鸡蛋中亚致死损伤肠炎沙门氏菌的检测增菌液优化

李婉丽1，莫 婕1，蒋梦萍1，胡渝珠1，余 洋1，邓鹜远1,2，刘青成3，孙 群1,*

(1.四川大学生命科学院，四川 成都 610064；2.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川 宜宾 644007；

3.四川省轻工业研究设计院，四川 成都 610081)

摘 要：为评估常规缓冲蛋白胨水(BPW)对蛋清、蛋黄中亚致死损伤肠炎沙门氏菌的增菌能力，用BPW对鸡蛋中低数量或高数量的“健康”或受亚致死损伤的沙门氏菌进行增菌，并对增菌液进行优化。结果表明：BPW对蛋清、蛋黄中低数量肠炎沙门氏菌增菌后，亚致死损伤组在蛋清和蛋黄中的菌浓分别约为5.5×103 CFU/mL和1×108 CFU/mL，前者甚至低于通用检测限(1×105 CFU/mL)。用脱脂牛奶优化BPW后，蛋清中低数量亚致死损伤肠炎沙门氏菌可被增菌至约1×109 CFU/mL，远高于通用检测限，亚致死肠炎沙门氏菌的复活能力也同时得到显著提高(P＜0.05)。因此，BPW不足以克服鸡蛋清的抑制作用从而对亚致死沙门氏菌进行有效富集，但脱脂牛奶粉可作为促进剂添加到增菌液中，以有效提高对亚致死沙门氏菌的富集能力。

关键词：沙门氏菌；亚致死；鸡蛋；增菌

Optimization of Enrichment Medium for Improved Recovery of Sub-lethally Injured Salmonella Enteritidis in Eggs

LI Wan-li1，MO Jie1，JIANG Meng-ping1，HU Yu-zhu1，YU Yang1，DENG Wu-yuan1,2，LIU Qing-cheng3，SUN Qun1,*

(1. College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China；2. College of Life Sciences and Food Engineering,

Yibin College, Yibin 644007, China；3. Sichuan Institute of Light Industry, Chengdu 610081, China)

Abstract：Enrichment efficiency of healthy or sub-lethally injured Salmonella Enteritidis (SE) with low quantity in whole egg, albumen and yolk by standard buffered peptone water (BPW) was evaluated. The results showed that all the healthy groups growing in BPW could result in an SE concentration higher than 1 × 105 CFU/mL after enrichment, while the injured groups were below 1 × 105 CFU/mL. The growth of healthy SE reduced from 1 × 109 CFU/mL in whole egg or yolk to approximately 1 × 105 CFU/mL in albumen, so did injured SE, indicating that the growth of SE was inhibited by albumen. Inefficient growth of SE in albumen could be overcome by adding yolk or whole egg. Even in the presence of albumen, an optimized BPW-based formulation with skim milk (SM) supplementation could promote the growth of injured SE by 5 (lg(CFU/mL)) (P ＜ 0.05), and thus significantly improved the recovery of injured SE during the enrichment step. Hence, our results suggested that BPW could not support satisfactory enrichment of sub-lethally injured SE, and skim milk might serve as an effective supplementation in enrichment medium for the detection of injured Salmonella, in particular at low quantity in egg white products.

Key words：Salmonella；sub-lethal injury；egg；enrichment

中图分类号：S852.61 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0145-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321030

沙门氏菌(Salmonella)是一种全球性的人畜共患的食源性致病菌，全球每年约有1亿人因感染沙门氏菌引起食物中毒[1]。沙门氏菌约2500个血清型，其中鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium，ST)和肠炎沙门氏菌
(Salmonella Enteritidis，SE)对人类健康威胁最大[2]。肠炎沙门氏菌是从鸡蛋中分离出的最常见的菌型[3]，因而鸡蛋和蛋制品是肠炎沙门氏菌最普遍的传播媒介。我国的禽蛋总产量居世界首位，而且鸡蛋在我国食品消费中占有重要地位。因此，准确且灵敏地检测鸡蛋中肠炎沙门氏菌有助于控制沙门氏菌在人类食品安全中构成的潜在威胁。

目前，大多数沙门氏菌快速检测的研究都是使用人工接种的样品，其中沙门氏菌的数量往往较高，检出较容易。但在实际生产和产品中，沙门氏菌感染食品时数量往往是很低的[4]，且由于蛋制品及鸡蛋常在低温保存，其中污染的微生物常常受到亚致死损伤。目前常用的选择性增菌液和选择性培养基中一般含有胆盐、煌绿等选择性成分，这些选择性成分不利于亚致死细胞的生长[5]。另外，鸡蛋清中有溶菌酶、卵转铁蛋白和其他的抑菌物质，也不利于沙门氏菌的生长[6]。因此，低数量、受亚致死损伤和蛋清的抑制作用导致鸡蛋及蛋制品中的沙门氏菌的准确检出成为难题，且目前相关研究报道极少。

