番木瓜酒产香酵母的筛选与鉴定

古其会，刘四新，李从发*

(海南大学食品学院，海南 海口 570028)

摘 要：从多种成熟水果的果肉、果皮、果园土壤以及自然发酵的番木瓜酒中，分离出121株酵母菌。其中从番木瓜酒中分离出一株酵母菌P3-3，该菌株在乙醇体积分数18%，SO2质量浓度300mg/L，pH2.1时能发酵产气。由该菌株发酵制成的番木瓜酒总酯含量达到6.53g/L，乙醇体积分数达到12%，而且香气浓郁、独特。经形态和分子生物学鉴定，该菌株为梅奇酵母(Metschnikowia sp.)。

关键词：番木瓜；果酒；产香酵母；分离；鉴定；梅奇酵母

Isolation and Identification of Aroma-producing Yeast for Papaya Wine

GU Qi-hui，LIU Si-xin，LI Cong-fa*

(College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570028, China)

Abstract：One hundred and twenty-one yeast stains were isolated from the pericarps and pulps of various tropical and subtropical fruits, soils and papaya wine. A yeast strain named P3-3 with excellent performance for the fermentation of papaya wine was selected. This strain exhibited powerful aroma-producing and fermentation capability under the conditions of 18% ethanol, 300 mg/L SO2 and pH 2.1. Strain P3-3 could form its unique flavor. It was identified as Metschnikowia sp. and could contribute to the aroma complexity of papaya wine.

Key words：papaya (Carica papaya L.)；fruit wine；aroma-producing yeast；isolation；identification；Metschnikowia sp.

中图分类号：Q939.97 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0193-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321040

番木瓜又称万寿果，是热带和南亚热带广泛种植的水果之一[1-2]，在我国主要分布在四川、云南、广西、福建、海南等地[3]。番木瓜营养丰富，含有各种维生素、有机酸、黄酮、番木瓜碱以及番木瓜蛋白酶等[3]，对人体健康以及美容护肤都有极大的好处。随着人们对番木瓜的营养价值认识越来越深，对番木瓜产品的开发也越来越多，例如番木瓜粉、番木瓜软糖、番木瓜果冻、番木瓜汁饮料等在市场上都能见到，而番木瓜酒在市场上却很难见到，在实验室酿造的番木瓜酒大多利用商业活性干酵母酿制，香气单薄，典型性不突出。为此，筛选一些适合番木瓜酒酿造的专用酵母菌，对提高番木瓜酒的产品质量有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种分离样品来源

番木瓜、菠萝、龙眼、香蕉、椰子等购自海口南北水果市场；番木瓜、龙眼、香蕉果园土壤采自海口市秀英区果园；自然发酵的番木瓜酒；安琪酵母BV818(Saccharomyces bayanus) 安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 培养基

YPD培养基(g/L)：胰蛋白胨20、葡萄糖20、琼脂粉20[4]。TTC上层培养基(g/L)：葡萄糖5、琼脂粉15、TTC试剂0.5。TTC下层培养基(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨2、酵母膏1.5、MgSO4•7H2O 4、K2HPO4 1、琼脂粉20。玉米粉琼脂培养基：参见文献[5]。产子囊孢子培养基：参见文献[6-7]。

1.1.3 试剂

偏重亚硫酸钠、葡萄糖、柠檬酸、无水酒精、TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)显色剂等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SPX智能型生化培养箱 宁波江南仪器厂；SKY-2112B型立式双层大容量恒温摇床 金坛市盛蓝仪器制造有限公司；G154DW自动压力蒸汽灭菌锅 厦门致微仪器有限公司；HR 2942榨汁机 荷兰Philips公司；PB303-N电子分析天平 上海梅特勒托利多仪器有限公司；BX51显微镜 日本奥林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 初筛

选取成熟的番木瓜、菠萝、龙眼、香蕉、椰肉打浆，取300mL果浆分别装入500mL三角瓶中，于25℃和30℃自然发酵20d左右，选取带有酒香和水果香的发酵汁作为菌种来源。

