超高压液相色谱-高分辨质谱快速筛查和确证
食用贝类中多种原多甲藻酸贝类毒素

韩 深,刘 鑫,李建辉,王珮玥,古 瑾,张朝晖*

(北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心,北京 100026)

 

摘 要:建立超高压液相色谱-高分辨质谱快速筛查和确证贻贝、牡蛎、蚌类、扇贝等食用贝类及其制品中3种天然形式的原多甲藻酸贝类毒素的检测方法。样品中的原多甲藻酸采用乙腈-水体系均质提取,应用改进型QuEChERS技术净化,在乙腈-水(含5mmol/L醋酸铵和0.1%甲酸)体系经Acquity HSS T3柱(150mm×2.1mm,1.8µm)梯度洗脱,实现了3种原多甲藻酸贝类毒素的基线分离。该方法基于电喷雾正离子模式,采用高分辨质谱一级全扫描和数据依赖扫描,对食用贝类及其制品样品中的原多甲藻酸贝类毒素进行检测。3种贝类毒素的定量限均为
10µg/kg(RSN>10);在10~500µg/L范围内线性关系良好,相关系数(R2)均大于0.99。应用该方法对国内外多个地区的贝类产品进行了筛查及确证,其中部分样品检出原多甲藻酸贝类毒素。该方法灵敏度高,重复性好,操作简便、快捷,适用于食用贝类及其制品中多种原多甲藻酸贝类毒素的筛查分析。

关键词:原多甲藻酸贝类毒素;超高压液相色谱-高分辨质谱;QuEChERS

 

Rapid Profiling and Confirmation of Azaspiracids in Edible Shellfishes by Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

 

HAN Shen, LIU Xin, LI Jian-hui, WANG Pei-yue, GU Jin, ZHANG Zhao-hui*

(Testing Center, Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China)

 

Abstract: An ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometric method (UHPLC-LTQ/Orbitrap) was developed for the rapid profiling and confirmation of 3 natural azaspiracids (AZAs) (AZA-1, AZA-2 and AZA-3) in edible shellfishes including mussels, oysters, clams and scallops as well as related products. Samples were homogeneously extracted with acetonitrile-water. The diluted supernatants were then purified with a modified QuEChERS method. The separation was performed on an Acquity HSS T3 column (150 mm × 2.1 mm, 1.8 µm) by gradient elution with acetonitrile in water containing 5 mmol/L ammonium acetate and 0.1% formic acid. The high-resolution mass spectrometry was carried out by means of electrospray ionization in positive ion mode (ESI+). The AZAs were detected by high-resolution MS under full scan and data-dependent scan modes, respectively. The limits of quantification (LOQ, RSN > 10) were 10 µg/kg for all the 3 AZAs. The calibration curves showed good linearity within the concentration range of 10 µg/L to 500 µg/L with correlation coefficients (R2) more than 0.99. Shellfish samples from home and abroad were profiled and confirmed by the established method. AZAs were found in some samples. Therefore this method is easy, sensitive, reproducible and efficient, and can be applied to profile and confirm AZAs in edible shellfishes and related products.

Key words: azaspiracids shellfish toxins; high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry; QuEChERS

中图分类号:O657.6 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)04-0116-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201404024

自20世纪末期,随着全球工业化进程飞速发展,海洋环境遭受严重污染,其中由有毒赤潮产生的藻毒素成为污染海水养殖环境的新要素,严重威胁到水产品食用安全[1]。原多甲藻酸贝类毒素(azaspiracids shellfish toxins,AZAs)是近年来先于欧洲发现的一类新型聚醚类生物毒素[2],1995年在爱尔兰Killary海湾的紫贻贝中首次被检测到,它是一种具有6,5,6-三螺环和环胺结构的亲脂性聚醚类海洋生物毒素[3-4],结构式见表1。

目前已确定化学结构的原多甲藻酸贝类毒素已有
11种,其中属AZA-1、AZA-2及AZA-3是最常见且毒性最大的3种[3,5]。AZAs主要引起人体胃肠道紊乱,通常在进食12~24h后发作,此外,AZAs还能导致多种器官损伤,且这类毒素相对比较稳定,在酸性、碱性和高温条件都不能使其毒性降低[6]。据估算,当摄入AZA-1剂量为23 µg/人和86 µg/人时,致毒概率分别为5%和95%,对人的平均致毒剂量为51.7 µg/人[7]。2004年,由联合国粮农组织、世界卫生组织和政府间海洋委员会共同组建了服务于渔业和水产品法典委员会的双壳软体生物毒素工作组,将原多甲藻酸归为八大类贝类生物毒素之一[8]。鉴于原多甲藻酸贝类毒素的危害性,欧盟立法机构确立双壳软体动物中AZAs的最大允许限量是160 µg/kg[9]。

