响应面法优化双酶酶解酪蛋白工艺

张根生，丁琬莹，王 月，魏冬珊，岳晓霞

(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076)

摘 要：以酪蛋白为原料，水解度作为指标，采用单因素及响应面试验，分别对碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解酪蛋白工艺条件进行研究。结果表明：碱性蛋白酶酶解酪蛋白的适宜条件为底物质量浓度60g/L、pH9.14、酶添加量4076.16U/g(以底物计)、温度50.63℃、时间4.81h，水解度为24.45%。胰蛋白酶适宜条件为底物质量浓度60g/L、pH8.31、酶添加量4235.64U/g(以底物计)、温度46.30℃、时间5.00h，水解度为16.27%。双酶分步酶解测得水解度达到31%，明显优于单酶水解效果。

关键词：酪蛋白；碱性蛋白酶；胰蛋白酶；水解度；响应面法

Optimization of Casein Hydrolysis by Alcalase and Trypsin Using Response Surface Methodology

ZHANG Gen-sheng，DING Wan-ying，WANG Yue，WEI Dong-shan，YUE Xiao-xia

(Key Laboratory of Food Science and Engineering, College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Abstract：Casein was hydrolyzed by alcalase and trypsin separately or in combination with each other. The hydrolysis processes were optimized for maximum degree of hydrolysis (DH) using response surface methodology. The optimal hydrolysis conditions for alcalase were 60 g/L, 9.14, 4076.16 U/g, 50.63 ℃ and 4.81 h for substrate concentration, pH and enzyme dosage, respectively, while those for trypsin were 60 g/L, 8.31, 4235.64 U/g, 46.30 ℃ and 5.00 h, respectively. Under these conditions, the corresponding DH were 24.45% and 16.27%, respectively. The combined and sequential use of alcalase followed by trypsin provided a DH up to 31%, which was much superior to either of them.

Key words：casein；alcalase；trypsin；hydrolysis degree；response surface analysis

中图分类号：TS201.1；Q814.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0237-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321048

牛乳中含有约3.3%的蛋白质，主要包括酪蛋白、乳球蛋白、乳白蛋白和乳铁蛋白[1]，其中酪蛋白约80%[2]，是牛乳蛋白的主要成分。酪蛋白以胶束形式存在，由αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白4种蛋白质复合组成，是一种全价蛋白[3]。有研究表明，酪蛋白是多种生物活性肽的主要来源，如抗氧化肽[4]、免疫调节肽[5]、抗高血压肽[6]、抗菌肽[7]等，因此，酶解酪蛋白制备功能性肽成为多肽研究的热点之一。孙浩等[8]采用碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽。洪伟等[9]采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶分别酶解酪蛋白制备ACE抑制肽。高婷等[3]采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等6种蛋白酶分别酶解酪蛋白制备抗氧化肽。在国外，Zucht等[10]用胰蛋白酶酶解酪蛋白得到Casocidin-Ⅰ，在体外能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。Reynolds等[11]采用胰蛋白酶水解酪蛋白，又通过钙-乙醇沉淀法分离得到酪蛋白磷酸肽。采用单一酶水解，往往存在水解度较低，底物和酶消耗量大，不利于大规模生产等问题[12]。

水解酪蛋白的主要用酶有胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶。其中胰蛋白酶能够专一切割肽链中的赖氨酸和精氨酸，肽链长度适中[13]，碱性蛋白酶释放的肽链更短，产率高[14]。本实验采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶分步水解酪蛋白，对其酶解工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干酪素、碱性蛋白酶(2.2×105U/g) 北京奥博星生物技术有限责任公司；胰蛋白酶(1.0×105U/g) 北京索莱宝科技有限公司；甲醛 丹东市龙海试剂厂；氢氧化钠 天津市天新精细化工开发中心；浓硫酸 天津市渤海化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-4型数显电子恒温水浴锅 国华电器有限公司；精密天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；PHS-25型酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；电动搅拌器 上海予滕生物科技有限公司；凯氏定氮装置 天津市实验仪器厂；低速离心机 张家港市拓邦机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶活力测定

蛋白酶活力测定采用福林-酚法[15]。

1.3.2 酪蛋白的酶解工艺流程[16]

加热并搅拌 调节pH值并加酶

↓ ↓

酪蛋白→加入一定量去离子水→酶解→灭酶(沸水浴10min)→离心分离(4000r/min)→上清液(酶解液)