从成熟的番木瓜、菠萝、龙眼、香蕉、椰子表皮各部位分别取样；从番木瓜、龙眼、香蕉果园中土壤取样；从陈酿的番木瓜酒的酒脚里取样。将上述样品用无菌水稀释到10-4、10-5，吸取0.1mL，在YPD琼脂培养基中涂布，放入30℃培养箱中培养2～3d，待长出菌落后，选取具有典型酵母菌特征的菌落进行划线分离、纯化，镜检后用YPD斜面培养基保存。

1.3.2 复筛

1.3.2.1 一级筛选

在发酵24、48h时，以发酵管中产气量作为指标进行筛选比较。

采用杜氏管发酵法[8]，先将斜面菌株分别接种于100mL液体YPD培养基中，摇床培养12h进行活化，按106CFU/mL接种量接种于装有10mL YPD液体培养基的试管中，30℃静止培养，观察产气情况，记录菌株开始产气的时间和产气量。实验重复3次。

1.3.2.2 二级筛选

将上级筛选出的酵母菌活化后接入到25ºBrix的番木瓜汁中，在30℃的培养箱中培养25d后，倒入高脚杯中嗅闻评分，挑选具有典型性香气的菌株。

1.3.2.3 三级筛选

将一级和二级筛选出来的菌株进行TTC实验，观察各菌株产酒精能力。

TTC下层平板的制备：TTC下层培养基1000mL，在沸水浴中加热溶解，放入灭菌锅中，121℃灭菌20min, 在每个无菌培养皿中倒入20mL制成无菌平板。

TTC上层平板的制备：取TTC上层培养基1000mL于沸水浴中溶解[9]。

将活化的培养液稀释到10-5、10-6、10-7这3个梯度，取0.1mL涂布到TTC下层平板上，30℃培养2～3d，选择菌落数为10～40CFU的平板倒入约12mL TTC上层培养基覆盖原有菌落，30℃避光保温2～3h，根据菌落颜色的深浅来判断产酒精的能力，颜色越深，说明产酒精越多[10-12]。

1.3.2.4 四级筛选

通过一、二、三级筛选出的菌株，进行耐SO2、耐酸、耐酒精实验。采用杜氏管发酵法[13]，将活化后的酵母菌350μL分别接入含不同SO2质量浓度(80、110、170、210、300mg/L)、不同pH值(1.6、2.1、3.0、3.9)、不同酒精体积分数(10%、12%、14%、16%、18%)的装有10mL番木瓜汁并带有杜氏小管的试管中，30℃条件下培养，观察产气状况，记录各管产气开始时间和产气量。

1.3.3 菌种鉴定

1.3.3.1 固体培养特征观察

将分离纯化后的酵母菌涂布到YPD琼脂培养基平板上，30℃培养2～3d，观察菌落大小、颜色、光泽度、表面形态、边缘状况等特征。

1.3.3.2 液体培养特征观察

将分离纯化后的酵母菌接种于YPD液体培养基中，30℃培养7d后观察有无膜醭以及有无沉淀物。在显微镜下观察酵母菌的细胞形态及出芽方式、子囊孢子和假菌丝产生情况[14-15]。

1.3.4 18S rDNA序列分析

18S rDNA测序步骤按文献[16]进行。

1.3.5 酵母菌产香能力与产酒精能力比较

总酯含量测定参考文献[17]，酒精含量测定参考国家标准GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》 ，
感官评定标准参考葡萄酒(表1)。

表 1 原酒感官评定标准

Table 1 Standards for sensory evaluation of wine

2 结果与分析

2.1 酵母菌初筛

表 2 酵母菌分离结果

Table 2 Results of yeast isolation

从各种水果表皮、果园土壤以及果酒中共分离出121株酵母菌(其中83株来自果皮和果肉，37株来自土壤，1株来自番木瓜酒)。由表2可知，将每株酵母菌菌落形态以及细胞形态进行比较，最后归类得出33株不同酵母菌(其中19株来自果皮和果肉，13株来自土壤，1株来自番木瓜酒)。