目前报道的原多甲藻酸的检测方法主要包括:生物测试法、液相色谱-质谱联用法等。采用生物法进行检测,往往会产生假阴性结果而造成实验结果不准确[10]。液相色谱技术是分析生物毒素的一类高效的手段,但由于AZAs毒素在波长大于210nm的范围缺少特征吸收峰,因此目前还未见相关采用液相色谱分析AZAs的报道。随着液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技术的发展和不断完善,人们逐渐尝试建立了一些LC-MS分析方法来测定这类毒素[11-l6],由于贝类海产品及其制品基质较为复杂,采用单级质谱测定的结果可能会产生假阳性。线性离子阱-静电场轨道阱高分辨质谱由于具有质量分辨率高和精确分子质量的功能,最近成为人们研究和应用的新热点。该方法在全扫描模式下采集的数据可以根据检测需求反复调用,因此其可以弥补传统低分辨质谱方法无法应对法规更新频繁的不足;其数据依赖性扫描可以在筛查的同时,通过碎片离子进行定性确证。

本实验基于QuEChERS前处理技术,运用超高效液相色谱和高分辨率质谱联用技术,对贻贝、牡蛎、蚌类、扇贝等食用贝类及其制品中3种天然形式的原多甲藻酸贝类毒素进行分析测定。相比低分辨率质谱,运用高分辨质谱一级全扫描和数据依赖扫描进行检测分析,在很大程度上降低了出现假阳性结果的可能性,使检测更加准确。同时,采用超高压液相色谱系统进行分离,不但节省试剂消耗,更提高了分析效率,3个毒素化合物在10min内可完成分析,较好地实现了对贻贝、蚌类等的可食用贝类及其制品基体中3种AZAs贝类毒素的分析与测定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

贻贝、牡蛎、象拔蚌和扇贝4种食用贝类及其制品 市售。

3种原多甲藻酸标准品AZA-1、AZA-2和AZA-3(纯度均99.0%) 美国Supelco公司(表1);乙腈、乙酸铵、甲醇、乙酸乙酯(均为色谱纯) 美国Fisher公司;甲酸(色谱纯) 美国Tedia公司;无水硫酸镁、氯化钠(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;C18基质固相分散萃取分散剂 美国Agilent公司;微纤维滤纸 美国Vicam公司;微孔滤膜(0.2 µm) 美国Whatman公司;超纯水(电阻率为18.2MΩ)经Milli-Q净化系统过滤。用甲醇配制3种原多甲藻酸贝类毒素的标准储备液,于-20 ℃条件下保存,保存期为6个月;配制标准工作曲线时,根据要求将储备液稀释成不同质量浓度,于-20 ℃条件下保存,工作曲线现用现配。

Orbitrap超高压液相色谱-高分辨质谱联用仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;高速均质机 美国Waring公司;离心机 美国Sigma公司;漩涡混匀器 德国IKA公司;旋转蒸发仪 日本Eyela公司;Milli-Q超纯水装置 美国Millipore公司。

表 1 3种原多甲藻酸贝类毒素标准对照品信息

Table 1 Information about 3 azaspiracid standards

化合物名称及

(CAS编号)

分子式

相对分

子质量

结构式

原多甲藻酸-1

(214899-21-5)

C47H71NO12

841.4971

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原多甲藻酸-2

(265996-92-7)

C48H73NO12

855.5127

516579.jpg 

原多甲藻酸-3

(265996-93-8)

C46H69NO12

827.4814

516596.jpg 

 

 

1.2 方法

1.2.1 色谱-质谱条件

1.2.1.1 色谱条件

色谱柱:Acquity HSS T3柱(2.1mm×150mm,1.8 µm);流动相:乙腈(A)和水溶液(含5 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸)(B);流速:250 µL/min;进样量:10 µL;柱温:30 ℃。梯度洗脱程序:0~1 min,20%~50% A;1~6 min,50%~90% A;6~7 min,90% A;7~7.5 min,90%~20% A。

1.2.1.2 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(electrospray ion source,ESI);扫描方式:正离子扫描;鞘气流量:35arb;辅助气流量:6arb;喷雾电压:4.8kV;毛细管温度:350 ℃;毛细管电压:30V;透镜电压:55V;分辨率:60000;HCD相对碰撞能量:23%;鞘气、辅助气、C-trap碰撞气类型:氮气。