1.3.3 酪蛋白酶解工艺优化单因素试验

以水解度为指标，采用单因素试验，分别探讨两种酶的底物质量浓度、pH值、酶添加量、温度和时间对水解度的影响。其中碱性蛋白酶选取底物质量浓度的水平为20、40、60、80、100g/L，pH值为8.5、9、9.5、10、10.5、11，酶添加量水平为1000、2000、3000、4000、5000、6000U/g，温度水平为40、45、50、55、60℃，时间水平为3、3.5、4、4.5、5、5.5h；胰蛋白酶选取底物质量浓度水平为20、40、60、80、100g/L，pH值水平为6.5、7、7.5、8、8.5、9，酶添加量水平为1000、2000、3000、4000、5000、6000U/g，温度水平为35、40、45、50、55℃，时间水平为3、3.5、4、4.5、5、5.5h，按照1.3.2节工艺流程进行实验，取上清液进行水解度测定。

1.3.4 酪蛋白酶解工艺的响应面试验

在酶解单因素试验的基础上，选取pH值、加酶量、温度和时间为影响因素，以水解度作为评价指标，确定四因素三水平的最佳参数进行响应面分析，方案设计如表1、2所示。

表 1 碱性蛋白酶响应面试验因素水平编码表

Table 1 Factors and levels used in response surface analysis for alcalase

表 2 胰蛋白酶响应面试验因素水平编码表

Table 2 Factors and levels used in response surface analysis for trypsin

1.3.5 水解度(DH)测定

采用甲醛滴定法[17]。取灭酶后的水解液8.0mL于150mL三角瓶中，加60mL去CO2水，调节pH8.2，再加入10mL中性甲醛溶液并混匀，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L的NaOH标准溶液调节pH值至9.20，记录此时消耗NaOH溶液的体积数V1，取相同浓度未水解酪蛋白溶液8.0mL按上述方法作空白实验，记录此时消耗NaOH溶液的体积数V2，计算酪蛋白酶解的水解度。

式中：c为NaOH标准滴定溶液的浓度/(mol/L)；V1为滴定样品消耗的NaOH标准滴定溶液的体积/mL；V2为滴定空白样品消耗的NaOH标准滴定溶液的体积/mL；ρwo为样品溶液的蛋白质量浓度/(g/L)；V为用于甲醛滴定的水解液的体积数/mL；htot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，对于酪蛋白，该值取8.2[18]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酪蛋白质量浓度对水解度的影响

在pH9、酶添加量3000U/g、50℃、酶解时间4h的条件下加入碱性蛋白酶；pH8、酶添加量3000U/g、40℃、酶解时间4.5h的条件下加入胰蛋白酶，使其在不同的酪蛋白质量浓度条件下反应，分别研究两种酶对酪蛋白水解度的影响。

图 1 酪蛋白质量浓度对水解度的影响

Fig.1 Effect of casein concentration on DH

由图1可知，随着底物质量浓度的增加，水解度呈现先上升再下降的趋势。碱性蛋白酶和胰蛋白酶都在底物质量浓度为60g/L时水解度达到最高。这是因为当酶催化时，首先会和底物结合生成中间复合物，然后生成产物，并释放出酶。底物质量浓度较低时，酶与底物的接触机率较低，导致水解度不高。而在较高的底物质量浓度情况下，酶被完全饱和，导致水解速率下降，同样底物质量浓度较高时，整个反应体系的流动性也会减弱，同样导致酶与底物的作用机率减弱，从而造成单位时间内蛋白质转化率较低。

2.1.2 pH值对水解度的影响

在60g/L酪蛋白质量浓度，酶添加量为3000U/g、50℃，酶解时间4h的条件下，加入碱性蛋白酶；60g/L酪蛋白质量浓度、酶添加量3000U/g、40℃、酶解时间为4.5h的条件下，加入胰蛋白酶，使其在不同的pH值条件下反应，分别研究两种酶对酪蛋白水解度的影响。