虽然目前开发了很多快速检测方法，但是食品中的沙门氏菌数量低且受亚致死损伤，因此增菌步骤仍是不可缺少的。缓冲蛋白胨水(BPW)是最常用的一步增菌液[7]，然而少有研究报道BPW对鸡蛋及其不同组分(蛋清和蛋黄)中低数量亚致死损伤肠炎沙门氏菌的增菌情况。有研究表明，向培养基中添加铁元素[6]，能促进沙门氏菌在蛋清中的生长，而支链氨基酸能提高热亚致死沙门氏菌的复活能力[8]，培养基中添加脱脂牛奶粉能克服巧克力中可可等引起的抑菌作用，且提高冷致死沙门氏菌的复活能力[4]，但少有研究针对检测鸡蛋中亚致死沙门氏菌，而进行增菌液优化。

本研究拟评估BPW对鸡蛋及其不同组分中受亚致死损伤的低数量肠炎沙门氏菌的增菌能力；并对增菌液进行优化，在达到克服鸡蛋清抑菌作用的同时，提高对亚致死肠炎沙门氏菌的增菌能力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis CVCC3377；SE) 动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室；鸡蛋购买于超市，并于4℃保存；缓冲蛋白胨水(BPW)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD)、胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSBYE)和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSAYE) 广东环凯微生物科技有限公司；脱脂牛奶粉(SM) 英国Oxoid公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；TCYQ恒温摇床 苏州培英实验设备有限公司；HH-B11电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对沙门氏菌的增菌及计数

菌株于含有20%甘油的TSBYE中－40℃保存，使用时，菌株于TSBYE中37℃培养24h，保存于4℃以备使用。增菌培养后，用磷酸缓冲液(PBS)进行10倍梯度稀释，取100μL适当浓度的菌悬液，涂平板于XLD上，37℃培养24h后进行菌落计数。

1.3.2 沙门氏菌亚致死处理

菌株于TSBYE中37℃培养24h后，于－20℃存放10d后，分别涂布于选择性培养基XLD和非选择性培养基TSAYE，37℃培养24h后进行菌落计数，亚致死率按以下公式计算[5]。

1.3.3 对鸡蛋中沙门氏菌的增菌及优化

鸡蛋壳用70%的酒精消毒后，对鸡蛋清、鸡蛋黄或整蛋进行充分匀浆，匀浆后分别取25mL于三角瓶中。接种量为1～5CFU/25mL被定义为低数量；5～50CFU/25mL被定义为高数量[4]。低数量或高数量的“健康”或受亚致死损伤的沙门氏菌被接种到鸡蛋清、鸡蛋黄或整蛋后，加入225mL BPW或添加了100g/L SM的BPW(BPW＋SM)中进行增菌。37℃培养24h后，用PBS进行稀释，涂布于XLD上，37℃培养24h后进行菌落计数。对照组接种相同量的无菌蒸馏水；每组实验3个平行，且实验重复3次。

1.4 数据分析

实验数据用SPSS 13.0进行t检验分析。P＜0.05为具有显著性差异；P＜0.01为具有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 蛋清对肠炎沙门氏菌生长的抑制作用

不同字母表示差异极显著(P＜0.01)。

图 1 蛋清对沙门氏菌生长的抑制

Fig.1 Inefficient growth of SE in albumen

由图1可知，接种18CFU/mL健康沙门氏菌分别到蛋清、蛋黄、蛋清与蛋黄匀浆中，用BPW进行增菌，对照中无鸡蛋内容物。37℃培养24h后，沙门氏菌在蛋清、蛋黄、蛋清与蛋黄匀浆中的浓度分别为为9.6×105、3.9×108、3.2×108CFU/mL。因此，结果表明，蛋清对沙门氏菌的生长具有极显著性抑制作用(P＜0.01)，但该抑制作用可被蛋黄克服。

2.2 BPW对鸡蛋中肠炎沙门氏菌的增菌作用

低数量或高数量的“健康”或受亚致死损伤的沙门氏菌被接种到25mL蛋清及蛋黄后，加入225mL BPW进行增菌。表1表明，鸡蛋清中的低数量受亚致死损伤的肠炎沙门氏菌在BPW中增菌后浓度为5.5×103CFU/mL，此浓度低于通用检测限(1×105CFU/mL)[9]；鸡蛋清虽然对低数量健康的沙门氏菌有抑制作用，但高于检测限，且其他实验组的浓度均高于检测限1×105CFU/mL。因此，BPW可对健康沙门氏菌进行有效增菌，但对低数量亚致死沙门氏菌的增菌作用，不足以达到所有检测方法的检测限，有必要开发新增菌液或对BPW进行优化。

