大孔树脂纯化酒花多酚及其组成分析

王旭苹1，杨 磊2，杨小兰1,*，罗正明3

(1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.南开大学生命科学学院，天津 300071；

3.忻州师范学院地理旅游管理系，山西 忻州 034000)

摘 要：采用大孔树脂从酿造废酒花中分离纯化酒花多酚，并采用高效液相色谱(HPLC)法分析鉴定了酒花多酚的单酚成分。结果表明：SP850树脂的吸附量为79.8mg/g，解吸率为78.4%，并且达到吸附平衡与解吸平衡的时间较短，较适合酒花多酚的纯化。最佳工艺参数为上样液多酚质量浓度7.3mg/mL、上样量6BV、上样流速3BV/h、洗脱剂为60%乙醇溶液、洗脱流速2BV/h、洗脱剂用量4BV、水洗用量5BV。在此条件下，酒花多酚的纯度由13.2%提高到56.6%。分析表明，酒花多酚纯化物中55.2%的多酚物质是原花青素。HPLC鉴定出酒花多酚中的10种单酚成分，分别为没食子酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、白藜芦醇、异槲皮苷和黄腐酚。

关键词：酒花多酚；大孔树脂；分离纯化；高效液相色谱

Macroporous Resin Adsorption for Purification of Hop Polyphenols from and Compositional Analysis

WANG Xu-ping1，YANG Lei2，YANG Xiao-lan1,*，LUO Zheng-ming3

(1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；

2. College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China；

3. Department of Hospital Travel and Tourism Management, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000, China)

Abstract：Hop polyphenols were extracted from spent hops, purified by macroporous resin adsorption and subjected to compositional analysis by HPLC. The results showed that the adsorption and desorption capacities of hop polyphenols on SP850 resin were 79.8 mg/g and 78.4%, respectively, and the adsorption and desorption processes were equilibrated in a short time, indicating the suitability of this resin for purifying the crude phenols extracted from hops. The optimal purification conditions were loading of 6 BV of 7.3 mg/mL sample solution at a flow rate of 3 BV/h followed by washing with 5 BV of deionized water and elution with 4 BV of 60% ethanol at a flow rate of 2 BV/h. Under the optimized conditions, the purity of polyphenols in hop extracts was increased from 13.2% to 56.6%. The compositional analysis indicated that 55.2% of the purified polyphenols were proanthocyanidins and 10 individual phenols were identified by HPLC, which were gallic acid, catechin, chlorogenic acid, epicatechin, rutin, hyperoside, astragalin, resveratrol, isoquercitrin and xanthohumol.

Key words：hop polyphenols；macroporous resin；purification；high performance liquid chromatography (HPLC)

中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0015-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322004

啤酒花(Humulus lupulus L.)为多年生草本植物，雌雄异株，雌花序简称为酒花，是啤酒酿造的主要原料之一。酒花中的苦味酸和酒花油能提供给啤酒独特的苦味、香气和抑菌力[1]，超临界CO2可实现对这些成分的有效萃取。酒花中含有4%～14%的多酚[2]，由于它们的极性大部分不能被超临界CO2萃取出来，而残留在萃余物中，通常这些酒花萃余物被认为是啤酒酿造工业的废料(废酒花)而浪费。近年来的研究表明酒花多酚与绿茶或葡萄多酚一样是很有前途的功能性成分，具有抗氧化[3-4]、抑菌[5-6]、抗炎[7-8]、抗毒素[9]等多种生物活性功能。此外，我国是啤酒生产量最大的国家，占全球产量的1/4[10]。因此，充分利用我国丰富的酿造废酒花资源，提取具有天然生物活性的酒花多酚具有重要意义。

大孔树脂具有理化性质稳定、不溶于酸碱及有机溶剂、吸附效果好、再生简单、使用周期长等优点，对提取物可以起到分离和筛选的作用，被广泛应用于天然产物的分离精制[11-12]。本研究选取SP850、HP20和HP2MGL 3种对多酚纯化效果较好的大孔树脂，从中筛选出1种对酒花多酚具有良好吸附及解吸性能的树脂，并确定酒花多酚的最佳纯化条件，同时采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法和正丁醇比色法对酒花多酚的组成分进行分析鉴定，旨在为废酒花的再利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒花(青岛大花，颗粒型) 甘肃省玉门市绿峰酒花公司。

