊果酸得率/%；ρ为待测溶液中熊果酸的质量浓度/（μg/mL）；V为待测溶液的体积/mL；D为稀释倍数；m为猕猴桃根粉的质量/g。

1.3.4 试验设计

采用Design-Expert统计软件设计并分析试验数据。依据四因素中心组合设计（central composite design，CCD），见表1，考察乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度对熊果酸得率的影响。

表 1 试验设计方案因素水平

Table 1 Factors and levels used in quadratic orthogonal rotation combination design

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对熊果酸得率的影响

图 1 乙醇体积分数对熊果酸得率的影响

Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of ursolic acid

在超声功率225 W、液料比10∶1、温度50 ℃、提取30 min的条件下，乙醇体积分数对熊果酸得率有显著影响，如图1所示，随着乙醇体积分数的增加，熊果酸得率先增加后降低，当乙醇体积分数为75%时，熊果酸得率最大，为1.448%，其原因可用相似相溶原理解释，当提取溶剂的极性与熊果酸的极性接近时，得率最高，由此可以推测75%的乙醇水溶液的极性与猕猴桃根中熊果酸的极性最接近，所以乙醇体积分数在75%左右为宜，即选取75%为自变量乙醇体积分数的零水平。

2.1.2 液料比对熊果酸得率的影响

在超声功率225W、乙醇体积分数75%、温度50 ℃、提取30 min的条件下，液料比对猕猴桃根中熊果酸得率的影响见图2，随着溶剂添加量的增加，熊果酸的得率先增后迅速减小，当液料比达到8∶1时，浸提可达到比较理想的效果，原因可能是随着液料比的增大，熊果酸在整体溶剂中的比例迅速减小，不利于熊果酸的提取。所以液料比8∶1左右为宜，即选取8∶1为自变量液料比的零水平。

图 2 液料比对熊果酸得率的影响

Fig.2 Effect of solvent-to-solid ratio on the extraction yield of ursolic acid

2.1.3 提取时间对熊果酸得率的影响

在超声功率225 W、乙醇体积分数75%、液料比8∶1、温度50 ℃时，超声波提取时间对熊果酸得率的影响见图3，在超声波提取10～30 min内，熊果酸得率呈上升趋势，提取时间达到30 min时，得率达到最大值1.64%；当提取时间超过30 min后，得率开始下降。原因可能为由于超声波提取时间太短，熊果酸不能全部迅速游离到溶剂中，超声波提取时间过长，除熊果酸以外的醇溶性物质充分游离至溶剂中，从而与熊果酸竞争溶剂，使得熊果酸的得率下降，故提取时间以30 min为宜。所以，选取30 min为自变量时间的零水平。

图 3 提取时间对熊果酸得率的影响

Fig.3 Effect of urtrasonic treatment time on the extraction yield of ursolic acid

2.1.4 超声功率对熊果酸得率的影响

在温度50 ℃、乙醇体积分数75%、液料比8∶1、提取时间30 min的条件下，超声功率对熊果酸得率的影响见图4。由图4可知，功率在125～250 W之间，随着超声功率的升高，熊果酸得率呈上升趋势，通过对225 W与250 W功率条件下熊果酸得率的显著性分析，发现得率并无显著的升高，考虑到设备在最大功率下运行对其寿命的影响，故选择225 W作为提取熊果酸的超声功率。以下试验中超声功率均为225 W。

图 4 超声功率对熊果酸得率的影响

Fig.4 Effect of urtrasonic power on the extraction yield of ursolic acid

2.1.5 提取温度对熊果酸得率的影响

在超声功率225 W、乙醇体积分数75%、液料比8∶1、超声时间30 min的条件下，提取温度对熊果酸得率的影响见图5。由图5可知，提取温度在40～60 ℃时，熊果酸得率迅速上升，在60 ℃时达到最大值1.652%，但随着温度的继续升高，熊果酸得率开始下降并最终趋于平衡，这可能是由于在升温和机械波作用下，熊果酸结构遭到破坏，造成得率下降。因此，最佳提取温度应在60 ℃附近，选取60 ℃为自变量温度的零水平。

图 5 提取温度对熊果酸得率的影响

Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction yield of ursolic acid

2.2 响应面试验

2.2.1 模型优选

根据四因素中心组合设计，于中心点重复12次共计30次试验，结果见表2，对该模型进行方差分析，结果见表3。将试验结果输入Design-Expert系统，并寻找合适的回归方程。

表 2 四元二次回归通用旋转组合试验结果

Table 2 Results of four-variable quadratic orthogonal rotation combination design

表 3 回归模型方差分析

Table 3 Analysis of variance for the regression model

注：**.影响极显著，P＜0.01；*.影响显著，P＜0.05。

由表3可知，模型P值小于0.01，表示模型高度显著，而失拟项不显著（P＞0.05），预测值与试验值之间有较好的相关性，决定系数R2=0.9731，因此，采用响应曲面法进行猕猴桃根粉熊果酸的提取试验设计所得回归模型是有效的。X2、X4、X12、X22、X32、X1X2对应的P值小于0.01，说明其对结果影响极显著；交互项X42、X1X4、X3X4对应的P值小于0.05，说明其对结果影响显著；X1、X3、X1X3、X2X3、X2X4对结果影响不显著。