2.2 酵母菌复筛

2.2.1 酵母菌的产气情况

表 3 杜氏小管产气情况

Table 3 Gas-producing capability of 33 yeast strains in Durham fermentation tubes

注：－. 杜氏管中气体小于1/3；＋. 杜氏管中的气体为1/3；＋＋. 杜氏管中气体为2/3；＋＋＋. 杜氏管中气体全满。

由表3可知，将分离得到的33株酵母菌进行发酵产气能力比较。经过48h发酵后，有8株酵母菌没有产气，发酵力微弱，其余25株酵母菌产气充满了杜氏管，说明产气性能较好，产气速率也较快，将这25株酵母菌作为下一级筛选用。

2.2.2 酵母菌产香能力比较

根据菌株发酵后的产膜、颜色、香气情况进行判断，产膜的立即舍去，因为在果酒酿造中产膜酵母对于果酒的发酵和澄清都有负面影响。对其余菌株发酵得到的番木瓜酒进行感官评价，以色泽和香气打分，评价结果见表4。

表 4 不同菌株发酵的番木瓜酒的感官评价

Table 4 Sensory evaluation of papaya wines from 25 of the 33 yeast strains

2.2.3 酵母菌产酒精能力比较

酒精含量的测定方法很多、如比重瓶法、比色法、酶法、折光法、氧化法以及气相色谱法等[18]。根据要求不同，所采用的方法也不同。本研究采取TTC比色法，TTC 是2,3,5-氯化三苯基四氮唑，一种显色剂，它能对酵母的代谢产物发生呈色反应[19]，通过它可以判断酵母菌呼吸酶活力的高低，从而判断酵母菌产酒精能力的大小[9]。将培养基上培养的酵母菌上覆盖一层TTC显色剂，TTC会显不同的颜色，产酒精能力强的酵母会显现深红色，依次是大红色、玫红色、粉色、淡粉色(图1、表5)。共有13个菌株染色后成深红色，说明其产酒精能力很强，作为下一级筛选用。

A

B

C

D

E

A. 菌株P3-3；B. 菌株P3-10；C. 菌株P4-7；D. 菌株G3-2；E. 菌株P4。

图 1 TTC平板菌落显色情况

Fig.1 Chromogenic detection of TTC plate colonies

表 5 酵母菌产酒精情况

Table 5 Alcohol-producing capability of 22 of the 25 yeast strains

2.2.4 酵母菌耐SO2比较

表 6 酵母菌在不同SO2质量浓度的产气情况

Table 6 Gas-producing capability of 13 of the 22 yeast strains under different SO2 levels

酵母菌耐SO2情况见表6。在果酒酿造中，一般SO2的添加量为120～200mg/L，选择耐受SO2 210mg/L及以上的菌株进行下一级筛选。

2.2.5 酵母菌耐酸能力比较

产香酵母所用的培养液需要一定量的有机酸，以利于产香酵母的生长和酯类物质的产生，产香酵母的最适宜pH值在3～5。对以上7株酵母进行耐酸性比较。由表7可知，有5株酵母菌能耐受pH2.1，符合果酒酵母pH3～3.5，因此，这5株酵母菌进行下一级筛选。

表 7 酵母菌在不同pH值体系中的产气情况

Table 7 Gas-producing capability of 5 of the 13 yeast strains at different pH levels

2.2.6 酵母菌耐酒精能力比较

表 8 48h酵母菌耐酒精产气情况

Table 8 Gas-producing capability of the 5 yeast strains at ethanol concentration levels during 48 h

