鱼腩中假单胞菌预测模型的建立与货架期预测

宋志强，刘超群，侯温甫*

(武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023)

摘 要：以鲜切鱼腩为研究对象，对鱼腩进行感官品质的评分，绘制感官评分随时间变化的曲线；测量0～7d内鱼腩挥发性盐基氮的含量变化；并根据恒定温度条件下的活菌数以及利用Gompertz一级模型得到的预测值，绘制不同温度条件下假单胞菌的实际和预测生长曲线；通过计算偏差因子和准确因子，验证一级模型的预测效果；同时利用平方根模型构建假单胞菌的二级模型，描述了最大比生长速率和延滞期与温度变化的关系；最后以0℃为贮藏参考温度，利用预测模型预测鱼腩的剩余货架期。并通过实际和预测货架期进行比较，验证预测货架期的可靠性。结果表明：感官品质的评分随着贮藏温度的升高和时间的延长而逐渐降低；挥发性盐基氮含量随着贮藏温度的升高和时间的延长而逐渐增加；实际和预测生长曲线的重合度较好；一级模型的验证结果均在1左右，说明模型拟合较好；结果证明预测货架期较为可靠。

关键词：鱼腩；假单胞菌；货架期；预测模型

Predictive Modeling of Pseudomonas spp. Growth in Fish Belly and Shelf Life Prediction

SONG Zhi-qiang，LIU Chao-qun，HOU Wen-fu*

(College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：Sensory evaluation of fresh fish belly was made and plotted as a function of storage time. Changes in total volatile basic nitrogen (TVB-N) over the storage period of 7 days were measured and observed and predicted growth curves of Pseudomonas spp. were plotted based on according to the results of viable counts and predicted results from the Gompertz model under different temperatures. Bias factor and accuracy factor were used to verify the accuracy of the first-order model, and the result was close to 1, indicating that the model was fitted well. Belehradek model was used to describe the correlation between temperature and growth parameters of Pseudomonas spp. The prediction model presented in this study could be used to predict the shelf life of fish belly. Comparison between the observed and the predicted shelf life of fish belly was carried out to reveal the reliability of shelf-life prediction for fish belly.

Key words：fish belly；Pseudomonas；shelf life；prediction model

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0292-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322059

草鱼(grass carp)属鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科、草鱼(Ctenopharynodon idellus)属。草鱼的俗称有鲩、黑青鱼等。草鱼生长快、个体大、味鲜美，而且有暖胃和中之功效，所以被人们所喜爱。但冷鲜鱼肉极易腐败，鱼肉腐败的原因主要是自我分解、细菌生长和新陈代谢过程中导致了不良风味组分的形成、酯类化学氧化等，其中影响鱼类品质的最主要因素是微生物的活动[1]。但水产品中所含的微生物只有部分微生物参与腐败过程[2]。这些产生腐败臭味和代谢产物的微生物，就是该产品的特定腐败菌[3]。

假单胞菌是一类需氧的革兰氏阴性菌，呈杆状，在冷藏条件下能够快速生长。当在温度是唯一或主要的限制因素的条件下，在冷藏食品中假单胞菌的生长速率要比其他污染细菌的生长速率快30%[4]，冷鲜鱼肉又是假单胞菌的理想生长介质[5]，假单胞菌是引起肉类食品中蛋白快速腐败的主要菌之一。通过建立预测模型可以描述微生物在肉品中的生长特性[6]，因此对于冷鲜鱼肉的快速评估可以应用假单胞菌生长预测模型的建立。虽然目前已有报道不同来源[7-10]不同种类微生物[10-13]的生长预测模型，但是国内外有关冷鲜鱼肉中微生物生长预测模型的研究很少。

本实验以新鲜草鱼鱼腩中分离的假单胞菌为研究对象，由专业人员对新鲜鱼腩进行感官品质的逐日评分，测定不同贮藏温度条件下挥发性盐基氮的含量变化，并研究假单胞菌在0～15℃条件下的生长情况，应用修正的Gompertz函数和平方根模型拟合，建立其生长预测模型。通过预测模型预测草鱼鱼腩的货架期，验证其可靠性，旨在为水产品的低温流通和货架期的快速评估等应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品、试剂与培养基

草鱼购自湖北省武汉市当地超市。

氯化钠(优级纯) 国药集团化学试剂有限公司；CFC假单胞菌选择性培养基(CFC琼脂培养基9.88g、甘油2g、蒸馏水200mL，摇匀后高压灭菌待用，使用前加入CFC添加剂) 青岛高科技园海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器(灭菌锅)、BMJ-160型霉菌培养箱 上海博讯实业有限医疗设备厂；STD-XG型食品安全快速检测仪 厦门斯坦道科学仪器股份有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；MIR-154型低温恒温培养箱 三洋电机株式会社；HPX-9028MBE型电热恒温培养箱、DHP-9082型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；DNP-9082型电热恒温培养箱 上海精宏试验设备有限公司；HBM-400系列样品均质器 天津市恒奥科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

