响应面优化超声波-微波协同提取
高粱醇溶蛋白工艺

刘振春，耿存花，孙慧娟，韩 宇

（吉林农业大学食品与科学工程学院，吉林 长春 130118）

摘 要：以高粱种子为原料，采用超声波-微波协同辅助提取高粱醇溶蛋白。在单因素试验结果的基础上利用响应面法优化高粱醇溶蛋白提取工艺，建立提取工艺回归数学模型。结果表明：最佳提取工艺条件为超声时间26min、液料比10∶1（mL/g）、微波时间260s，在该条件下高粱醇溶蛋白的得率为6.79%，与理论得率接近，可为实际生产提供理论依据。

关键词：高粱醇溶蛋白；超声波-微波辅助；响应面法

Optimization of Ultrasonic/Microwave-Assisted Extraction of Kafirin from Sorghum Corn Flour by
Response Surface Methodology

LIU Zhen-chun, GENG Cun-hua, SUN Hui-juan, HAN Yu

(College of Food Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Abstract: In this study, a high-yield method for the extraction of kafirin from sorghum corn flour was developed by using an integrated ultrasonic and microwave reaction system. On the basis of single-factor experiments, the response surface methodology was used to optimize the extraction process. The results indicated that the optimum conditions for extraction were as follows: ultrasonication for 26 min and subsequent microwave treatment for 260 s at a solvent-to-solid ratio of 10:1 (mL/g). Under these conditions, the extraction yield of kafirin was experimentally observed to be 6.79%, which was close to the theoretically predicted value. This study can provide theoretical evidence for practical production.

Key words: kafirin; ultrasonic/microwave-assisted extraction; response surface methodology

中图分类号：TS210.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）04-0021-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201404005

高粱（Sorghum bicolor（L.） Moench）是世界主要的粮食作物之一，我国的高粱产量世界排名第二[1]。它营养丰富，是我国的传统食物。据国外研究报道，高粱会给人们带来新的健康理念，由于生长在干旱气候条件下，其含有较多的二十烷醇的多酚复合物和高抗氧化水平的高粱蜡，对健康有独特的益处，尤其对保护心血管的健康至关重要。高粱还含有较多的原花青素[2]，它是一类由黄酮类物质衍生的多酚物质[3]，而谷物里面的多酚物质一直被人们认为是营养的限制性因子[4]。因此高粱这种古老的作物作为21世纪的主要谷物作物引发了人们新的兴趣[5]。高粱种子约含有6%～18%的蛋白质[6]，其中醇溶蛋白是高粱蛋白的主要贮存形式[7]，约占高粱总蛋白质的70%～90%[8]。根据分子质量、氨基酸序列及免疫学的不同又把醇溶蛋白分为3种：α-、β-、γ-醇溶蛋白[9]。醇溶蛋白具有独特的耐热性、成膜性以及抗氧化性，有防潮、阻气、保鲜、抑菌等作用[10]，是比较理想的天然保鲜剂[11-12]。迄今为止，在醇溶蛋白膜研究和开发[13-14]上已投入了大量资源。但它在食品行业中的应用仍相当有限，因此具有广阔的开发前景[15]。

醇溶蛋白的提取主要用乙醇、叔丁醇、异丙醇等有机溶剂提取法[16-17]。也有研究用超临界CO2萃取技术[18]先去除原料中的脂质、色素等杂质。有研究者[19]用86%的异丙醇作为溶剂提取醇溶蛋白，该方法产率高，但是产品有异味，不利于应用于食品加工中[20]，本实验利用乙醇溶液作为提取剂。除此以外，使用超声波或者微波辅助溶剂提取可有效提高醇溶蛋白的得率[21-22]。由于提取醇溶蛋白需要消耗大量的提取剂，生产成本较高，急需优化高粱醇溶蛋白的提取工艺，提高其得率，降低生产成本。本研究采用超声波-微波协同技术提取高粱醇溶蛋白，旨在减少溶剂用量，提高生产效率，为高粱的综合利用和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱 长春市售。

无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、DTT（均为分析纯） 北京化工厂。

1.2 仪器与设备

FDV超微粉粹机 日本佑崎有限公司；微型植物试样粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；微波炉 美的公司；JY99-2D超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；KDN-消化炉、KDN-08定氮仪 北京通润源机电技术有限责任公司；LXJ-ⅡB离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 提取工艺流程