1.2.2 样品前处理

由于AZAs在贝类的肌肉和内脏等组织中的富集程度各不相同,如AZA-1主要分布于消化腺,而AZA-3则主要分布于消化腺以外的其他组织[3],因此在取样时,应取除外壳的整个部分(包含肌肉和内脏)作为试样,以确保样品的均一性和代表性。

1.2.2.1 试样制备

用尖锐物品将试样去壳,将沙土及其他固体颗粒用清水冲洗去掉,沥干后称取200g洗净的样品,置于洁净的密封袋中,放入-20 ℃的冰箱中保存,避免试样间的交叉污染。

可直接食用的样品直接称取即可。

1.2.2.2 提取和净化

准确称取制备好的试样10g(精确至0.01g)于均质杯中,分别加入25 mL 85%乙腈-水提取液,5g无水硫酸镁和2g氯化钠,在20 000 r/min条件下均质60s,用微纤维滤纸过滤,取10 mL滤液至离心管中,加入0.5g C18基质固相分散萃取净化剂和1g无水硫酸镁,旋涡振荡1 min,
7000 r/min离心5 min,取5 mL清液移至锥形瓶中,40 ℃条件下旋转蒸发至近干,以0.8 mL乙腈和0.2 mL水溶解,旋涡振荡30s,过0.2μm微孔滤膜,待仪器分析测定。

1.2.3 空白实验及回收率实验

选用不含上述3种原多甲藻酸贝类毒素的扇贝样品,分别添加3个水平(50、75 µg/kg和100 µg/kg)的原多甲藻酸标准物质,按上述步骤进行实验,计算回收率结果。

选取纯水代替试样,按照上述步骤进行空白实验。

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

经查阅相关文献,原多甲藻酸贝类毒素是一类脂溶性聚醚化合物,易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂,实验分别考察乙酸乙酯、甲醇、乙腈3种提取液的提取效率,结果表明,乙腈的提取效率相比较好。但由于贝肉中富含大量的蛋白质、氨基酸等杂质,使用100%乙腈进行提取时,会增加粗提液中干扰杂质的比例,给净化步骤增加难度,因此,实验还比较了85%乙腈-水体系的提取效果,结果表明,85%的乙腈-水体系的提取效果与乙腈体系相当,但更有利于净化,见表2。

表 2 加标量均为100μg/kg的牡蛎样品在不同提取条件下3种AZAs的检测结果(n=6)

Table 2 Recovery of 3 AZAs extracted from oyster samples spiked at
100 μg/kg by different methods under different conditions (n=6)

μg/kg

化合物

提取溶液

 

提取方法

 

提取时间/s

 

提取温度/℃

乙酸乙酯

甲醇

乙腈

乙腈-水

 

振荡

超声

均质

 

20

60

120

 

室温

40

70

AZA-1

68.9

71.3

82.5

82.2

 

55.3

78.0

90.5

 

56.7

83.4

84.5

 

78.1

83.2

78.1

AZA-2

70.9

69.8

81.2

85.4

 

53.2

77.1

82.3

 

55.4

82.1

80.8

 

75.1

85.6

83.1

AZA-3

56.7

62.3

77.4

78.9

 

45.9

65.5

80.6

 

54.6

88.2

88.1

 

74.2

80.7

79.3

 

 

常见的样品提取方式主要有振荡提取、均质提取、超声提取等,实验分别考察不同提取方式对提取的影响,且在同一条件下,还考察了提取时间和温度的影响,结果表明,均质提取的效果较好,延长提取时间在一定程度上能够帮助提高提取效率,提取温度对效率的影响不显著,见表2。

通过正交试验最终确定了前处理条件,室温条件下,以乙腈-水溶液作为提取液,采用高速均质仪器将样品均质60s,待净化。

2.2 分散剂和盐的用量对提取效率的影响

QuEChERS净化技术是一种通用性强、快速且简便的前处理方法,近几年来被广泛应用于农药残留、兽药残留、毒素等检测中[17-22],本实验以贝类样品的基质特点为基础,参照QuEChERS的基本原理进行了改进,并得到了较为满意的结果。

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AZA-1加入量100 µg/kg。

图 1 MgSO4加入量(A)和NaCl加入量(B)对4种贝类产品基质中AZA-1提取效率的影响

Fig.1 Effects of the amounts of added MgSO4 and NaCl on extraction efficiency of AZA-1 in 4 shellfish matrixes spiked at 100 µg/kg