草鱼即杀后，进行精细分割制成宽3～5cm、长8～10cm的草鱼鱼腩制品，置于托盘中并用保鲜膜封口，然后分别置于0、5、10、15℃ 4个恒定温度条件下贮藏。所有操作均在经清洗、臭氧消毒后的良好的卫生条件下进行。

1.3.2 感官评价系统的建立

表 1 草鱼鱼腩感官评分表

Table 1 Criteria for sensory evaluation of fish belly

感官评价系统建立，由本实验室两名在水产加工和感官评价领域内研究较深的专业人员对水产方向学员进行培训，组成6人评分小组，对贮藏在0、5、10、15℃ 4种温度条件下的鱼腩进行逐日记录，并建立感官评分表，评分标准按宋智等[14]方法略做修改进行。每项满分为10分，消费者可接受的最低限为5分。表1为草鱼鱼腩感官评分表。

1.3.3 挥发性盐基氮指标测定

用食品安全快速检测仪进行测定，准确称取3g草鱼鱼腩于50mL旋盖塑料盒中；加入1号提取液0.5mL，混匀，当肉沫变白后加入16mL蒸馏水，盖紧盖子后上下振荡数次，放入超声波中超声15min；取出，加入0.5mL提取液2号和10mL蒸馏水，振荡混匀；取上清液1mL到样品杯中，加7mL蒸馏水，混匀，作为样品处理液；向比色瓶中加入2.5mL处理液并加入检测液A，放入快速检测仪中调零；取出后再加入检测液B 4滴，混匀，放入37℃恒温水浴锅中水浴10min；取出，把比色瓶擦干净，放入仪器进行检测。

1.3.4 微生物培养

根据GB 4789.2—2008《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》操作[15]。

1.3.5 一级模型的拟合与验证

应用SAS 9.1统计软件，采用Gompertz模型[16]拟合在不同温度条件下获得的热杀索丝菌的生长数据，得到相应的一级模型参数。Gompertz方程如式(1)所示：

lgNt=N0＋C•exp{－exp[－B(t－M)]} (1)

式中：C为随时间无限延长时菌增量的对数值(lg(CFU/g))；B为在时间为M时的相对最大比生长速率/d-1；t为贮藏时间/d；Nt为t时的菌数/(CFU/g)；M为达到相对最大生长速率所需要的时间/d。

得到上述参数后，通过公式：U=BC/e(式中： e=2.7182)、LPD=M－(1/B)分别求出最大比生长速率U((lg(CFU/g))/d)和迟滞期LPD(d)。通过计算准确因子(Af)和偏差因子(Bf)来验证一级模型的预测效果[11]。计算准确因子Af和偏差因子Bf的公式如式(2)和式(3)所示。

(2)

(3)

式中：Obs为实验观测值；Pred为实验预测值；n为实验次数。

1.3.6 二级模型的拟合与验证

二级模型利用SAS 9.1统计软件，采用平方根模型拟合温度-生长速率平方根(T-U1/2)与温度-延滞期倒数平方根(T-LPD-1/2)的关系。研究温度对一级模型参数的影响。采用F统计量验证二级模型总体显著性。其关系式如式(4)、(5)所示：

(4)

(5)

式中：T为培养温度；TminU、TminL为最低生长温度，是一个假设的概念，指微生物没有代谢活动时的温度，通过外推回归线与温度轴相交而得到；b为系数。

1.3.7 货架期预测模型的建立与验证

草鱼多以冷链流通，所以将0℃作为贮藏的参考温度。公式(6)为货架期的预测模型，模型由一级模型和二级模型推导得出。得到的预测货假期与实际货架期进行比较，验证其可靠性。

SL=LPD－[(Nmax－N0)/2.718U]×{ln[－ln[(Ns－N0)/(Nmax－N0)]－1} (6)

