高效离子交换色谱法测定半乳糖、葡萄糖、
乳糖及低聚半乳糖含量

郑惠玲1，邓宝浣1,*，肖桂秋1，钟新林2

（1.量子高科（中国）生物股份有限公司，广东 江门 529081；

2.赛默飞世尔科技应用研究中心广州实验室，广东 广州 510070）

摘 要：建立离子色谱法定量测定以乳糖为原料、使用β-半乳糖苷酶生产的低聚半乳糖产品的方法。样品前处理过程中用体积稀释法代替质量稀释法，采用高效CarboPac PA20阴离子交换色谱柱和积分安培法检测，并对淋洗液组成进行优化。优化后的方法加标回收率90.58%～99.45%，相对标准偏差为3.54%。半乳糖、葡萄糖、乳糖的方法检出限分别为0.24、0.59、0.75µg/g。半乳糖和葡萄糖在0.2～7 µg/mL、乳糖在0.6～10µg/mL的范围内，其质量浓度与峰面积线性关系良好，相关系数在0.9992～0.9999之间。用此方法测定6种原料低聚半乳糖，目标组分总含量为95.84%～101.19%。

关键词：高效离子交换色谱；低聚半乳糖；积分安培

Determination of Galactose, Glucose, Lactose and Galacto-Oligosaccharide by

High Performance Ion Exchange Chromatography

ZHENG Hui-ling1, DENG Bao-huan1,*, XIAO Gui-qiu1, ZHONG Xin-lin2

(1. Quantum Hi-Tech Biological Co. Ltd., Jiangmen 529081, China;

2. Guangzhou Laboratory of Application and Research Centre, Thermofisher Scientific, Guangzhou 510070, China)

Abstract: A method was established to determine galacto-oligosaccharide (GOS), synthesized with β-galactosidase using lactose as the precursor, by ion exchange chromatography. The pre-treatment of samples was achieved through volume dilution instead of gravimetric dilution. CarboPac PA20 anion exchange column and pulsed amperometric detector were used to determine the contents of GOS. The recovery of the proposed method was 90.58%–99.45% and the relative standard deviation was 3.54%. The detection limits for gluctose, galactose and lactose were 0.24, 0.59 and 0.75 µg/g, respectively. The method presented linear correlation coefficients between 0.999 2 and 0.999 9 when the concentrations of gluctose and galactose were in the range of 0.2–7.0 µg/mL and lactose was 0.6–10 µg/mL. Six GOS samples were determined by this method to contain galactose, glucose, lactose and GOS in the range of 95.84%–101.19%.

Key words: high performance ion exchange chromatography; galacto-oligosaccharide (GOS); pulsed amperometric detector

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）06-0180-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201406039

低聚半乳糖产品作为新资源食品[1]被广泛应用在婴幼儿食品、乳制品、饮料、烘烤食品、糖果中[2-3]。低聚半乳糖成分组成复杂，是具有不同聚合度或同一聚合度但含有多个不同糖苷键异构体的寡糖混合物[4]。低聚半乳糖的主链以半乳糖为构成单元，链端常以单个葡萄糖结尾，单糖之间的β-糖苷键的连接方式以1→4半乳糖为主，此外还包括1→2半乳糖、1→3半乳糖、1→2葡萄糖、1→3葡萄糖、1→4葡萄糖、1→6葡萄糖等连接方式[5-6]。由于目前还无法制备所有组分的标准样品，不能进行低聚半乳糖各组分（包括半乳低聚二糖到半乳低聚八糖）的外标法检测。国内外的检测方法主要有薄层色谱法[7-8]、高效液相色谱法[9-11]、离子色谱法[12-13]。而高效液相色谱-示差检测法较为普遍使用[9]，但液相色谱柱的分离效果不够理想、示差检测器灵敏度较低。离子色谱作为液相色谱的一种，由于其优异的分离能力及配有高灵敏度的脉冲安培检测器，在糖的检测中得到越来越多的应用[14-18]。AOAC.2001.02[19]中推荐的离子交换色谱法是一种在国际上得到广泛应用的测定食品中低聚半乳糖含量的方法，但测定原料中低聚半乳糖含量的标准化方法未见报道。

