樗叶花椒叶精油化学成分分析及其 周江菊,任永权,雷启义 (凯里学院环境与生命科学学院,贵州 凯里 556011)
摘 要:用水蒸气蒸馏法提取产自贵州的樗叶花椒叶精油,气相色谱-质谱联用法分离并分析鉴定其成分及相对含量,并研究精油的抗氧化活性和在模拟体外胃液条件下对亚硝酸根离子的清除率。在鉴定出的52种化合物中,主要成分为α-水芹烯(21.87%)、桉叶醇(13.12%)、(-)-松油烯-4-醇(9.55%)、γ-萜品烯(8.25%)、α-萜品烯(6.50%)、(-)-α-松油醇(6.31%)等;通过测定樗叶花椒叶精油对超氧阴离子自由基、羟自由基、2,2-二苯基-1-苦味肼基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和亚硝酸根离子的清除作用,研究精油体外抗氧化活性。结果表明:樗叶花椒叶精油对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基和亚硝酸根离子均有显著的清除活性,是一种天然的抗氧化剂和清除亚硝酸根离子的活性物质。 关键词:樗叶花椒;精油;化学成分;抗氧化活性;气相色谱-质谱法
Chemical Composition and Antioxidant Activities of the Essential Oil from Leaves of
ZHOU Jiang-ju, REN Yong-quan, LEI Qi-yi (College of Life and Environment Science, Kaili University, Kaili 556011, China)
Abstract: Essential oil was extracted from the leaves of Zanthoxylum ailanthoides Sieb. Et Zucc. collected from Guizhou by hydrodistillation, and its chemical composition was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. Meanwhile, the antioxidant activities and nitrite scavenging activity of the essential oil in vitro under simulated gastric conditions were analyzed. A total of 52 components were identified from the essential oil with α-phellandrene (21.87%), eucalyptol (13.12%), (-)-terpinen-4-ol (9.55%), γ-terpinene (8.25%), α-terpinene (6.50%), and (-)-α-terpineol (6.31%) being predominant among them. It had significant scavenging activity against superoxide anion, hydroxyl and DPPH free radicals, as well as nitrite. Therefore, the essential oil from the leaves of Zanthoxylum ailanthoides Sieb. Et Zucc. is a natural antioxidant with the ability to scavenge nitrite. Key words: Zanthoxylum ailanthoides Sieb. Et Zucc.; essential oil; chemical components; antioxidant activities; gas chromatography-mass spectrometry 中图分类号:TQ651.2;R284.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)06-0137-05 doi:10.7506/spkx1002-6630-201406029 花椒(Zanthoxylum bungeanum)是芸香科花椒属植物,其成熟果皮和叶富含挥发油,在我国有着悠久的使用历史,不仅是常用的食品调味料,也是一种传统的中药材。现代研究表明,花椒主要由挥发油、酰胺类物质、生物碱、香豆素、木脂素等物质组成[1],具有镇痛平喘、止咳祛痰、抗炎、抑制血小板凝结、抗腹泻、抗溃疡等医学药理活性[2]和降血压、保肝利胆、抗氧化、改善肠胃状况等保健功能[3-4]。樗叶花椒(Zanthoxylum ailanthoides Sieb. et Zucc.),别名椿叶花椒、食茱萸、木满天星、刺椒,其果实和叶常用作天然食用香料和中草药,叶能外用治毒蛇咬伤肿痛及外伤出血[5]。已有文献报道了产自日本的樗叶花椒叶的溶剂提取物的化学成分研究[6-7],吴刚等[8]对产自安徽芜湖的樗叶花椒叶的挥发油化学成分进行了研究,但目前对樗叶花椒叶精油的抗氧化活性研究鲜见报道。