图 2 pH值对水解度的影响

Fig.2 Effect of hydrolysis pH on DH

由图2可知，随pH值的升高，水解度呈先上升后下降的趋势。碱性蛋白酶在pH9时水解度达到最大，胰蛋白酶在pH8时水解度达到最大。pH值对酶催化反应速率的影响主要有两方面：首先酶在过酸或过碱的条件下空间构象会改变，使酶失活；其次pH值直接影响着酶及蛋白质分子某些解离基团的解离状态，只有在特定的pH值条件下，酶及底物蛋白质的解离基团才能处于最易于结合并转化成产物的解离状态。

2.1.3 酶添加量对水解度的影响

在60g/L酪蛋白质量浓度、pH9、50℃、酶解时间4h的条件下，加入碱性蛋白酶；在60g/L酪蛋白质量浓度、pH8、40℃、酶解时间4.5h的条件下，加入胰蛋白酶，使其在不同的酶添加量条件下反应，分别研究两种酶对酪蛋白水解度的影响。

图 3 酶添加量对水解度的影响

Fig.3 Effect of enzyme concentration on DH

由图3可知，随着酶添加量的增加，水解度先上升后趋于平稳。碱性蛋白酶和胰蛋白酶都在加酶量为4000U/g的条件时水解度最大。这主要是因为在一定底物质量浓度下，酶添加量较低时，酶可能被饱和，所以酶添加量越高，酶解速率越高，水解度上升明显；随着酶添加量的逐渐增大，底物质量浓度相对减小，有一部分酶分子没有机会与底物结合，所以尽管加酶量成倍增加，水解度却趋于稳定。

2.1.4 温度对水解度的影响

在60g/L酪蛋白质量浓度、pH9、酶添加量为4000U/g、酶解时间4h的条件下，加入碱性蛋白酶；在60g/L酪蛋白质量浓度、pH8、酶添加量4000U/g、酶解时间为4.5h的条件下，加入胰蛋白酶，使其在不同的温度条件下反应，分别研究两种酶对酪蛋白水解度的影响。

图 4 温度对水解度的影响

Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on DH

由图4可知，水解度先随着温度的升高而增加，当碱性蛋白酶温度在50℃，胰蛋白酶温度45℃时，水解度分别达到最大，随后略有小幅度下降。这是因为酶与大多数化学反应有相同之处，需要一个适宜的反应温度。当温度逐渐升高时，反应速率加快，水解度随之上升；但是随着温度继续升高，酶活性会受到抑制，酶反应速率下降，从而导致水解度下降。

2.1.5 时间对水解度的影响

在60g/L酪蛋白质量浓度、pH9、酶添加量4000U/g、50℃的条件下，加入碱性蛋白酶；在60g/L酪蛋白质量浓度、pH8、酶添加量4000U/g、45℃的条件下，加入胰蛋白酶，使其在不同的时间条件下反应，分别研究两种酶对酪蛋白水解度的影响。

图 5 时间对水解度的影响

Fig.5 Effect of hydrolysis time on DH

由图5可知，随着酶解时间的延长，水解度先显著上升后趋于稳定。碱性蛋白酶和胰蛋白酶都在4.5h时达到最大水解度。

2.2 响应面法优化酶解条件的结果

根据中心组合试验Box-Behnken设计原理，综合分析单因素试验，确定酪蛋白质量浓度为60g/L，选取对水解度影响显著的4个因素(pH值、酶添加量、温度和时间)，设计了四因素三水平的响应面试验。

表 3 碱性蛋白酶响应面设计及结果

Table 3 Experimental design and results for response surface analysis for alcalase

利用Design-Expert7.0软件，采用中心组合试验Box-Behnken设计方案及结果见表3，以pH值、酶添加量、温度和时间对碱性蛋白酶酶解工艺参数进行优化，获得二次回归方程：

DH=24.37＋0.77X1＋0.46X2＋0.27X3＋0.59X4－0.11X1X2－0.2X1X3＋0.59X1X4－0.5X2X3－0.35X2X4＋0.45X3X4－2.03X12－X22－1.79X32－0.63X42

表 4 碱性蛋白酶酶解工艺响应面二次回归方程模型方差分析表

Table 4 Analysis of variance for the quadratic regression model for alcalase

由表4可知，本实验所选用的模型高度显著(P＜0.0001)，失拟项P=0.2810＞0.05，失拟项不显著；模型的校正决定系数R2Adj=0.9643，说明该模型能解释96.43%响应值的变化，仅有总变异大约3.57%不能用此模型来解释；决定系数R2=0.9821，说明该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是合适的，可以用此来分析和预测碱性蛋白酶对酪蛋白的水解。本模型的信噪比达到25.285，远大于4，可用于生产应用中。