HP20、HP2MGL树脂和SP850树脂 北京绿百草科技发展有限公司；原花青素标品(纯度≥98%) 天津尖峰天然产物有限公司；福林酚 美国Sigma公司；没食子酸、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、白藜芦醇、异槲皮苷 中国食品药品检定研究院；黄腐酚标准品 瑞士Alexis公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1L/45MPa超临界流体萃取装置 广州美晨高新分离技术有限公司；UV-2800AH型紫外-可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司；KQ-200KDE型高功率数控超声波清洗器(超声波频率40kHz、功率200W) 昆山市超声仪器有限公司；RE-52旋转真空蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；HL-2S恒流泵 上海康华生化仪器制造厂；高效液相色谱仪(配有1525系列双泵系统、2487双波长紫外检测器、色谱柱Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)、Breeze软件操作系统) 美国Waters公司；超纯水制备系统 美国Milipore公司。

1.3 方法

1.3.1 超临界CO2萃取酒花

将250g酒花颗粒粉碎，超临界CO2萃取，控制萃取釜压力25MPa、萃取温度50℃、分离柱压力10MPa、CO2流量25L/h、萃取时间1.5h，收集萃余物废酒花215g。

1.3.2 废酒花中多酚的提取

称取废酒花200g溶于2000mL 50%的乙醇溶液中超声提取15min，200W、30℃、提取2次，合并上清液，真空回收乙醇，得酒花多酚粗提液，经测定粗提液的多酚质量浓度为29.2mg/mL。

1.3.3 酒花多酚质量浓度的测定

采用Folin-Ciocalte法[13]，以没食子酸为标准品做标准曲线。

1.3.4 酒花多酚纯度的测定

各取一定体积的酒花多酚粗提液与树脂纯化的洗脱液，真空浓缩回收乙醇，冻干，分别得到酒花多酚粗提物和酒花多酚纯化物，测定多酚纯度。

多酚纯度/%= ×100

多酚质量/g

干物质质量/g

(1)

1.3.5 大孔树脂的预处理[14]

将SP850、HP20和HP2MGL 3种大孔树脂于95%乙醇中浸泡8h，然后用蒸馏水洗至无乙醇味；再用5%盐酸溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至流出水pH值为中性；然后用5% NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至流出水pH值为中性。每次上样洗脱完毕后，先用2%盐酸溶液洗至无色，用蒸馏水洗至pH 值为中性；再用2% NaOH溶液洗至无色，最后用蒸馏水洗至pH值为中性。

1.3.6 大孔吸附树脂的筛选

取不同型号的经预处理的湿树脂2.0g，装入100mL具塞锥形瓶中，精密加入多酚质量浓度为7.3mg/mL的酒花多酚粗提液25mL，置于恒温振荡器上振荡(45℃、180r/min)吸附多酚，4h后过滤，得滤液1，测定滤液1中多酚质量浓度，计算吸附量Q。滤去粗提液后的树脂经蒸馏水洗2次，滤干，精密加入50%的乙醇溶液50mL，在相同的条件下解吸2h后过滤，得滤液2，测定滤液2中多酚的质量浓度，根据吸附量计算吸附率和解吸率，确定吸附率和解吸率兼好的树脂，相关计算公式如式(2)～(4)所示：

(2)

(3)

(4)

式(2)～(4)中：Q为多酚吸附量/(mg/g湿树脂)；C0为起始质量浓度/(mg/mL)；C1为滤液1的质量浓度/(mg/mL)；
C2为滤液2的质量浓度/(mg/mL)；V1为吸附溶液体积/mL；V2为解吸溶液体积/mL；m为树脂质量/g。

1.3.7 大孔树脂吸附特性的考察

取处理好的湿树脂2.0g(用滤纸吸干)于100mL塞锥形瓶中加入一定质量浓度的酒花多酚粗提液，在一定温度条件下置于恒温振荡器上振荡吸附，在10h内每隔2h取1mL溶液，测其多酚质量浓度，计算树脂的吸附量，绘制树脂静态吸附特性曲线。

