响应面分析法优化微生物溶菌酶微胶囊制备工艺

费国琴，宁喜斌，李晓晖*，宋 娟，李文利

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

摘 要：以海藻酸钠、壳聚糖为壁材，采用响应面法试验对微生物溶菌酶微胶囊制备条件进行优化。选取7种因素进行Plackett-Burman筛选，得出海藻酸钠质量浓度、壳聚糖质量浓度及醋酸质量浓度是影响包埋率的3个主要因素。进一步进行最陡爬坡试验逼近中心区域。最后，通过Box-Behnken试验建立回归方程，获得主因素的最佳水平，即质量浓度分别为：海藻酸钠2.00g/100mL、壳聚糖0.35g/100mL、醋酸0.33g/100mL，预测微生物溶菌酶最高包埋率为94.635%，经实验验证后所得的包埋率为92.10%。

关键词：微胶囊；海藻酸钠；壳聚糖；响应面；微生物溶菌酶

Optimization of Preparation Conditions for Microbial Lysozyme Microcapsule by Response Surface Methodology

FEI Guo-qin, NING Xi-bin, LI Xiao-hui*, SONG Juan, LI Wen-li

(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Abstract: In this work, response surface methodology (RSM) was applied to optimize the conditions for preparing microbial lysozyme microcapsule by using sodium alginate and chitosan as coating materials. First, Plackett-Burman design (PBD) was used to evaluate the effects of seven preparation conditions on the microencapsulation efficiency of microbial lysozyme, and the concentrations of sodium alginate, chitosan and acetic acid were identified as main affecting factors. Then the steepest ascent method was adopted to access the optimal region of the significant factors. At last, the optimal conditions for microcapsule preparation were obtained from the regression equation established using Box-Behnken experimental design as follows: sodium alginate, 2.00 g/100 mL; chitosan, 0.35 g/100 mL; and acetic acid, 0.33 g/100 mL. Under these optimal conditions, the maximum predicted microencapsulation efficiency was 94.635% and the experimentally measured value was 92.10%.

Key words: microcapsule; alginate; chitosan; response surface method; microbial lysozyme

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）04-0011-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201404003

微生物溶菌酶是由微生物分泌产生的，具有溶解细菌细胞壁活性的碱性蛋白质[1]，除了具有蛋清溶菌酶的优点外，其有着更为广泛的抑菌谱及更强的抑菌效果[2-10]，因此正逐步受到研究者的重视，在食品、化工、医疗等领域具有非常广阔的应用前景[11]。目前文献报道较肯定蛋清溶菌酶的热稳定性，据报道[12]，pH3.0时，96 ℃加热处理15 min仍能保持87%的酶活性，然而对于微生物溶菌酶，本实验室先前发现对其湿热90 ℃处理5 min后，酶活只能保留56.2%[13]，此外报道的多数由海洋细菌发酵产生的溶菌酶的作用范围为5～50 ℃[14]，说明微生物溶菌酶的热稳定性较差。为拓宽微生物溶菌酶的应用范围，及避免某些应用方面如饲料加工中高温挤压过程使得酶活损失[15]，以及达到延长微生物溶菌酶的储存稳定期或缓慢释放的目的，将其微胶囊化是一种行之有效的方法。

目前，微胶囊壁材中海藻酸钠和壳聚糖均为来源丰富、天然安全的多糖类物质[16-17]，大量文献[18-20]报道了利用此两者静电络合的协同效应来包埋各类芯材物质。制备海藻酸钠-壳聚糖微胶囊操作简单、成本低廉且条件温和，不需要有机溶剂，尤其适合于有生物活性的蛋白质类药物[21]，因此，是包埋微生物溶菌酶良好的载体。

本实验即以海藻酸钠、壳聚糖作为复合壁材，采用一步法[22]制备微生物溶菌酶微胶囊，在单因素试验基础上，通过响应面法优化最佳制备工艺，得到最大包埋率的条件参数，以提高微生物溶菌酶在应用中的稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海藻酸钠、氯化钙、冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖 潍坊科海甲壳素有限公司；微生物溶菌酶（酶活5000 U/mg） 沈李科贸有限公司；溶菌酶试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

蠕动泵2000A1 上海杰恒有限公司；低速搅拌器GZ120-S 上海垒固有限公司；冷冻干燥机ADL-75F 科林集团；离心机TD5A-WS 金坛市顺华仪器有限公司；THZ-82恒温水浴锅 金坛市精达仪器有限公司；722分光光度计 上海光学仪器进出口有限公司；SE402F电子分析天平 美国奥豪斯公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物溶菌酶微胶囊的制备