本研究在AOAC.2001.02方法和前人研究的基础上，通过色谱柱选择、色谱条件优化、前处理方法优化，建立符合低聚半乳糖的质量检测要求[1]、能准确测定低聚半乳糖中葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖含量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈（色谱纯） 美国Tedia公司；氢氧化钠 美国Dionex公司；醋酸钠（色谱纯）、无水葡萄糖、半乳糖、乳糖标准品（≥99%）、β-半乳糖苷酶（Aspergillus oryzae） 美国Sigma公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾（分析纯） 西陇化工股份有限公司；99.9%氮气 金珠江气体有限公司；低聚半乳糖、低聚果糖产品（QHT） 量子高科（中国）生物股份有限公司；低聚半乳糖产品（Domo） 荷兰Borculo Domo Ingredients公司；0.22μm尼龙滤膜 天津市富集科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ICS-5000离子色谱仪（配有四元梯度泵、脉冲安培检测器、脱气装置、GM-3淋洗液混合器、柱温箱、AS-DV自动进样器、Chromeleon 6.8色谱工作站） 美国Dionex公司；FA2104型电子分析天平 上海良平仪器仪表有限公司；Casada BIO超纯水机 美国Pall公司；SHA-B型恒温振荡器 常州澳华仪器有限公司；TG1650-WS型离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；pHS-3C型pH计 上海康仪仪器有限公司；高效液相色谱仪（配有等度泵、示差检测器、柱温箱） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.0）：称取22.0 g磷酸二氢钾和6.0g三水磷酸氢二钾，溶于水中，稀释至1L，120 ℃高压灭菌器中灭菌30 min，备用。

2000 U/mL酶混悬液：取适量活性为8.9 U/mg的半乳糖苷酶，加入磷酸缓冲溶液配制成2000 U/mL的溶液。酶混悬液制备后需在8h内使用。

混合标准溶液的配制：分别称取100mg（精确至0.0001 g）半乳糖、无水葡萄糖、105.3mg乳糖（乳糖一水合物质量×0.95=无水乳糖）于100 mL容量瓶中，用超纯水定容，配制成质量浓度为1000 μg/mL的单一标准储备液。使用前根据需要，用超纯水稀释配制成不同质量浓度的混合标样。

1.3.2 样品前处理

称取0.1～0.2 g（精确至0.0001g）低聚半乳糖试样（按干基计），用80 ℃ 80 mL磷酸盐缓冲溶液溶解，然后转移到100 mL容量瓶中，用磷酸缓冲液定容，配制成1.0～2.0 mg/mL的测试样液。

样液A：取100mL的容量瓶标号为A，吸取10mL测试样液加水定容至100mL混匀，溶液过0.22μm滤膜过滤后稀释Di倍后进离子色谱仪测定低聚半乳糖中游离的半乳糖、葡萄糖、乳糖含量。

灭活样液B：在100mL容量瓶中加入1mL酶混悬液和1mL磷酸缓冲液，置于100℃水浴加热10min，使酶失活，放至室温后加入10mL测试样液；酶解样液C：在100mL容量瓶中加入10mL测试样液后再加入1mL酶混悬液和1mL磷酸缓冲液；然后将B和C容量瓶用锡箔纸密闭并摇匀，于（60±2）℃水浴恒温振荡器振荡30min（避免产生泡沫），取出后冰浴冷却至室温。B、C分别加入20mL 20%（V/V）乙腈，用水定容至100mL，混匀。分别取适量于离心管中，10000r/min离心10min，上清液过0.22μm滤膜，滤液分别稀释D1、D2 倍后测定。

1.3.3 色谱条件[13,19-20]

根据目标组分半乳糖和葡萄糖、乳糖与低聚半乳糖组分的分离效果，测定不同色谱柱、不同氢氧化钠和醋酸钠浓度（5～25 mmol/L）以得到分离度较好、分析时间较短的淋洗液洗脱梯度程序。