综合以上单因素及响应面试验结果，使用Design-Expert软件进行多响应值的最优条件选择，得到优化工艺参数为：pH9.14、温度50.63℃、时间4.81h、酶添加量4076.16U/g，DH的预测值为24.69%。在最优条件下进行酶解试验进行验证(n=3)，所测实际水解度平均值为24.45%，说明建立的回归方程能真实地反映温度、pH值、时间、酶添加量对碱性蛋白酶酶解酪蛋白工艺的影响，对指导生产具有很好的指导意义。

表 5 胰蛋白酶响应面试验设计及结果

Table 5 Experimental design and results for response surface analysis for trypsin

利用Design-Expert7.0软件，采用中心组合试验Box-Behnken设计方案及结果见表5，以pH值、酶添加量、温度和时间对胰蛋白酶酶解工艺参数进行优化，获得二次回归方程：

DH=15.47＋0.81X1＋0.092X2＋0.13X3＋0.86X4＋0.4X1X2－0.055X1X3＋1.46X1X4－0.28X2X3＋0.63X2X4＋0.92X3X4－1.86X12－1.89X22－1.81X32－0.95X42

表 6 胰蛋白酶酶解工艺二次回归方程模型方差分析

Table 6 Analysis of variance for the quadratic regression model for trypsin

由表6可知，本实验所选用的模型高度显著(P＜0.0001)，失拟项P=0.4819＞0.05，说明失拟项不显著；模型的校正决定系数R2Adj=0.9684，说明该模型能解释96.84%响应值的变化，仅有总变异大约3.16%不能用此模型来解释；决定系数R2=0.9842，说明该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是合适的，可以用此来分析和预测碱性蛋白酶对酪蛋白的酶解。本模型的信噪比达到23.700，大于4，可用于生产应用中。

综合以上单因素及响应面试验结果，使用Design
Expert软件进行多响应值的最优条件选择，得到胰蛋白酶酶解优化工艺参数为：pH8.31、温度46.30℃、时间5.00h、酶添加量4235.64U/g，DH预测值为16.3140%。在最优条件下进行酶解实验进行验证(n=3)，所测实际水解度平均值为16.27%，说明建立的回归方程能真实地反映温度、pH值、时间、酶添加量对胰蛋白酶酶解酪蛋白工艺的影响，对指导生产具有很好的指导意义。

2.3 双酶分步酶解

根据碱性蛋白酶和胰蛋白酶的响应面试验结果，使两种酶在各自的最适试验条件下分步对酪蛋白进行酶解。从双酶分步酶解实验结果(表7)来看，双酶酶解效果明显优于单酶酶解效果。双酶酶解的工艺条件如下：碱性蛋白酶：酪蛋白质量浓度60g/L、pH 9.14、50.63℃、酶解4.81h、酶添加量4076.16U/g；胰蛋白酶：酪蛋白质量浓度60g/L、pH8.31、46.30℃、酶解5.00h、酶添加量4235.64U/g。酶的添加顺序对水解度影响不大，这是因为两种酶作用的位点不同。同时，采用两种不同的酶进行酶解，可以得到不同切割位点的肽段，更加丰富了酶解物的肽链种类。因此，选择碱性蛋白酶和胰蛋白酶这两种酶对酪蛋白进行双酶分步酶解。

表 7 双酶分步酶解结果分析

Table 7 Sequential hydrolysis of casein with alcalase and trypsin

3 结 论

采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶对酪蛋白进行酶解，通过单因素试验和Box-Behnken响应面试验对酶解工艺进行优化，拟合了pH值、酶添加量、温度和时间这4个因素对酪蛋白水解度的回归模型，经检验证明该模型合理可靠，能较好地预测酪蛋白的水解度。由该模型确定的最优工艺条件为：碱性蛋白酶：pH9.14、50.63℃、酶解4.81h、酶添加量4076.16U/g(以底物计)；胰蛋白酶：pH8.31、46.30℃、酶解5.00h、酶添加量4235.64U/g。在酪蛋白质量浓度60g/L，两种酶在各自最适条件下分步酶解酪蛋白，最终测得水解度达到31%，明显优于单酶酶解的效果。

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