本研究提取了产自贵州黔东南的野生樗叶花椒叶精油,采用气相色谱-质谱联用(gas chromaatography,GC-MS)技术对其化学成分进行详细研究,并研究了精油对超氧阴离子自由基、羟自由基和有机自由基的清除活性以及在模拟体外胃液条件下对亚硝酸根的清除活性,为樗叶花椒叶在食品、医疗保健品等方面的开发应用提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 樗叶花椒叶于2012年7月采于贵州省黔东南州剑河县。 2,2-二苯基-1-苦味肼基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazy,DPPH)自由基(>90%) 美国Sigma-Aldrich公司;邻苯三酚、邻二氮菲、对氨基苯磺酸、N-(1-萘基)-乙二胺盐酸、亚硝酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、盐酸、硫酸亚铁、无水乙醚、无水硫酸镁(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;高纯氩(纯度为99.999%) 贵阳市裕鹏贸易有限责任公司。 1.2 仪器与设备 GC6890/MS5975气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司;722/722S型光栅分光光度计 上海精密仪表仪器有限公司;植物精油提取装置(玻璃仪器)。 1.3 方法 1.3.1 樗叶花椒叶精油的提取及其化学成分分析 新鲜的樗叶花椒叶在室内阴干5d,剪碎,取碎末300g放入三口烧瓶中,加入适量蒸馏水,按文献[8]挥发油提取法提取精油,作GC-MS分析。 1.3.1.1 色谱条件 色谱柱:DB-5MS(30m×0.25 mm,0.25μm);载气为氦气;流速5.6 mL/min;升温程序:柱初温40 ℃,保持3 min,以15 ℃/min上升到100 ℃,再以8 ℃/min升温至260 ℃,保温4 min;进样口温度250 ℃;柱内载气流量0.5 mL/min;进样量1 μL;分流比150∶1。 1.3.1.2 质谱条件 电子电离源;离子源温度230 ℃;接口温度280 ℃;质量扫描范围m/z 30~400;电离电压70eV;溶剂延迟时间2.0 min。 1.3.1.3 数据处理 化合物的相对含量采用峰面积归一化法计算;根据NIST 08和Wiley 275图库检索,并与标准谱图对照解析对化合物进行定性分析。 1.3.2 樗叶花椒叶精油抗氧化活性测定 1.3.2.1 超氧阴离子自由基清除活性的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定樗叶花椒叶精油对超氧阴离子自由基的清除活性。在一定条件下,邻苯三酚能够发生自氧化产生超氧阴离子自由基,在299nm波长处有吸收峰,加入一定量的精油溶液可对超氧阴离子自由基有不同的抑制作用,进而导致吸光度的变化。取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)4.5 mL,置于25 ℃水浴中预热25 min,加入1 mL一定质量浓度的精油乙醇溶液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL) E/%=(A0-Ai)/A0×100 (1) 式(1)中:A0为空白组的吸光度;Ai为样品吸光度。 1.3.2.2 羟自由基清除活性测定 邻二氮菲-Fe2+是常用的氧化-还原指示剂,其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态改变。H2O2-Fe2+体系通过芬顿反应产生羟自由基,邻二氮菲-Fe2+溶液可被自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+,从而使邻二氮菲-Fe2+在536nm波长处的最大吸收峰消失或降低。 损伤管:取1.0 mL 0.75 m mol/L的邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中,依次加入2.0 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和0.5 mL无水乙醇,加入新配制的0.75 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL,混匀,加入新配制的0.01% H2O2(V/V)1.0 mL,于37 ℃水浴加热1h后,在536nm波长处测定吸光度(A损伤)。 样品管:以0.5 mL一定质量浓度精油乙醇溶液,代替损伤管中0.5 mL的无水乙醇,在536nm波长处测吸光度(A样品)。 未损伤管:以1 mL蒸馏水代替损伤管中的0.01% H2O2,操作方法同损伤管处理方法,在536 nm波长处测定未损伤管的吸光度(A未损伤)。 对照组:以0.5 mL相同质量浓度的抗坏血酸乙醇溶液代替精油溶液。 