1.3.8 大孔树脂纯化酒花多酚的条件优化

1.3.8.1 上样液多酚质量浓度的选择

取酒花多酚粗提液(多酚质量浓度29.2mg/mL)
50mL，分别加水稀释1、2、3、4、5倍，注入SP850层析柱(2cm×30cm)(约40g树脂)中，柱体积70mL，以流速2BV/h(1BV为1个柱体积)进行吸附，同时收集流出液，在765nm波长处测定总多酚含量，计算吸附量，确定最佳的上样液多酚质量浓度。

1.3.8.2 上样量的选择

将酒花多酚粗提液(总多酚质量浓度为7.3mg/mL)，以2BV/h流速注入SP850层析柱中，同时以35mL/管连续收集流出液，于765nm波长处测定各管总多酚含量，绘制泄露曲线，确定最佳的上样量体积。

1.3.8.3 上样流速的选择

取酒花多酚粗提液(总多酚质量浓度为7.3mg/mL)
500mL，加入SP850层析柱中，分别以1、2、3、4、5BV/h
的流速进行吸附，收集流出液，测定其总多酚质量浓度，计算大孔树脂对酒花多酚的吸附量，确定最佳吸附流速。

1.3.8.4 洗脱剂乙醇体积分数的选择

取酒花多酚粗提液(总多酚质量浓度为7.3mg/mL)
500mL，加入SP850层析柱中，以2BV/h的流速进行吸附，再以4BV/h的流速用水洗除杂后，分别用体积分数为30%、40%、50%、60%和70%的乙醇溶液以2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，测定总多酚的含量，计算解吸率。

1.3.8.5 洗脱流速的选择

取酒花多酚粗提液(总多酚质量浓度为7.3mg/mL)
500mL，加入SP850层析柱中，以2BV/h的流速进行吸附，再以4BV/h的流速用水洗除杂后，用60%的乙醇溶液分别以1、2、3、4、5BV/h的流速进行动态解吸，收集洗脱液，测定总多酚的含量，计算解吸率。

1.3.8.6 洗脱剂用量的选择

吸附饱和的SP850树脂，用少量水除杂质，再用9BV的60%乙醇洗脱，洗脱速度为2BV/h，测定室温条件下乙醇溶液对树脂吸附的多酚物质的动态洗脱效果，绘制洗脱曲线。

1.3.8.7 除杂水洗用量的选择

将吸附饱和的树脂柱用蒸馏水以4BV/h的流速洗脱树脂未被吸附的成分和杂质，收集流出液，在765nm波长处测定多酚含量，绘制水洗曲线。

1.3.9 酒花多酚的组分分析

1.3.9.1 原花青素的测定

采用正丁醇-盐酸法[15]。简言之，取正丁醇-盐酸溶液(95:5，V/V)6mL置于具塞试管中，再加入0.2mL硫酸铁铵溶液和1mL不同质量浓度的标准溶液，混匀，置沸水浴，精确加热40min后，立即置冰水冷却，在加热完毕15min后，于546nm波长处测定吸光度。以蒸馏水代替样品为空白对照，每个样品平行测定3次。以原花青素标准品做标准曲线。

1.3.9.2 HPLC分析

同时测定9种多酚组分的色谱条件[16-18]：流动相为3%的乙酸溶液(A)和乙腈(B)；流速1mL/min；色谱柱温25℃；进样量为10μL；梯度洗脱程序：0～10min，95%～80% A，5%～20% B；10～20min，80%～65% A，20%～35% B；20～40min，65% A，35% B，检测波长为360nm和280nm。标准品为没食子酸、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、白藜芦醇和异槲皮苷。

测定黄腐酚的色谱条件：流动相为1%冰醋酸溶液(A)和乙腈(B)；流速1mL/min；色谱柱温25℃；洗脱程序：0～20min，20%～50% A，80～50% B；20～30min，20% A，80% B；检测波长370nm；进样体积20μL。标准品为黄腐酚。

单酚化合物的定性以所对应标准品的保留时间确定，定量是通过色谱图中标准物的峰面积来确定的，含量单位为mg/g纯化物。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选