根据庄恒扬等[19]因素重要性分析方法，综合考虑各因子的线性、二次及交互作用三方面的影响，在试验考察范围内，各因素对熊果酸得率的影响为：液料比＞提取温度＞提取时间＞乙醇体积分数。

2.2.2 回归方程的建立与检验

对试验数据用二次多项式拟合后，得到因子编码值回归方程和实际值回归方程为∶

Ý=1.93－0.0005X1－0.11X2＋0.003X3＋0.065X4－0.054X1X2＋0.014X1X3－0.047X1X4＋0.030X2X3－0.028X2X4－0.040X3X4－0.15X12－0.18X22－0.054X32－0.021X42 （1）

Y=1.932－0.0005X1－0.107X2＋0.003X3＋0.065X4－0.054X1X2＋0.014X1X3－0.047X1X4＋0.030X2X3－0.028X2X4－0.038X3X4－0.156X12－0.183X22－0.063X32－0.030X42 （2）

回归方程的拟合程度可通过决定系数R2和R2校正值来验证[20]，此处R2校正值为0.9442，表明在熊果酸超声波提取工艺研究中，大约有94.4%的变异分布在所研究的4个因子当中，另有5.6%的变异不能由该模型来解释。相关系数R=0.9731，表明熊果酸得率的实际值与预测值（表2）之间具有很好的拟合相关性。

2.2.3 响应面分析优化提取条件

图 6 乙醇体积分数和液料比交互影响熊果酸得率的响应曲面及等高线图

Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of solvent-to-solid ratio and ethanol concentration on the extraction yield of ursolic acid

经统计分析，模型总效应F=33.62，P＜0.0001，说明各因素间有交互作用。根据上述回归方程作各因素间交互作用的响应曲面和等高线如图6～8所示。等高线的形状可直观地看出交互效应的大小，椭圆形反映了两因素的交互作用较强，而圆形则相反[21]。

图 7 乙醇体积分数和提取温度交互影响熊果酸得率的
响应曲面及等高线图

Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of extraction temperature and ethanol concentration on the extraction yield of ursolic acid

图 8 提取温度和提取时间交互影响熊果酸得率的响应曲面及等高线图

Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of extraction temperature and extraction time on the extraction yield of ursolic acid

由图6可知，固定超声提取温度和提取时间，熊果酸得率随乙醇体积分数和液料比的增加都呈先增加后减少的趋势。由图7可知，固定液料比和提取时间，熊果酸的得率随提取乙醇体积分数的增大呈先增加后减少的趋势；而当乙醇体积分数在低水平时，得率随提取温度的升高呈增大趋势，当乙醇体积分数在高水平时，得率随提取温度的升高无明显变化。由图8可知，固定液料比和乙醇体积分数，熊果酸的得率随提取时间的延长呈先增加后减少的趋势；而当提取时间在低水平时，得率随提取温度的升高呈逐渐增加趋势，当提取时间在高水平时，得率随提取温度的升高无明显变化。

2.2.4 Design-Expert系统的最优提取条件模拟与检验

通过Design-Expert系统对回归方程求解，得到一组优化方案。在试验的优化水平范围内预测熊果酸提取的最优条件为：乙醇体积分数73.8%、液料比7.80∶1（mL/g）、提取时间23.2 min、提取温度79.1 ℃，此提取条件下，熊果酸得率达到（2.018±0.006）%。在此条件下实验重复3次，得到熊果酸得率的平均值为2.014%，与模型预测值仅相差0.004%，说明模型预测值与实验值吻合，可用于指导实际生产。采用大孔树脂法测定熊果酸含量，得出猕猴桃根提取液中熊果酸的纯度为49.7%。

3 结 论

3.1 利用Design-Expert系统对猕猴桃根熊果酸的超声波提取工艺4个关键参数作了考察，研究表明在试验考察范围内，各因子对熊果酸得率的影响为：液料比＞提取温度＞提取时间＞乙醇体积分数，且这4个因素与熊果酸得率之间的关系更接近于二次多项式模型。

3.2 此模型的预测值与真实值之间的相关性达94.42%，模型能够解释94.4%的总变异，即模型在试验范围内能较准确的预测猕猴桃根熊果酸的得率。

3.3 响应面分析表明猕猴桃根中熊果酸提取的最佳工艺参数为乙醇体积分数73.8%、液料比7.80∶1（mL/g）、提取时间23.2 min、提取温度79.1 ℃，在此条件下熊果酸得率可达2.014%，与模型预测值仅相差0.004%，可用于指导实际生产。在最优提取条件下，参考白新鹏[22]的方法对最优条件下从猕猴桃根中提取的熊果酸进行纯化，采用大孔树脂法测定熊果酸含量，得出猕猴桃根提取液中熊果酸的纯度为49.7%。

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