表 1 BPW对鸡蛋中健康和亚致死损伤肠炎沙门氏菌的增菌作用

Table 1 Growth of healthy or sub-lethally injured SE in BPW containing albumen or yolk

注：不同字母表示差异显著(P＜0.05)。下同。

2.3 SM对蛋清和蛋黄中肠炎沙门氏菌的增菌优化

用添加了100g/L SM的BPW(BPW＋SM)对鸡蛋中低数量或高数量的健康或受亚致死损伤的沙门氏菌进行增菌后，表2表明，SM克服了蛋清的抑制作用，使蛋清中沙门氏菌的浓度均达到1×108 CFU/mL以上，且与表1结果比较，SM极显著提高了蛋清中肠炎沙门氏菌的增菌效果(P＜0.01)；SM也显著提高了蛋黄中亚致死肠炎沙门氏菌的增菌效果(P＜0.05)。

表 2 BPW＋SM对蛋清和蛋黄中肠炎沙门氏菌的增菌作用

Table 2 Growth of healthy or sub-lethally injured SE in BPW + SM containing albumen or yolk

2.4 SM对整蛋中受亚致死损伤肠炎沙门氏菌的增菌优化

不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

图 2 SM对整蛋中受亚致死损伤肠炎沙门氏菌的增菌优化

Fig.2 Growth of sub-lethally injured SE in BPW + SM containing homogenized egg

用添加了100g/L SM的BPW(BPW＋SM)对蛋清蛋黄匀浆中低数量或高数量的受亚致死损伤的沙门氏菌进行增菌，于37℃培养24h后。由图2可知，尽管蛋黄的存在能克服蛋清的抑制作用，但是SM显著地提高了整蛋中亚致死沙门氏菌的增菌效果(P＜0.05)。

3 讨 论

蛋制品及鸡蛋常在低温贮存，污染的微生物常常受到亚致死损伤，因此由Jasson等[5]建立了实验室亚致死菌的处理方式，且根据亚致死菌在选择性培养基上不生长的性质，建立了亚致死率的计算方法，并被广泛采用。目前，国内外使用的沙门氏菌增菌液中，BPW被广泛地使用于前增菌步骤，选择性培养基RVS被证明是目前最佳选择性培养基[10]，但其中的选择性成分仍然不利于亚致死沙门氏菌的生长或可能延迟“健康”沙门氏菌的生长[11]，因此BPW也被很多快速检测方法使用为检测前的一步增菌[7]。

本研究结果表明，用BPW对鸡蛋清中的沙门氏菌进行增菌时，鸡蛋清有显著地抑制沙门氏菌生长；在鸡蛋清中沙门氏菌的数量为极低且受亚致死损伤情况下，使用BPW进行一步增菌后，沙门氏菌的浓度5.5×103CFU/mL，此浓度不足以达到所有检测方法的检测限。有研究表明，由于鸡蛋清中含有抑菌物质，在低于10℃条件下，沙门氏菌不能生长[12]；而在鸡蛋贮存过程中，由于蛋黄会向蛋清泄露营养物质，使沙门氏菌能生长[13-14]，但Messens[15]、Howard[16]等发现，鸡蛋即使在低温储存过程中，即使没有蛋黄向蛋清泄露营养物质，蛋清中的沙门氏菌也能生长。

有研究表明，SM能克服巧克力中可可引起的抑菌作用，提高低数量亚致死沙门氏菌的生长量[4]。本研究结果表明，在对鸡蛋中沙门氏菌进行增菌时，用SM对BPW进行优化，SM能完全克服蛋清的抑制作用，使鸡蛋清中低数量且受亚致死损伤沙门氏菌增菌后，沙门氏菌的浓度达到约1×109CFU/mL，使生长量提高了约5(lg(CFU/mL))；另外蛋黄中的成分也能克服蛋清的抑制作用，但是当沙门氏菌受亚致死损伤，即使有蛋黄成分，SM也能显著提高沙门氏菌的生长量(P＜0.05)。然而SM能克服蛋清的抑制作用和促进亚致死沙门氏菌的复活的机制有待进一步研究。

综上，BPW对鸡蛋清中沙门氏菌增菌时，蛋清强烈抑制了沙门氏菌的生长，特别是对低数量且受亚致死损伤的沙门氏菌进行一步增菌后，菌浓为5.5×103CFU/mL，不足以达到所有检测方法的检测限；用SM对BPW进行优化后，完全克服蛋清的抑制作用，并提高了蛋黄或整蛋中亚致死沙门氏菌的复活能力。

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