注：＋表示产气泡；－表示没有产气泡。

酵母菌耐酒精能力情况见表8，P3-3酵母菌的耐受酒精能力最强。

将上述各项测试结果进行综合分析，P3-3酵母菌是酿造番木瓜酒最优的菌株。

2.3 酵母菌的鉴定

2.3.1 细胞形态和培养特征

图 2 P3-3酵母菌细胞形态

Fig.2 P3-3 yeast cell morphology

将P3-3酵母菌接种于YPD液体培养基中30℃培养2～3d，镜检结果见图2。细胞形态为椭圆形和球形，大小为(3.5～4.6)μm×(3.8～5.0)μm，单端、两端出芽繁殖。培养7d后，不形成膜醭，培养液澄清，有沉淀生成。P3-3酵母菌在YPD琼脂培养基上的菌落直径为4～5mm，表面光滑且有光泽，侧面为丘状突起，边缘整齐，菌落成乳白色，奶酪状，在玉米粉琼脂平板上，不透明，有强烈的酒香味产生，其菌落形态见图3。P3-3酵母菌接种到玉米粉琼脂培养基上，25℃条件下培养10d后，有假菌丝产生。在产孢子培养基上30℃培养7d后无子囊孢子形成。

图 3 P3-3酵母菌单菌落形态

Fig.3 P3-3 yeast colony characteristics

2.3.2 18S rDNA序列分析

1. P3-3酵母菌18S rDNA保守序列PCR产物；M. DNA Marker。

图 4 P3-3酵母PCR产物电泳图

Fig.4 Electrophoresis pattern of PCR products of P3-3 yeast 18S rDNA

由图4可知，由测序可知PCR产物片段大小为1393bp，PCR扩增产物DNA序列通过BLAST比对，与梅奇酵母18S rDNA的保守序列的相似性达99%，结合细胞形态和培养特征，参考《The yeast: a taxonomic study》(3版)和《真菌鉴定手册》初步确定P3-3为梅奇酵母(Metschnikowia sp.)。梅奇酵母为产香酵母，在葡萄酒发酵初期大量存在[20-21]。本研究证实P3-3菌株具有较高的耐酒精能力，与报道一致[22]。

2.3.3 P3-3酵母菌与安琪酵母产香能力与产酒精能力对比

表 9 P3-3酵母菌与安琪酵母菌产香能力与产酒精能力比较

Table 9 Comparison of aroma-producing and ethanol-producing capacities between P3-3 yeast and Angel-brand yeast

由表9中将P3-3酵母菌与安琪酵母的产香能力与产酒精能力比较可知，P3-3酵母菌的产酯能力比安琪酵母好，与感官评定结果一致，P3-3酵母菌发酵的番木瓜酒具有新鲜的果香和酒香，澄清透明，较好地保留了番木瓜酒的原果香，典型性强。安琪酵母发酵的番木瓜酒，果酒的香味较淡，原果香在果酒中没有体现出来，典型性较差。P3-3酵母菌产酒精体积分数可达12%，与安琪酵母菌产酒精能力相当。因此P3-3酵母菌不仅满足番木瓜酒的发酵的基本要求，并能突出番木瓜酒香气的典型性。

3 结 论

本次筛选的梅奇酵母发酵力强，耐酸、耐SO2、耐酒精都比较高，是可用于番木瓜酒酿造的产香酵母，只是启酵速率相对于商业酵母慢。一般情况下，在自然发酵过程中，有汉逊酵母、克勒克酵母、假丝酵母、梅奇酵母等启动发酵，它们大部分来源于果实，数量可达107～108CFU/g，发酵中期逐步消亡；与此同时酿酒酵母开始逐步占据主导地位，使发酵继续，直到完成发酵[23-24]。梅奇酵母作为发酵的启动酵母，对果酒的香气有贡献，还具有抑菌的作用。有文献报道，梅奇酵母对采摘后的冬枣、葡萄上的病原菌有抑制作用[25-27]。

本研究侧重于酵母产香能力的筛选，以更能突出番木瓜酒的典型性香气，改善和提高番木瓜酒的品质。有关该菌株对番木瓜酒香气成分形成的影响，还有待进一步研究。

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