将4 mg/mL的微生物溶菌酶溶液与一定质量浓度的海藻酸钠溶液按1∶1（V/V）混合成100mL均匀溶液，通过蠕动泵之末端针孔匀速滴入到一定质量浓度的氯化钙和壳聚糖的混合醋酸溶液中，待全部滴完后继续静置于其中固化，随后用蒸馏水洗涤2次，用纱布沥干，平铺于直径为10 cm的玻璃皿中预冻6h后进行冷冻干燥，将干燥后的微胶囊收集，称质量，4 ℃保存。

1.3.2 微生物溶菌酶的检测

取0.1g冻干微胶囊溶解在含40mL磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.5）溶液的离心管中6h，待溶胀后充分碾碎，于1000r/min离心3 min，将上清液稀释50倍，用溶菌酶试剂盒测酶活。即取0.2mL上述样液加入到2mL溶壁微球菌混浊液中，另设空白管和标准管，37 ℃反应15 min，冰浴终止反应，于波长530nm处以蒸馏水调零，比色，测各管吸光度，按式（1）、（2）计算溶菌酶含量和包埋率。

（1）

（2）

式中：标准管质量浓度为2.5μg/mL，即200U/mL；w为每0.1g冻干微胶囊中溶菌酶含量/μg；m1为每批次冻干微胶囊总质量/g；m2为每批次微胶囊制备前添加的溶菌酶质量/g。

1.3.3 响应面试验设计[23-24]

1.3.3.1 Plackett-Burman试验

一步法制备海藻酸钠-壳聚糖微胶囊工艺中涉及的参数较多，在单因素试验基础上，取N=7的Plackett-Burman试验设计，对海藻酸钠质量浓度、壳聚糖质量浓度、壳聚糖脱乙酰度、壳聚糖相对分子质量、冰醋酸质量浓度、氯化钙质量浓度、固定化时间7个因素进行考察，每个因素分别取高、低2个水平，另设2个空白，以微生物溶菌酶的包埋率为响应值Y，平行试验3次。

1.3.3.2 最陡爬坡试验

响应面拟合方程只有在考察的紧接邻域里才充分近似真实值，故只有在逼近最大包埋率后才能建立有效的响应面拟合方程[25]。根据Plackett-Burman试验结果的因素效应设计最陡爬坡试验，得出响应面试验因素水平的中心点。

1.3.3.3 Box-Behnken试验

采用Box-Behnken的中心组合设计原理，对Plackett-Burman设计筛选出的重要因素和最陡爬坡设计的试验结果得到的中心点，进行三因素三水平的响应面分析试验，共12个析因点和3个区域中心点（零点），每组平行试验3次，获得最优制备工艺。通过Minitab 16.0软件完成本试验设计、数据分析和模型建立。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman法筛选重要因素

取7个因素的高水平及低水平值，以微生物溶菌酶包埋率为响应值Y，试验设计见表1，各水平取值见表2。

表 1 Plackett-Burman试验设计表

Table 1 Experimental design for Plackett-Burman design

表 2 Plackett-Burman试验因素及分析结果

Table 2 Analysis of variance for the experimental results of
Plackett-Burman design

注：**.P＜0.01，差异极显著；*.P＜0.05，差异显著。下同。

由表2可知，海藻酸钠质量浓度、壳聚糖质量浓度、冰醋酸质量浓度此3个因素对包埋率影响显著
（P＜0.05），因此作为重要因素进行进一步优化。其他因素对结果影响不大，在进一步研究中，取脱乙酰度为90%、相对分子质量为5×105的壳聚糖，氯化钙质量浓度取2 g/100 mL，固定化时间取45 min。

2.2 最陡爬坡试验

基于Plackett-Burman试验结果的因素效应设计最陡爬坡试验，得出响应面试验因素水平的中心点。

表 3 最陡爬坡试验设计及结果

Table 3 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

由表3可知，第3组试验微生物溶菌酶的包埋率最大，说明最优点在第3组试验附近，故以试验3的条件为响应面试验因素水平的中心点，即海藻酸钠质量浓度、壳聚糖质量浓度、冰醋酸质量浓度分别为2.1、0.3、0.3 g/100 mL，进行下一步研究。

2.3 应用响应面分析法确定重要因素的最佳水平

表 4 Box-Behnken试验参数水平

Table 4 Factors and levels used in Box-Behnken design

表 5 响应面分析方案及试验结果

Table 5 Experimental design and results for response surface analysis

根据最陡爬坡试验确定的响应面试验因素水平的中心点，进行Box-Behnken试验，因素水平编码如表4所示，试验设计见表5。以微生物溶菌酶包埋率为响应值Y，对表5试验数据进行二次多元回归拟合后，得到预测值Y对编码自变量X1、X2和X3的二次多项回归方程：