式中：Nmax是稳定期时的最大菌落数(lg(CFU/g))；Ns是腐败限控菌落数(lg(CFU/g))；N0是初始菌数(lg(CFU/g))。

2 结果与分析

2.1 不同恒定温度条件下草鱼鱼腩感官评价结果

图 1 鱼腩在不同恒定温度条件下的感官评分

Fig.1 Sensory evaluation of fish belly at different temperatures

图1显示，随着贮藏温度的升高，感官评分下降的趋势越来越明显。这是因为草鱼在宰杀后，由于肌肉组织的呼吸作用停止，所以肌肉内部发生糖原分解和ATP降解作用，产生了乳酸、磷酸等酸性物质，肌肉会呈僵直收缩的状态。此时的鱼腩切面富有光泽，组织致密完整，而且富有弹性，具有浓郁的香味[17]。所以感官评分为“好(10分)”。随着时间的延长，蛋白质水解产生大量代谢产物，为微生物提供良好的生长环境，使微生物大量繁殖。又因为长时间存在于酸性环境下，肌肉出现软化，色泽暗淡，有腥臭味的现象，感官评价逐渐下降。在0℃条件下，在第6天之前，感官品质处于可以接受范围内，第7天已经不能接受；5℃条件下在第4天之前感官品质可以接受，而后不能接受；10℃条件下第3天之前可以接受；15℃条件下在第2天之后已经不能接受。可知温度越高，感官品质达到不可接受的时间越快。

2.2 挥发性盐基氮(TVB-N)指标测定结果

TVB-N值是评价水产品质量的重要指标，在冷鲜鱼肉腐败过程中，在微生物作用下蛋白会发生分解，产生碱性含氮的物质，这些含氮物质与有机酸反应生成挥发性的盐。其中淡水鱼的TVB-N值应该小于20mg/100g，才符合卫生标准[18]。

图 2 不同恒定温度条件下鱼腩的TVB-N值变化

Fig.2 Change in TVB-N content in fish belly at different temperatures

由图2可以看出，随着贮藏温度的升高，TVB-N含量也逐渐增加。贮藏在0℃的鱼腩变化不大，到了第5天才略有下降。这是因为低温环境下抑制了鱼腩中酶的活性，使鱼腩受到的降解作用降低。贮藏在5℃的鱼腩，第5天之前也变化不大，到第7天增加到28.8mg/100g，超出了卫生标准的范围。10℃条件下的鱼腩第3天时为17.8mg/100g，到第4天快速增加，到了第5天已经超出仪器的测量范围。15℃条件下的鱼腩在1.5d时为16.8mg/100g，到第2天快速增加，到第3天已经超出测量范围。

2.3 模型的拟合与验证

2.3.1 一级模型的拟合

利用Gompertz模型对假单胞菌的生长动态进行拟合，获得的生长动力学模型和参数如表2所示。

表 2 不同温度条件下假单胞菌的生长动力学模型和参数

Table 2 Growth kinetic model and parameters of Pseudomonas spp. at different temperatures

由表2可知，判定系数R2的值较高，在0.99以上，表明Gompertz模型能很好地描述不同温度条件下假单胞菌的生长情况[19]，同时P均小于0.0001，所以在显著性差异上也说明这一结论。这与李学英[20]、唐晓阳[21]等的研究结果一致。利用Gompertz模型求得的假单胞菌生长动力学参数显示：0℃条件下最大比生长速率较低，为0.6626d-1，延滞期长达2.8985d，此时假单胞菌的生长处于抑制状态，随着温度的升高，比生长速率急剧增加，延滞期迅速缩短。当温度升高到15℃时，比生长速率增加到2.8305d-1，延滞期缩短至0.2786d。

根据假单胞菌在恒定温度条件下的活菌计数结果和利用Gompertz模型求得的预测结果，绘制了0、5、10、15℃条件下实际值和预测值的时间-菌落数曲线，得到假单胞菌在不同温度条件下的生长趋势。

图 3 不同温度条件下假单胞菌生长实际值和预测值

Fig.3 Predicted and observed growth curves of Pseudomonas spp. at different temperatures

图3显示的是根据恒定温度条件下的活菌数以及利用Gompertz一级模型得到的预测值，绘制不同温度条件下假单胞菌的实际和预测生长曲线。从图3可以看出，假单胞菌的生长速率与温度的变化有较大的联系，温度越低假单胞菌生长速度越慢。贮藏在0℃条件下的假单胞杆菌生长缓慢，贮藏在5℃条件下的假单胞杆菌的生长速率明显比0℃的快，而在第5天开始急剧增长，到第6天达到最大值，以后逐渐趋于平缓并呈现下降趋势，表明假单胞菌达到衰亡期。10℃到第1天开始急剧增长，到第4天后趋于平缓，表明已经达到稳定期。15℃从第0天开始急剧增长，第3天达到最大值，以后呈下降趋势到达衰亡期。同时利用Gompertz模型求得的预测结果与实际值基本重叠，可以直观地判断Gompertz模型能对假单胞菌生长动态的拟合具有较好的效果。