精油对羟自由基的清除率(E)按式(2)计算: E/%=(A样品-A损伤)/(A未损伤-A损伤)×100 (2) 1.3.2.3 有机自由基清除活性的测定 DPPH自由基是一种稳定的有机自由基,其乙醇溶液呈紫红色,在可见光区最大吸收峰为525 nm,当存在自由基清除剂时,可与其单电子配对而使其吸收峰逐渐消失,褪色程度与其所接受的电子数成定量关系,因而可用分光光度法进行定量分析。将DPPH溶于少量甲醇后,用50%乙醇配制为120μmol/L的溶液。反应时加入0.2 mL一定质量浓度的精油乙醇溶液和3.8 mL DPPH溶液,室温下静置20 min后,测定其在525 nm波长处的吸光度。对照组以0.2 mL相同质量浓度的抗坏血酸溶液代替精油溶液。精油对DPPH自由基的清除率(E)由式(3)计算: E/%=(A0-A)/A0×100 (3) 式(3)中:A0为未加样的DPPH溶液(0.2 mL 50%乙醇+3.8 mL DPPH)的吸光度;A为样品与DPPH溶液反应后的吸光度。 1.3.3 体外模拟胃液的NO2-清除活性的测定 亚硝酸盐在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮化后,再与N-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐偶合生成红色络合物,在538 nm波长处有最大吸收峰,可用分光光度法测定其吸光度,确定其浓度。因亚硝酸盐浓度与吸光度呈良好的线性关系,本研究以亚硝酸钠为对照品,直接以其吸光度为考察指标计算清除率。取4支25 mL比色管分别记为a、b、c、d,准确吸取2 mL 5mg/L亚硝酸钠标准溶液2份,分别加入a和c管中,吸取5 mL一定质量浓度的精油乙醇溶液2份,分别加入a管和b管中,4支管均用pH 3的柠檬酸缓冲溶液定容至10 mL,混匀后具塞置于37 ℃恒温水浴中避光反应30 min,反应完成后准时取出各管。在4支管中分别加入2 mL 0.4%的对氨基苯磺酸溶液,摇匀,反应5 min,再都加入0.2%的N-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐溶液1.0 mL,摇匀,反应15 min后在最大吸收波长538 nm处以b管为参比,测得a管的吸光度A;以d管为参比,测得c管的吸光度A0。对照组以5.0 mL相同浓度的抗坏血酸溶液代替精油乙醇溶液。精油溶液对NO2-清除率(E)按式(4)计算: E/%=(A0-A)/A0×100 (4) 2 结果与分析 2.1 樗叶花椒叶精油化学成分
图 1 樗叶花椒叶精油总离子流图 Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from leaves of Zanthoxylum ailanthoides Sieb. et Zucc. 从樗叶花椒叶精油中共分离出60个峰(图1),鉴定出其中52种化合物成分,占精油总量的98.7%,鉴定结果如图1和表1所示。鉴定出的化合物中有10种单萜化合物、12种单萜醇类衍生物、3种单萜酯类衍生物、11种半倍萜化合物、6种半倍萜含氧衍生物、2种二萜类含氧衍生物化合物、4种酮类化合物、1种醛类化合物、1种羧酸类化合物、1种芳香化合物和1种烯醇化合物。 表 1 樗叶花椒叶精油化学成分分析结果 Table 1 Chemical composition of the essential oil from leaves of Zanthoxylum ailanthoides Sieb. et Zucc.
在精油的主要化学成分中,α-水芹烯(21.87%)具有黑胡椒和薄荷香气[9],为神农香菊挥发油的主要组分[10],具有辛凉解表、清热的作用;桉叶醇(13.12%)有樟脑气息和清凉的草药味道[9],是甘青青兰[11]、厚朴叶[12]等中药材的挥发油的主要组成部分,具有清肝胃之热、广谱抗菌、镇咳、保护心脑血管、抗溃疡以及抗凝血等作用;(-)-松油烯-4-醇(9.55%)呈木香、凉香、柑橘香和辛香;γ-萜品烯(8.25%)、α-萜品烯(6.50%)具有柑橘和柠檬香气,用于配制人造柠檬和薄荷香精油;(-)-α-松油醇(6.31%)具有似紫丁香花香气,稀释后有桃子香味;萜品油烯(3.78%)具有柠檬香气,α-蒎烯(3.63%)、β-蒎烯(3.04%)具有树脂和松脂香气[9]; 含量较低的化学成分中,莰烯具有樟脑油香气,α-紫罗兰酮呈暖的木香和较强的紫罗兰香气,二氢-α-紫罗兰酮由α-紫罗兰酮部分氢化而成,呈鸢尾和紫罗兰香气[9];雪松醇具有柏木香气[14],不仅是杀虫剂[15-16],还是血小板活化因子受体结合抑制剂[17];棕榈酸对乳腺癌细胞具有一定的抑制作用和细胞凋亡诱导活性[18];石竹烯氧化物是岩败酱[19]、蓝布正[20]和鱼腥草[21]等中药材的挥发油的重要组分,具有舒肝、镇痛、降压、调经、祛风除湿、清热解毒、利尿消肿的功效;匙叶桉油烯醇具有祛痰、杀菌、治疗哮喘等作用[14],含有匙叶桉油烯醇的挥发油具有较强的抗微生物生长活性[22];叶绿醇及其代谢产物均可以激活过氧化酶体增殖激活物受体和视黄醇受体[23]。 2.2 樗叶花椒叶精油的抗氧化活性 超氧阴离子自由基和羟自由基是人体在正常的生命活动中通过新陈代谢产生的,大量研究证明,自由基会造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤而导致生物衰老和某些疾病的发生。 如图2所示,樗叶花椒叶精油对3种自由基具有较为明显的清除作用,随其质量浓度的增加,清除率升高,精油质量浓度达到2.5 mg/mL