表 1 3种大孔树脂对酒花多酚的静态吸附与解吸性能

Table 1 Static adsorption and desorption performances of hop polyphenols on three different types of macroporous resin

大孔树脂的吸附性能对多酚的纯化影响很大，树脂的极性和空间结构(主要指孔径、比表面积等)是影响吸附性能的重要因素。根据先前对酒花多酚的提取实验结果发现，50%～60%的乙醇溶液对总多酚的提取量最大，由此推断酒花多酚为弱极性或中等极性的物质。SP850和HP20是聚苯乙烯二乙烯基苯类型树脂，属于弱极性树脂，HP2MGL是聚甲基丙烯酸酯类树脂，适合于中等极性物质的分离。SP850树脂的比表面积(1000m2/g)大于HP20(600m2/g)，孔径(38Å)小于HP20(260Å)，对小分子质量物质的吸附容量约为HP20的2倍，更适合于小分子质量(Mr＜900)物质的吸附，HP20更适合于大分子质量(Mr＜1500)物质的吸附。考虑到酒花多酚的组分主要为小分子质量的酚酸类和黄酮苷类以及大分子质量的多聚原花青素类[1]，因此综合考虑选择SP850、HP20和HP2MGL 3种树脂进行筛选实验。表1表明，SP850树脂分离纯化酒花多酚效果较好，总多酚吸附量最高，对酒花多酚不仅具有较强的吸附能力，而且容易洗脱，适合用于酒花多酚的分离精制。

2.2 SP850树脂对酒花多酚的吸附特性

吸附速度是树脂吸附性能的重要参考指标，由图1可知，0～2h内，SP850树脂对酒花多酚的吸附量随时间延长而增大，之后吸附量趋于平衡。表明SP850树脂对酒花多酚能快速吸附平衡，具有良好的吸附性能，适合工业化应用。

图 1 静态吸附时间对吸附量的影响

Fig.1 Effect of static adsorption time on adsorption quantity

2.3 SP850树脂对酒花多酚的动态吸附与解吸条件的优化

2.3.1 上样液多酚质量浓度的确定

图 2 上样液多酚质量浓度对吸附量的影响

Fig.2 Effect of sample concentration on adsorption quantity

由图2可知，随着上样质量浓度稀释倍数逐渐增大，树脂对多酚的吸附量随之增加，当稀释倍数大于3倍时，多酚的吸附量出现下降趋势，这可能是因为吸附时间过长，有一部分先吸附的多酚被上样液洗脱下来。因此，选择上样稀释倍数3倍，即上样液多酚质量浓度为7.3mg/mL。

2.3.2 上样量的确定

图 3 泄露曲线

Fig.3 Leakage curve of hop polyphenols on SP850 resin

由图3可知，上样量达到1BV时开始出现多酚的泄漏，此后随着上样量的增加泄漏量逐渐增加，上样量从4.5BV开始，泄露速度趋于稳定，即4.5～6BV时达到一个动态平衡。但从6BV开始，泄露速度又直线上升，到7BV后，流出液与上样液中总酚含量(7.3mg/mL)几乎相等，提示SP850树脂对酒花多酚的吸附趋于饱和，因此确定上样量为6BV。

2.3.3 上样流速的确定

表 2 上样流速对吸附量的影响

Table 2 Effect of sample loading flow rate on adsorption quantity

由表2可知，上样流速在0～2BV/h内，随着上样流速的增加，树脂对酒花多酚的吸附量先增加，之后，随着上样流速的继续增大，吸附率出现减小的趋势。当上样流速为4BV/h时，吸附量明显减少。考虑到上样流速太慢时，工作效率低。因此，选择上样流速为3BV/h。

2.3.4 洗脱剂乙醇体积分数的选择

图 4 乙醇体积分数对树脂解吸率的影响

Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption efficiency

由表4可知，洗脱剂乙醇体积分数在30%～60%范围内，随着乙醇体积分数增大，解吸率也随之增加，当乙醇体积分数为60%时，解吸率达到最高(78.6%)，之后，随着洗脱液乙醇体积分数的继续增大，解吸率出现下降趋势，故选用60%乙醇溶液对酒花多酚进行洗脱。