色谱柱：CarboPac PA20保护柱（3 mm×30 mm），CarboPac PA20分离柱（3 mm×150 mm，6.5 μm）；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃；进样量25µL；检测方式：Au电极，AgCl参比模式，脉冲安培检测，糖标准四电位波形；淋洗液洗脱梯度程序表1。

表 1 洗脱梯度程序

Table 1 Gradient elution program

%

注：a.开始进样和数据采集；b.停止数据采集。

1.3.4 方法检出限的测定

称取16.0mg半乳糖、13.3mg葡萄糖、43.2mg乳糖加水至100 g，混合均匀，分别称取7个混合液10 g，按1.3.2节中B处理方法处理后稀释5倍，进行离子色谱仪测定。能够被检出且在被分析物浓度大于零时能以99%置信度报告的最低浓度定为本方法的检出限[21]。方法检出限（method detection limit，MDL）按式（1）计算：

MDL=t（ν1＋ν2，1－α）×Spooled （1）

式中：ν1、ν2为自由度；t（ν1＋ν2，1－α）为自由度为ν1＋ν2时的Student’s t值（可查表得到），1－α为置信水平；Spooled为合成标准偏差。

1.3.5 方法回收率的测定

根据《中华人民共和国药典》[22]附录中关于中药质量标准分析方法验证指导原则，每100mg低聚半乳糖浆（干基）中添加约14mg乳糖。采用1.3.2节的B处理方法处理后稀释5倍，进行测定。按式（2）计算回收率：

（2）

式中：A为供试品中被测成分的质量/mg；B为加入对照品质量/mg；C为实测值/mg。

1.3.6 低聚半乳糖中葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖含量计算

按式（3）计算样品A中游离半乳糖、葡萄糖或乳糖的质量分数xi（干基）：

（3）

式中：Ai为A中最终的半乳糖、葡萄糖或乳糖质量浓度/（μg/mL）；Di为样液A的稀释倍数；m为样品质量（液体为称取样品中可溶性固形物的质量，固体为称取样品质量减去水分质量，下同）/g。

根据离子色谱分析结果，按下式计算初始样液B中游离的半乳糖含量、乳糖含量、乳糖释放的半乳糖含量以及水解产物C中总半乳糖含量，最终计算出低聚半乳糖的含量[6]。

按式（4）计算样品B中游离半乳糖乳糖的质量分数w1（干基）：

（4）

式中；A1为灭活样液B中最终的半乳糖乳糖质量浓度/（μg/mL）；D1为灭活样液B的稀释倍数；m为样品质量/g。

按式（5）计算灭活样液B中游离乳糖的质量分数w2（干基）：

（5）

式中：A2为灭活样液B中最终的乳糖质量浓度/（μg/mL）；D1为灭活样液B的稀释倍数；m为样品质量/g。

按式（6）计算灭活样液B中游离乳糖水解释放的半乳糖的质量分数w3（干基）：

w3=w2/1.9 （6）

按式（7）计算酶解样液C中总半乳糖的质量分数w4（干基）：

（7）

式中：A3为酶解样液C中最终的半乳糖质量浓度/（μg/mL）；D2为酶解样液C的稀释倍数；m为样品质量/g。

按式（8）计算酶解样C中低聚半乳糖水解释放半乳糖的质量分数w5（干基）：

w5=w4－w1－w3 （8）

按式（9）计算试样中低聚半乳糖的质量分数w6（干基）：

w6=w5×k （9）

式中：k为半乳糖转化为反式低聚半乳糖的经验换算系数，可由式（10）计算：

k=（180＋162n）/180n （10）

式中：n为低聚半乳糖分子中半乳糖部分的平均数。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

通过对比发现，PA20的稳定性、分离效果都比PA1要好。因此选择容量较低、灵敏度高、可实现样品快速分离的CarboPac PA20柱进行测定。

1.半乳糖；2.葡萄糖；3.乳糖。

图 1 样液（A）、灭活样液（B）、酶解样液（C）的色谱图

Fig.1 Chromatograms of diluted sample (A), inactivated solution (B) and enzymatic hydrolysate (C)