Y=93.047－3.219X1＋5.819X2＋5.637X3－5.668X12－8.463X22－12.071X32＋5.285X1X2＋3.973X1X3－5.798X2X3

为检验方程有效性，利用分析软件进一步对其进行分析，其系数显著性结果见表6，方差分析见表7。

表 6 回归系数显著性分析

Table 6 Results of regression analysis

表 7 模型方差分析

Table 7 Analysis of variance for the regression model

由表6中一次项回归系数的绝对值大小可以到各自变量对响应值的影响程度依次为：壳聚糖质量浓度＞醋酸质量浓度＞海藻酸钠质量浓度。海藻酸钠质量浓度和壳聚糖质量浓度、壳聚糖质量浓度和醋酸质量浓度交互显著（P＜0.05），海藻酸钠质量浓度和醋酸质量浓度交互不显著（P＞0.05）。

从表7可知，海藻酸钠质量浓度、壳聚糖质量浓度、醋酸质量浓度的一次项和二次项对微生物溶菌酶微胶囊中的包埋率的影响是极显著的（P＜0.01），表明试验因素对响应值不是简单的线性关系。另外，此模型的P＜0.05，响应面回归模型达到显著水平。模型的调整确定系数R2=0.9244，表明92.44%的数据可以由这个方程解释。失拟项P=0.116（P＞0.05），表明该模型稳定性好。因此，该二次方程能够较好地拟合真实的响应面，来预测微生物溶菌酶微胶囊的包埋率的变化。

2.4 响应曲面及等高线分析

将表5的试验结果经分析软件处理，绘制其响应面曲线及等值线图，由图1可以看出，当醋酸质量浓度在0.3 g/100 mL不变时，海藻酸钠质量浓度在1.5～2.7 g/100 mL之间，微胶囊的包埋率呈现先升高后降低趋势，海藻酸钠质量浓度和壳聚糖质量浓度两者交互显著。

图 1 包埋率与海藻酸钠质量浓度、壳聚糖质量浓度的曲面图与等值线图

Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of alginate and chitosan concentration on microencapsulation efficiency

图2 包埋率与海藻酸钠质量浓度、醋酸质量浓度的曲面图与等值线图

Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of alginate and acetic acid concentration on microencapsulation efficiency

由图2可以看出，当壳聚糖质量浓度保持在0.3 g/100 mL时，醋酸质量浓度在0.1～0.5 mg/100 mL间，微胶囊包埋率先上升后下降。海藻酸钠质量浓度和醋酸质量浓度交互不显著。

图 3 包埋率与壳聚糖质量浓度、醋酸质量浓度的曲面图与等值线图

Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of chitosan and acetic acid concentration on microencapsulation efficiency

由图3可知，当海藻酸钠质量浓度保持在2.1 g/100 mL时，壳聚糖在0.1～0.5 g/100 mL间，微胶囊包埋率先上升后下降。壳聚糖质量浓度和醋酸质量浓度交互显著。

2.5 验证实验

为了进一步确证计算机模拟得到最佳点的值，对所得的回归方程取一阶偏导等于零并整理得：

联立求解，得X1=－0.110，X2=0.257，X3=0.154。代入回归方程得Y=94.635%。又由各因素编码与其真实值之问的关系，可求得当包埋率为94.635%时，海藻酸钠、壳聚糖、醋酸的真实质量浓度分别为2.034、0.3514、0.3308 g/100 mL。

为了对预测的结果进行验证，用以上得到的最优条件进行3次平行实验，结果见表8。

表 8 试验结果的验证

Table 8 Validation of the optimized conditions

为方便操作，分别取海藻酸钠、壳聚糖、醋酸质量浓度为2.00、0.35、0.33 g/100 mL进行验证，所得包埋率测量值为92.10%，与理论值接近，可见该模型可以较好的预测实际包埋情况。

3 结 论

实验首先通过Plackett-Burman设计确定出影响微生物溶菌酶微胶囊包埋率的主要工艺参数，即海藻酸钠质量浓度、壳聚糖质量浓度及醋酸质量浓度，再通过最陡爬坡试验和响应面分析法对此三因素三水平得出的试验数据进行分析，建立响应面的二次回归拟合方程，得出最大响应值及对应的自变量编码值，即得到海藻酸钠、壳聚糖、醋酸的最优质量浓度分别为2.0340、0.3514、0.3308 g/100 mL，包埋率为94.635%。为方便操作，质量浓度分别取海藻酸钠2.00 g/100 mL、壳聚糖0.35 g/100 mL、醋酸0.33 g/100 mL，进行3次验证实验，结果得出实际包埋率为92.10%，与理论预测值基本吻合。经过优化后，微生物溶菌酶包埋率有一定提高，在实际应用中具有一定的指导意义。

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