为了帮助提高提取效率,实验加入了无水硫酸镁和氯化钠。无水硫酸镁能够帮助目标化合物在提取溶液中更好的分散,使提取更加容易;氯化钠则能够使溶液体系中的水趋于相饱和,促使目标化合物分散至有机相并有助于水和乙腈相分层,从而提高提取效率[23-27]。实验分别考察了无水硫酸镁和氯化钠的加入量对提取效率的影响,结果表明,5g无水硫酸镁和2g氯化钠的加入即能够获得较好地提取效率,见图1。

2.3 净化方式的选择

本实验采用了基质固相分散萃取技术进行净化处理,分析比较Florisil、C18、N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)、石墨化碳黑(graphitized carbon blacks,GCB)等几种常用净化剂的净化效果[28-34],Florisil作为强极性吸附剂,无法去除提取液中的脂类杂质,AZAs的回收率偏低;GCB通常用于去除色素成分,因其可吸附较强的带苯环官能团的化合物[35],且AZAs的结构中含有大量苯环,因此3种AZAs的回收率小于40%;PSA能有效去除基质中的脂肪酸和甾醇类基质,但考虑到PSA作为碱性吸附填料对酸性化合物有较强吸附作用,AZAs恰好属于酸性化合物,因此吸附较为牢固,若要使用该类型的净化剂,提取时需添加一定的酸以减少损失[36];C18可有效去除脂类、糖类等亲脂型杂质,对AZAs这类化合物的适用性较好,但过量的C18也会吸附目标化合物而使回收率降低,因此,需要对C18净化剂的使用量进行优化。几种净化剂各有特点,需要在检测灵敏度、最佳净化效果和合理回收率之间寻求平衡点。因此,实验通过优化最终确定了使用C18净化剂(按照实验确定的最终前处理步骤,每20g样品加入1g净化剂),并配以1g无水硫酸镁可以达到较好的净化效果。

2.4 色谱条件的优化

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图 2 3种AZAs的参考色谱图

Fig.2 Chromatograms of three AZAs standards

为了获得目标化合物最好的色谱分析效果,考察了乙腈-水和甲醇-水两种混合溶剂体系作为流动相时目标化合物的色谱行为。结果表明,使用甲醇-水体系作为流动相时,85%以上比例的甲醇才可将目标化合物洗脱下来,当甲醇比例达到90%时,3种原多甲藻酸贝类毒素就无法实现基线分离了,由于乙腈的洗脱能力较强,当采用乙腈-水体系作为流动相时,3种AZAs在7 min内可实现基线分离,见图2。

2.5 质谱条件的确定

根据欧盟2002/657/EC指令,采用三重四极杆质谱仪的SRM模式对目标化合物进行确证需要至少两个碎片离子,质谱仪属于高分辨质谱仪,因此,仅需要一个高分辨母离子和一个高分辨子离子就可以满足对目标化合物的确证要求。在本研究中,将全扫描模式的母离子作为定量离子,将峰丰度最高的HCD数据依赖性扫描碎片离子作为定性离子,并与理论值进行了对照,见表3。

本研究采用电喷雾离子源正离子模式,通过总离子流扫描可以看出,3种原多甲藻酸贝类毒素形成的准分子离子峰中[M+H]+峰丰度最高。采用HCD数据依赖性扫描得到多个碎片离子,形成的碎片离子中[M+H-H2O]+的响应最高,因此选作为定性离子,见图3。

表 3 AZA-1、AZA-2和AZA-3的质谱分析参数

Table 3 UPLC-MS/MS parameters of AZAs-1, 2 and 3

化合物

[M+H]+

理论值(m/z)

[M+H-H2O]+

碰撞

能量/V

理论值(m/z)

实测值(m/z)

误差(×10-6

AZA-1

842.5049

824.49434

824.49295

 

-1.68

35

AZA-2

856.5206

838.50999

838.50825

 

-2.08

28

AZA-3

828.4893

810.47869

810.47705

 

-2.02

40

 

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516723.jpg 

A. AZA-1,[M+H-H2O]+,m/z=824.492 95;B. AZA-2,[M+H-H2O]+,m/z=838.508 25;C. AZA-3,[M+H-H2O]+,m/z=810.477 05。

图 3 扇贝样品中添加水平为10 µg/kg的3种AZAs参考二级质谱图

Fig.3 MS2 fragmentation of 3 AZAs in scallops at spiked level of 10 µg/kg

2.6 线性范围、测定低限

3种原多甲藻酸贝类毒素采用基质曲线-外标法进行定量。用空白样品提取液配制质量浓度为10~500μg/L的混合标准溶液,以质量浓度为横坐标(x,µg/kg)和定量离子对峰面积为纵坐标(y)进行线性回归计算,所得相关系数(R2)均大于0.99。根据10倍信噪比(RSN)确定化合物定量限(LOQ)。样品中3种原多甲藻酸贝类毒素的LOQs均为10 µg/kg,表4列出了线性范围、回归方程、相关系数和LOQs。