在淋洗液NaOH浓度为10 mmol/L时，半乳糖和葡萄糖的分离度达1.8，同时也保证了乳糖与低聚半乳糖组分的分离。与AOAC法[19]相比，该方法的半乳糖、葡萄糖、乳糖的分离度有所提高，分析时间缩短了10 min，淋洗液的消耗量减少一半。样品检测色谱图见图1。

2.2 样品前处理优化

AOAC 2001.02的样品前处理方法采用质量法，记录数据多，数据整理繁琐，而选择按体积进行稀释可减少数据记录、简化操作，使得结果计算更简便。以乳糖为目标组分，对同一糖浆使用质量稀释法和体积稀释法的5次平行检测结果的相对标准偏差为2.86%，2种方法之间无显著性差异，该前处理方法用于实际样品测定具有良好的重复性和较高的准确性。

表 2 糖浆中乳糖的检测结果（n=5）

Table 2 Deter mination results of lactose in syrup (n = 5)

2.3 方法检出限和线性范围

查表得置信水平为99%，自由度为6时的t值为3.143，得出半乳糖、葡萄糖、半乳糖的方法检测限分别为0.24、0.59、0.75µg/g。

表 3 重复测定结果

Table 3 Results of replicate determinations

µg/g

配制不同质量浓度（0.1～15µg/mL）的混合工作标准液进行测试，得出半乳糖和葡萄糖质量浓度在0.2～7µg/mL、乳糖质量浓度在0.6～10µg/mL的范围内与其峰面积具有良好的线性关系，3种糖的相关系数保持在0.9992～0.9999之间。

2.4 方法回收率

目前市场上缺乏低聚半乳糖标准品，因而无法进行直接添加低聚半乳糖标品的回收率实验，而乳糖是样品中含有的、也是本方法的目标组分，因此使用乳糖标准品进行回收率实验。共5个平行实验，结果见表4，回收率为90.58%～99.45%，相对标准偏差为3.54%，表明此法的准确度较高。

表 4 乳糖回收率测定结果（n=5）

Table 4 Recovery rates of lactose (n = 5)

2.5 实际低聚半乳糖样品检测

不同菌种来源的β-半乳糖苷酶通过不同工艺生产出的低聚半乳糖产品的结构比例上存在一定的差异[18]，使得不同低聚半乳糖产品的平均聚合度不同，而影响换算系数k值的大小。使用平均聚合度（n＋1）方法、利用高效液相色谱双柱法[8]对低聚半乳糖含量在30%～60%的QHT的12个样品分析检测，低聚半乳糖分子中半乳糖部分平均数为2.16，相对标准偏差为1.23%，得低聚半乳糖产品的经验换算系数k为1.36；而Domo浆状样品的k值为1.35。

随机抽取5个QHT的GOS-57L产品和1个Domo浆状样品，使用本法测定低聚半乳糖的含量，同时检测了1个低聚半乳糖和低聚果糖复配的糖浆样品（自制），低聚半乳糖含量为48.62%（理论值为50.19%），见表5。检测结果表明本方法既适用于测定以乳糖为原料、使用β-半乳糖苷酶生产的低聚半乳糖产品，也适用于含低聚半乳糖复合糖的检测。

表 5 6个低聚半乳糖样品的组分检测结果（n=6）

Table 5 Composition of 6 GOS samples (n = 6)

3 结 论

本研究选择灵敏度高的CarboPac PA20色谱柱建立快速准确检测样品中半乳糖、葡萄糖、乳糖含量及低聚半乳糖含量的方法。与AOAC 2001.02方法相比，该方法简化了样品处理过程，降低了检测成本，缩短了分析时间，提高了方法的灵敏度和定量分析的准确性。与高效液相色谱法相比，该法保证了半乳糖、葡萄糖、乳糖的分离，能准确测定半乳糖的变化量，从而测定低聚半乳糖的含量。该方法不仅适用于以乳糖为原料、使用β-半乳糖苷酶生产的低聚半乳糖产品的检测，也适用于含低聚半乳糖复合糖的检测。

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