图 2 樗叶花椒叶精油对超氧阴离子自由基(A)、羟自由基(B)、 Fig.2 Scavenging effects of the essential oil from leaves of Zanthoxylum ailanthoides Sieb. et Zucc. on superoxide anion (A), hydroxyl (B) and DPPH (C) free radicals 2.3 体外模拟胃液的NO2-清除活性 形成亚硝胺的前体物质(亚硝酸根)大量存在于食物及体内代谢过程中,亚硝胺是很强的致癌物质,阻断亚硝胺合成或消除亚硝胺的前体,是防止治癌症产生的有效途径之一。如图3所示,樗叶花椒叶精油对亚硝酸根离子的清除率随精油质量浓度的增加而增加,当精油质量浓度为4.0 mg/mL时,对亚硝酸根离子的清除率可以达到86.2%。精油和抗坏血酸对亚硝酸根离子清除率的IC50分别为0.8 mg/mL和0.6 mg/mL,樗叶花椒叶精油与抗坏血酸对亚硝酸根离子的清除能力相当,说明樗叶花椒叶精油在模拟人体胃液条件下有明显的清除亚硝酸盐的能力。
图 3 樗叶花椒叶精油对亚硝酸根离子的清除作用 Fig.3 Scavenging effects of the essential oil from leaves of Zanthoxylum ailanthoides Sieb. et Zucc. on NO2- 3 结 论 通过以上研究可知,樗叶花椒叶精油的主要化学成分(相对含量高于1.0%)为:α-水芹烯(21.87%)、桉油醇(13.12%)、(-)-松油烯-4-醇(9.55%)、γ-萜品烯(8.25%)、α-萜品烯(6.50%)、(-)-α-松油醇(6.31%)、萜品油烯(3.78%)、α-蒎烯(3.63%)、β-蒎烯(3.04%)、2-侧柏烯(2.89%)、顺式-β-萜品醇(2.29%)、β-水芹烯(1.76%)、顺式-α-萜品醇(1.72%)、α-芳樟醇(1.44%)、大根香叶烯(1.41%)、石竹烯(1.06%)和顺式-对-2-烯-1-醇(1.01%),共17种物质,占总含量的89.63%。α-蒎烯、桉叶醇、α-紫罗兰酮、芳樟醇和雪松醇等多种化学成分具有不同的香气,且α-水芹烯、芳樟醇、棕榈酸、石竹烯氧化物、匙叶桉油烯醇、雪松醇和叶绿醇等组分有一定药效。因此对樗叶花椒叶丰富的资源可以进一步加以利用,开发为附加值较高的抗衰老保健用品或抗癌保健食品辅料和功能因子。 樗叶花椒叶精油具有较明显的抗氧化活性,精油对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基清除率的IC50分别为1.5、1.8 mg/mL和1.1 mg/mL。4.0 mg/mL的樗叶花椒叶精油对3种自由基的清除率分别达到70.2%、76.3%和80.7%。另外,在体外模拟胃液条件下,樗叶花椒叶精油对亚硝酸根离子有明显的清除作用,其IC50为0.8 mg/mL,质量浓度为4.0 mg/mL时,其清除率达到86.2%。但樗叶花椒叶精油的抗氧化活性和清除亚硝酸盐的作用机制还需作进一步的研究。 参考文献: [1] 付陈梅, 阔建全, 陈宗道, 等. 花椒的成分研究及其应用[J]. 中国食品添加剂, 2003(4): 83-85; 122. [2] 袁娟丽, 王四旺. 花椒的化学成分及其药效学研究[J]. 现代生物医学进展, 2010, 10(3): 552-554. [3] 朱雪, 王亮. 花椒药理作用研究进展[J]. 社区医学杂志, 2010, 8(7): 43-45. [4] 尹靖先, 彭玉华, 张三印. 花椒药用的研究进展[J]. 四川中医, 2004, 22(12): 29-31. [5] 春华本草编委会. 春华本草: 第四卷[M]. 上海: 上海科技出版社, 1999: 968. [6] Morita N, Shimizu M. Studied on the medical resourses. ⅩⅩⅤ. The components in the root bark of Zanthoxylum ailanthoides Engl[J]. Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 1966, 86(8): 732-734. [7] Morita N, Fukata M. Studies on the medical resourses. ⅩⅩⅦ. Components of Fagara plants (Rutaceae)[J]. Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 1967, 87(3): 319-320. [8] 吴刚, 秦民坚, 张伟, 等. 