表 4 扇贝中AZAs的线性范围、回归方程、相关系数和LOQs

Table 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients and LOQs for 3 AZAs spiked in scallops

化合物

线性范围/(µg/L)

线性方程

相关系数(R2)

LOQ/(µg/kg)

AZA-1

10~500

Y=8833x-44259

0.995

10.0

AZA-2

10~500

Y=62729x-12173

0.996

10.0

AZA-3

10~500

Y=8787x-39148

0.996

10.0

 

 

2.7 精密度和回收率

经查阅,欧盟确立双壳软体动物中AZAs的最大允许限量为160 µg/kg[9],实验选用不含上述3种毒素的贝类产品及其制品为空白样品,分3个水平进行添加回收实验,每个添加水平进行6次重复实验,分析并测定其精密度及回收率。3种AZAs在3个水平的添加回收率范围均在76%~103%之间,相对标准偏差小于10%(n=6),满足分析的要求,见表5。

表 5 混合贝类样品基质中3种AZAs的回收率和精密度(n=6)

Table 5 Recovery ranges and precision of 3 AZAs in mixed
shellfish matrixes (n = 6)

化合物名称

加标量/(µg/kg)

回收率/%

相对标准偏差/%

AZA-1

50、75、100

77~103

7.27

AZA-2

50、75、100

81~102

8.06

AZA-3

50、75、100

76~95

6.49

 

 

2.8 实际样品测定

表 6 17份样品测定结果

Table 6 Results obtained by the established method for the determination of AZAs in 17 samples

μg/kg

样品名称

AZA-1

AZA-2

AZA-3

扇贝-1

11.2

<10.0

<10.0

扇贝-2

<10.0

<10.0

<10.0

扇贝-3

<10.0

<10.0

<10.0

贻贝-1

<10.0

<10.0

<10.0

贻贝-2

<10.0

<10.0

<10.0

贻贝-3(进口)

<10.0

<10.0

<10.0

牡蛎-1

<10.0

<10.0

<10.0

牡蛎-2

<10.0

<10.0

<10.0

牡蛎-3(进口)

15.2

<10.0

<10.0

象拔蚌-1(进口)

<10.0

<10.0

<10.0

象拔蚌-2(进口)

<10.0

<10.0

<10.0

象拔蚌-3(进口)

<10.0

<10.0

<10.0

贻贝罐头制品

<10.0

<10.0

<10.0

牡蛎罐头

<10.0

<10.0

<10.0

干制扇贝-1

<10.0

<10.0

<10.0

干制扇贝-2

18.3

10.5

<10.0

干制扇贝-3

<10.0

<10.0

<10.0

添加50 µg/kg回收率

78%~101%

添加100 µg/kg回收率

85%~97%

 

 

采用研究建立的方法对共17份市售和进口贝类产品及其制品进行了测定,其中3份样品检出了AZAs,其中有一份样本同时检出了AZA-1和AZA-2,另外两份只检出AZA-1,但均未超过欧盟制定的安全限量标准,见表6。

3 结 论

研究结果表明,通过改进QuEChERS技术和基质分散固相萃取净化技术可有效去除基质中的各类杂质,消除干扰,采用超高压液相色谱-高分辨质谱测定贻贝、牡蛎、蚌类、扇贝等食用贝类及其制品中3种原多甲藻酸贝类毒素具有快速、准确、灵敏度高、重复性好、操作简便等特点,本方法的测定低限能够满足国际上对该类项目的限量要求,适用于分析和测定食用贝类及其制品中原多甲藻酸类贝类毒素。

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收稿日期:2013-03-25

基金项目:国家质检总局科技计划项目(2011IK193;2012IK145);国家质检总局质检行业公益性科研专项(201210029)

作者简介:韩深(1981—),男,工程师,本科,研究方向为食品安全检测。E-mail:hansh@bjciq.gov.cn

*通信作者:张朝晖(1968—),男,高级工程师,博士,研究方向为食品安全检测。E-mail:zhangzhh@bjciq.gov.cn