2.3.5 洗脱流速的确定

表 3 洗脱流速对酒花多酚解吸率的影响

Table 3 Effect of desorbent flow rate on desorption efficiency

由表3可知，随着洗脱流速的增大，酒花多酚的解吸率逐渐减小，这可能是由于洗脱流速过快，导致洗脱剂来不及充分解吸被树脂吸附的多酚，但是洗脱流速太慢，酒花多酚的纯化效率过低。因此，综合考虑，选2BV/h的洗脱流速为宜。

2.3.6 洗脱剂用量的确定

图 5 洗脱曲线

Fig.5 Elution curve

由图5可以看出，动态洗脱条件下，SP850吸附的酒花多酚极易被洗脱下来，当洗脱剂用量为4BV时，酒花多酚基本被全部洗脱下。因此，选用4BV的洗脱剂用量。

2.3.7 除杂水洗用量

图 6 水洗曲线

Fig.6 Water flushing curve

由图6可知，当水洗液用量达到4BV的时候，基本可以把树脂未吸附的多酚洗尽，并且流出液没有颜色，说明其他杂质也基本被洗脱下来。因此，为了能将吸附饱和的树脂洗干净，综合考虑选择水洗液用量为5BV。

2.4 树脂纯化效果分析

测定结果表明，酒花多酚粗提物的多酚含量为13.2%，经SP850树脂纯化后纯度由13.2%提高到56.6%，按公式[19](回收率/%=解吸量/上样量×100)计算得出酒花多酚的回收率为75.4%，表明SP850树脂能有效分离纯化酒花多酚类物质。

2.5 酒花多酚组成分析

1.没食子酸；2.儿茶素；3.绿原酸；4.表儿茶素；5.芦丁；6.金丝桃苷；7.紫云英苷；8.白藜芦醇；9.异槲皮苷。

图 7 酒花多酚纯化物(A)和混合单酚标准品(B)的HPLC图

Fig.7 HPLC chromatogram of purified hop polyphenols (A) and mixed standards of phenols (B) at 280 nm

图 8 黄腐酚的HPLC图

Fig.8 HPLC chromatogram of xanthohumol sample

通过大孔树脂分离得到的酒花多酚纯化物，采用HPLC分析可鉴定出其中的10种单酚成分，其色谱图见图7、8，定性及定量分析结果见表4。

表 4 酒花多酚纯化物各组分的定性及定量分析

Table 4 Qualitative and quantitative analysis of purified hop polyphenols

注：括号中数值表示某一组分在总多酚中的含量。

由表4可知，经SP850树脂纯化的酒花多酚提取物中总多酚含量可达566.30mg/g纯化物，其中原花青素含量为312.48mg/g纯化物，在总多酚中占到55.18%。采用HPLC分析鉴定出10种单酚化合物，其中含量最高是芦丁，其次为金丝桃苷、表儿茶素、紫云英苷、异槲皮苷、没食子酸、黄腐酚、绿原酸、儿茶素、白藜芦醇。杨小兰等[20]研究表明，废酒花提取物能有效清除DPPH自由基，有较强的还原力和抗脂质过氧化力。这可能与酒花提取物中富含大量的原花青素和芦丁等多酚物质有关。此外，大量研究表明酒花中的单酚(芦丁、儿茶素、金丝桃苷等)具有优良的抗氧化效果[21-23]。

3 结 论

比较了3种树脂(SP850、HP20、HP2MGL)对酒花多酚提取物的静态吸附与解吸性能，筛选出了SP850树脂适合于分离纯化酒花多酚，其静态吸附率和解吸率分别为87.4%和78.4%。通过动态吸附和解吸实验，得到SP850树脂纯化酒花多酚的工艺条件为：上样液多酚质量浓度7.3mg/mL、上样量6BV、上样流速3BV/h、洗脱剂为60%的乙醇溶液、洗脱流速2BV/h、洗脱剂用量4BV、水洗用量5BV。此条件下酒花多酚的纯度由13.2%提高到了56.6%，该条件下酒花多酚的回收率为75.4%。

结果表明SP850树脂纯化酒花多酚具有吸附快、解吸较易、纯化效率高的优点，有利于规模化生产。

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