椿叶花椒叶挥发油化学成分的研究[J]. 中国野生植物资源, 2011, 30(3): 60-63. [9] 凌关庭, 唐述潮, 陶民强. 食品添加剂手册[M]. 3版. 北京: 化学工业出版社, 2003: 219-533. [10] 谢超. 神农香菊抗氧化活性及其应用研究[D]. 武汉: 湖北中医药大学, 2012: 30. [11] 徐中海, 格桑索朗, 吴瑛, 等. 气相色谱-质谱法研究藏药甘青青兰挥发油成分[J]. 分析试验室, 2008, 27(6): 42-46. [12] 蒋军辉, 徐小娜, 杨慧仙, 等. GC-MS联用技术结合化学计量学方法分析厚朴叶挥发油成分[J]. 分析测试学报, 2012, 31(5): 523-529. [13] 陈青, 姚蓉君, 张前军. 固相微萃取气质联用分析野茉莉花的香气成分[J]. 精细化工, 2007, 24(2): 159-161. [14] 徐年军, 白海波, 严小军, 等. 山腊梅中挥发油成分分析[J]. 分析测试学报, 2006, 25(1): 90-93. [15] Sabine J R. Exposure to an environment containing the aromatic red cedar, Juniperus virginiana: procarcinogenic, enzyme inducing and insecticidal effects[J]. Toxicology, 1975, 5(2): 221-235. [16] CHANG S T, CHENG S S, WANG S Y. Antitermitic activity of essential oils and components from Taiwania (Taiwania cryptomerioides)[J]. Journal of Chemical Ecology, 2001, 27(4): 717-724. [17] Yang H O, SuH D Y, Han B H. Isolation and characterization of platelet-activating factor receptor bringing antagonists from Biotaorientalis[J]. Planta Medical, 1995, 61(1): 37-40. [18] 刘睿, 顾谦群, 崔承彬, 等. 密脉鹅掌柴的化学成分及抗肿瘤活性[J]. 中草药, 2005, 35(3): 328-333. [19] 张文蘅, 陈虎彪. 岩败酱挥发油化学成分的研究[J]. 中药材, 1999, 22(8): 403-404. [20] 周欣, 梁光义, 王道平, 等. 蓝布正挥发油化学成分的GC-MS分析[J]. 分析测试学报, 2002, 21(4): 82-84. [21] 曾志, 石建功, 曾和平, 等. 有机质谱学在中药鱼腥草研究中的应用[J]. 分析化学, 2003, 31(4): 399-404. [22] Demetzos C, Katerinopoulos H, Kouvarakis A, et al. Composition and antimicrobial activity of the essential oil of Ciatus creticus subsp. eriocephalus[J]. Planta Medical, 1997, 63(5): 477-479. [23] 林厦菁, 朱晓彤, 江青艳, 等. 叶绿醇对脂肪细胞分化及糖脂代谢的调节作用[J]. 动物营养学报, 2012, 24(10): 1866-1870. [24] Tepe B, Donmez E, Unlu M, et al. Antibacterial and antioxidative activities of the essential oils and methanol extracts of Salvia cryptantha (Montbret et Aucher ex Benth.) and Salvia multicaulis (Vahl)[J]. Food Chemistry, 2004, 84(4): 519-525. [25] Ruberto G, Baratta M. Antioxidant activity of selected essential oil components in two lipid model systems[J]. Food Chemistry, 2000, 69(2): 167-174. 收稿日期:2013-06-03 基金项目:贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目(黔省专合字[2011]77号) 作者简介:周江菊(1966—),女,教授,学士,研究方向为植物资源开发和生物多样性保护。E-mail:zhoujiangju@163.com |
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