高粱→粉碎过筛→无水乙醇脱色→离心分离→收集滤饼→75%乙醇→调pH10.0→超声波处理→微波处理→离心（4000 r/min，5 min）→取上清液→冷水稀释乙醇体积分数至40%→调pH 6.0→静置24h→洗涤沉淀→热风干燥→粉碎→高粱醇溶蛋白

1.3.2 蛋白质测定

采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法，蛋白质系数为6.25。

1.3.3 高粱醇溶蛋白的鉴定和得率的计算

用紫外分光光度计测成品与高粱醇溶蛋白标准品的紫外吸收图谱，最大吸收波长为278 nm，并与标准比较，判断提取物是否为醇溶蛋白[23]。

1.3.4 单因素试验

称取5.0g粉碎所得到的高粱粉末进行实验，分别研究不同的超声功率、超声处理时间、液料比、微波功率、微波处理时间对高粱醇溶蛋白得率的影响。提取的基本条件是：pH10.0二硫苏糖醇用量1%[24]、75%的乙醇溶液作为提取剂、液料比9∶1（mL/g）、超声功率480 W、超声温度控制在50℃以内、超声处理时间25 min、微波功率450 W、微波处理次数5次（每次45s，2次处理间隔时间需样液冷却为止）。各因素水平为：超声功率300、360、420、480、540 W；超声时间15、20、25、30、35 min；液料比8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1（mL/g）；微波功率270、360、450、540、630 W；微波处理时间45、135、225、315、405s。

1.3.5 响应面优化试验方案

采用响应面法进行试验数据处理，选用Box -Behnken模型对影响超声-微波协同技术提取高粱醇溶蛋白得率的因素进行响应面设计，以高粱醇溶蛋白得率为响应值进行优化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声功率对高粱醇溶蛋白得率的影响

图 1 超声功率对高粱醇溶蛋白得率的影响

Fig.1 Effect of ultrasonic power on kafirin yield

由图1可见，超声功率对高粱醇溶蛋白得率影响较小，醇溶蛋白得率随超声功率的增加而增加，但是当功率超过420 W后，醇溶蛋白得率略有下降，所以选择超声功率420 W提取高粱醇溶蛋白。根据SAS 8.2数据分析软件处理知，P＞0.05，说明超声功率对高粱醇溶蛋白得率影响不显著。

2.1.2 超声时间对高粱醇溶蛋白得率的影响。

图 2 超声时间对高粱醇溶蛋白得率的影响

Fig.2 Effect of extraction time on kafirin yield

由图2可知，超声时间对醇溶蛋白得率产生了比较明显的影响，随着时间的延长，高粱醇溶蛋白的得率不断增加，当超声时间为25 min时，得率最高，超过25 min后，得率下降，故选用超声时间为25 min。由SAS 8.2数据分析软件分析，P＜0.05，说明超声时间对高粱醇溶蛋白得率影响高度显著。

2.1.3 液料比对高粱醇溶蛋白得率的影响

由图3可知，在试验选取的液料比范围内，提取液用量少时得率较小，随着提取液用量的增加，得率呈逐渐上升的趋势，但当液料比到10∶1（mL/g）后，得率增势平缓，从节约成本的角度考虑，选择液料比为10∶1（mL/g），这与Watterson等[25]结果相同。根据SAS 8.2软件分析，
P＜0.05，液料比对高粱醇溶蛋白得率有显著性的影响。

图 3 液料比对高粱醇溶蛋白得率的影响

Fig.3 Effect of solvent-to-material ratio on kafirin yield

2.1.4 微波功率对高粱醇溶蛋白得率的影响

图 4 微波功率对高粱醇溶蛋白得率的影响

Fig.4 Effect of microwave power on kafirin yield

由图4可知，当微波功率为450 W时，得率最大，超过450 W，可能由于强烈的热效应使有效成分遭到破坏，导致得率降低，因此，选取微波功率为450 W。根据SAS 8.2数据分析软件处理知，P＞0.05，说明微波功率对高粱醇溶蛋白得率影响不显著。

2.1.5 微波处理时间对高粱醇溶蛋白得率的影响

图 5 微波处理时间对高粱醇溶蛋白得率的影响

Fig.5 Effect of microwave treatment time on kafirin yield

由图5可以看出，在微波处理时间为45～225s范围内时，由于细胞壁破裂程度不断增加，225s时，细胞破裂程度达到最大，从而使高粱醇溶蛋白得率缓慢上升，在225s以后，高粱细胞壁基本破壁完全，同时由于持续的加热破坏了高粱醇溶蛋白成分，而使得率下降，所以选微波时间为225s（即微波处理5次，每次45s）。由SAS 8.2数据分析软件分析，P＜0.01，说明微波时间对高粱醇溶蛋白得率影响高度显著。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果与分析