2.3.2 一级模型的验证

通过公式(1)和(2)计算得到偏差因子和准确因子的值如表3所示。准确因子是用来评价预测模型的预测准确度的指标，偏差因子是用来评价预测值和实测值的差异程度的指标。准确因子的值越大表明预测效果越差，当准确因子值为1时预测效果最为理想[22]。Ross[23]认为，对于微生物生长模型的验证，如果Bf值在0.90～1.05的范围之内，认为该模型能够很好地预测微生物生长速度和生长状况；如果Bf值在0.7～0.9或者1.06～1.15范围之内，则该模型是可以被接受的；如果Bf值大于1.15或者小于0.7，则说明该模型是失败的。从表3可以看出模型的Bf均在0.9～1.05之间，Af均接近1。表明模型能很好地预测假单胞菌在不同温度条件下的生长情况。

表 3 预测模型的验证

Table 3 Evaluation of the predictive models using the bias factors and accuracy factors

2.3.3 二级模型拟合

用平方根模型拟合温度对微生物生长的影响。温度与比生长速率的模型为方程(7)，温度与延滞期的模型为方程(8)。应用平方根模型拟合温度与比生长速率延滞期的关系见图4。

(7)

(8)

图 4 温度与最大比生长速率(A)和延滞期(B)的关系

Fig.4 Relationship between temperature and maximum specific
growth rate or lag phase

根据图4可以看出，温度与比生长速率以及延滞期判定系数R2分别为0.9689和0.9597，说明温度与比生长速率以及延滞期之间的线性关系良好。

2.3.4 二级模型的验证

二级模型总体的显著性是利用F统计量进行验证。结果得到温度与比生长速率模型和温度与延滞期模型的P值分别为0.0204和0.0157，都小于0.05，所以方程显著。表明此方程能较好地描述温度与比生长速率以及延滞期之间的关系。

2.4 货架期的预测与验证

2.4.1 货架期的确定

通过菌落总数、感官评分、TVB-N值确定0℃条件下草鱼鱼腩的货架期。表4为0℃条件下草鱼鱼腩的各指标参数。

表 4 0℃条件下草鱼鱼腩各指标参数

Table 4 Quality parameters of fish belly stored at 0 ℃

由表4可知，通过感官观察，贮藏在0℃条件下的草鱼鱼腩第7天感官评分为4分，感官可接受性很差。而0～7d 0℃的鱼腩挥发性盐基氮的含量未超过二级鲜度的标准，这是由于低温环境抑制了鱼腩中酶的活性，使鱼腩受到的降解作用降低，产生氨或胺类等碱性含氮物质较少。在第7天，假单胞菌的菌落数已经达到了6.4843(lg(CFU/g))，超过草鱼二级鲜度的标准[24]。可以确定鱼腩在第7天已经腐败，综合所有指标最后确定假单胞菌的腐败限控量为6.1673(lg(CFU/g))，货架期为6d。

2.4.2 货架期预测与评价

将确定的腐败限控量，和通过计算求得的稳定期最大菌数平均值9.4485(lg(CFU/g))带入到货架期预测模型中，方程为：

SL=LPD－[(9.4485－N0)/2.718U]×{ln
[－ln[(6.1673－N0)/(9.4485－N0)]－1} (9)

预测0～15℃条件下草鱼鱼腩的剩余货架期。表5为0、5、10、15℃条件下实际货架期与预测货架期的比较。

表 5 0、5、10、15℃条件下鱼腩实际货架期与预测货架期

Table 5 Predicted and observed shelf life of fish belly at 0, 5, 10 ℃ and 15 ℃

通过将鱼腩在0、5、10、15℃条件下获得的参数带入货架期预测模型方程，得到预测的货架期，见表5。货架期的预测值与实际值的相对误差为1.617%～21.178%，由于10℃鱼腩样品为24h测定1次，在第1天到第2天时假单胞菌菌落数出现突增现象，所以造成货架期确定的不准确，使得相对误差偏大。但综合上述结果可知，预测模型还是可以快速、可靠地预测0～15℃条件下草鱼鱼腩的剩余货架期。

3 结 论

以活草鱼上切取的鱼腩为样品，研究其在0、5、10、15℃贮藏条件下感官、挥发性盐基氮、假单胞菌随时间延长的变化，并绘制相应曲线。结果显示在0、5、10、15℃条件下新鲜鱼腩的感官评分随着贮藏时间的延长不断下降，而且随着温度的升高，下降趋势也越来越快。TVB-N值随着贮藏时间的延长和温度的升高也逐渐增加。通过研究假单胞菌的增值变化情况，成功地拟合了一级模型和二级模型。模型能够很好地描述0～15℃条件下假单胞菌在鲜切鱼腩上的生长。通过最后预测模型预测鱼腩在0～15℃条件下的货架期，并通过与实际货架期进行对比，验证其可靠性，结果实际值与预测值得相对偏差为1.617%～21.178%。所以模型预测贮藏在0～15℃内的草鱼鱼腩的货架期较为可靠，为水产品的预报模型在实际生产和流通过程中的应用打下基础。

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