综合单因素试验结果，选超声时间、液料比、微波时间3个因素，在单因素试验基础上采用三因素三水平利用Design-Expert 7.0软件按照Box-Behnken原理进行响应面设计，根据试验设计确定的试验方案对高粱醇溶蛋白提取进行优化，试验方案及结果见表1。

表 1 Box-Behnken试验设计及结果

Table 1 Scheme and results of Box-Behnken design

2.2.2 回归方程的建立与检验

根据表1，利用Design Expert 7.0.0软件对试验数据进行回归分析，由此得到超声波-微波协同辅助提取高粱醇溶蛋白得率对超声时间、液料比、微波时间的二次多项回归方程为：Y=6.72＋0.20A＋0.26B＋0.36C－0.075AB－0.088AC＋0.097BC－0.73A2－1.04B2－0.50C2。

通过方差分析从表2可以看出，该模型P＜0.001，表明回二次归方程模型极显著，模型的相关系数R2=0.9968，校正决定系数R2Adj=0.9927，表明模型实际值与预测值拟合较好，失拟项P=0.7526＞0.05，失拟不显著，试验误差较小，因此可用该模型对醇溶蛋白提取试验进行分析和预测。

表 2 回归模型各项方差分析

Table 2 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial regression model

注：***.差异极显著（P＜0.001）；**.差异高度显著（P＜0.01）；*.差异显著（P＜0.05）；R2=0.9968；R2Adj=0.9927。

由表2可知，各因素对高粱醇溶蛋白得率的影响都极显著，表明超声时间、液料比和微波时间对高粱醇溶蛋白得率影响都很大，交互项中除AB之间不显著，其余均显著，即超声时间与微波时间，液料比与微波时间都存在交互作用，因此表明各因素对高粱醇溶蛋白得率的影响不是简单的线性关系。

2.2.3 双因素交互作用分析

a.超声时间和液料比

b.超声时间和微波时间

c.液料比和微波时间

图 6 各两因素交互作用对高粱醇溶蛋白得率影响的响应面分析

Fig.6 Response surface plots showing the interactive effects of three extraction parameters on kafirin yield

由图6a可以看出，当微波时间固定在225s时，超声时间和液料比的交互作用不显著，在所选范围内无极值；从图6b可以看出当液料比固定在10∶1（mL/g）时，研究超声时间和微波时间对高粱醇溶蛋白得率的交互影响，由图6b看出，高粱醇溶蛋白得率随着超声时间和微波时间的延长而提高，当超声时间在26 min左右，微波时间在240s左右时得率最高，超声时间与微波时间对高粱醇溶蛋白得率影响显著，两者对醇溶蛋白得率的提高起到了一定的作用。图6c显示，当超声时间为25 min时，高粱醇溶蛋白得率受液料比和微波时间交互作用影响较大，微波时间短，液料比低，高粱醇溶蛋白得率小，但微波时间过长、液料比过大则会导致高粱醇溶蛋白得率下降。

2.2.4 优化提取工艺参数的验证

采用Design Expert软件，分析得到的最佳工艺条件是：超声时间25.55 min、液料比10.14∶1（mL/g）、微波时间257.30s，在此条件下高粱醇溶蛋白得率为6.81%。考虑到实际操作的便利，确定提取高粱醇溶蛋白的工艺条件为超声时间为26 min、液料比为10∶1（mL/g）、微波时间260s，经过3次平行实验，高粱醇溶蛋白的得率为6.79%，与理论值相差不大。

3 结 论

本研究运用响应面法对超声波-微波协同辅助高粱醇溶蛋白提取工艺进行优化，通过Box-Behnken试验设计建立数学模型，并进行响应面分析，结果表明超声时间、液料比、微波时间对高粱醇溶蛋白得率影响均显著，超声时间和微波时间、微波时间和液料比之间的交互作用显著，但超声时间和液料比的交互作用不显著。超声-微波协同辅助高粱醇溶蛋白提取工业条件为超声时间26 min、液料比10∶1（mL/g）、微波时间260s，在此工艺条件下验证实验，高粱醇溶蛋白得率为6.79%。利用响应面分析方法对超声波-微波协同辅助提取高粱醇溶蛋白提取工艺条件进行优化，可以获得最佳的工艺参数，从而为进一步的实验研究提供依据。

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