青钱柳多糖在体外消化模型中的消化与吸收

闵芳芳，聂少平，万宇俊，谢明勇*

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

摘 要：采用水提醇沉法得到青钱柳多糖并测定其基本理化性质，同时，采用体外模拟人体胃肠道的消化模型，通过测定体外消化后产物的分子质量、还原糖含量和游离单糖含量，研究青钱柳多糖在体外模拟胃和胃肠道中的消化与吸收的情况。结果表明：青钱柳多糖的中性糖含量为31.17%，糖醛酸含量为38.44%，是一种果胶类的多糖；青钱柳多糖在体外模拟胃中会产生絮凝沉淀，而在体外模拟胃肠道的肠道消化阶段絮凝沉淀消失；青钱柳多糖经模拟胃和胃肠道消化后上清液和沉淀物分子质量没有发生变化，与多糖水溶液相比，多糖胃电解质溶液的高效凝胶渗透色谱的保留时间提前，同时，消化产物的还原糖和游离单糖含量也没有改变。结论：青钱柳多糖在体外模拟胃和模拟胃肠道均未被消化；但体外模拟胃中酸性环境和胃电解质溶液体系分别对青钱柳多糖的稳定性和构象产生了一定的影响。

关键词：青钱柳多糖；模拟胃肠道模型；体外消化；体外吸收

in vitro Digestion and Absorption of Polysaccharide from Cyclocarya paliurus Leaves

MIN Fang-fang，NIE Shao-ping，WAN Yu-jun，XIE Ming-yong*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract：Polysaccharides were isolated from Cyclocarya paliurus leaves by water extraction and ethanol precipitation and their physicochemical properties were determined. The digestion and absorption of the polysaccharides were studied in vitro by employing a simulated upper gastrointestinal model and analyzing molecular weight, reducing sugar and free monosaccharide contents of digested products at different digestion times. The results indicated that the polysaccharide extract contained 31.17% neutral polysaccharides and 38.44% uronic acid and was considered as pectic polysaccharides. The polysaccharides from Cyclocarya paliurus leaves formed flocculation in in vitro gastric digestion model, while the flocculation was eliminated in in vitro gastrointestinal model. The molecular weights of digestion products at different digestion times remained unchanged in in vitro simulated gastric and upper gastrointestinal model. Compared with aqueous solution, the retention time of these polysaccharides dissolved in the gastric juice was shorter in high performance gel permeation chromatography. Meanwhile, reducing sugar and free monosaccharide contents of digested products also kept unchanged in simulated gastric and upper gastrointestinal models. Therefore, the polysaccharides from Cyclocarya paliurus leaves were not digested in vitro, but to some extent, their stability and configuration were affected by acidic environment in in vitro simulated gastric model and gastric electrolytes, respectively.

Key words：polysaccharides from Cyclocarya paliurus leaves；in vitro simulated upper gastrointestinal model；in vitro digestion；in vitro absorption

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0024-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321006

近些年来，利用体外消化模型研究生物活性物质越来越受到国内外的关注。相对于研究物质体内的消化，体外消化不仅可以在某种程度上真实地表征物质在体内的变化情况，而且其具有准确性高，重现性好，财力消耗少，容易控制等优势[1]。由于研究对象多糖以及研究目的不同，多糖体外消化模型之间存在一定的差异性[2-3]，但主要是通过对多糖消化产物的分子质量，还原糖含量，单糖组成的比率，小分子体的物质的产生以及物理性状等来研究多糖体外消化行为[4-5]。目前，TNO系统是最接近人体消化系统的体外消化模型，它不仅实现了食物摄入、消化液的分泌，食物的蠕动和排空以及温度和pH值的实时调控而且还实现了小分子物质被动吸收过程[1]，同时，采用TNO系统研究某些物质的消化得到体外数据与体内实验数据结果之间存在一定的相似性[6]。

青钱柳系胡桃科，为我国特有属种的植物，主要分布于江西、广西、四川、贵州、湖北等13个省区。研究表明，青钱柳多糖具有抗肿瘤[7]、抗癌[8-9]，以及降血糖[10-11]等生物活性，且其副作用小[12] ，因此其具有广阔的应用前景。目前，青钱柳多糖的研究主要为提取分离和结构鉴定以及功能活性方面，尚未有对青钱柳多糖体外消化的研究报道。多糖的化学结构是其生物活性的基础，而多糖的空间结构对其生物活性起着决定性作用，因此，研究青钱柳多糖的消化对了解青钱柳多糖功能特性的发挥尤为重要，同时可以为青钱柳多糖发挥功能机理研究提供一些的参考依据。本工作运用体外模拟胃肠道模型，研究青钱柳多糖的体外消化。

1 材料与方法

1.1 材料

青钱柳(Cyclocarya paliurus (Batal.) Il jinskaja)由江西省修水神茶实业有限公司提供。

1.2 试剂

体外消化酶：胃脂肪酶(56.7U/mg)、胃蛋白酶(800～2500U/mg pro)、胰酶 美国Sigma公司；单糖标品：岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸 上海国药试剂公司；氯化钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、乙醇、盐酸等均为分析纯。

体外模拟胃液和模拟肠液的配制[1]：胃电解质溶液：3.1g NaCl、1.1g KCl、0.15g CaCl2、0.6g NaHCO3溶于1L的去离子水中。体外模拟胃液：135mg胃蛋白酶和119mg胃脂肪酶中加入180mL胃电解质溶液，混合均匀，用1mol/L HCl调pH值至2。肠电解质溶液：5.4g NaCl、0.65g KCl、0.33g CaCl2溶于1L的去离子水。7g/100mL胰酶：7g胰酶溶于100mL水，4800×g离心10min，取上清液待用。体外模拟肠液：90mL胰酶溶液中加入90mL肠电解质溶液，混合均匀，用1mol/L NaHCO3调节pH值至7。

1.3 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；SHZ-III型循环真空泵、DE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；LC 1260高效液相色谱系统(配有示差检测器和LC1260色谱工作站) 美国安捷伦公司；ZHWY-2102摇床 上海智城分析仪器制造有限公司；T6紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-3B精密pH计 上海雷磁仪器厂；ICS 5000离子色谱仪(配有金电极和ICS 5000色谱工作站) 美国戴安公司。

1.4 方法

1.4.1 青钱柳多糖的制备[13]

称取经干燥后的青钱柳粉末，80%乙醇浸泡除去醇溶性杂质，自然烘干后，干燥粉末按固液比1:8加入去离子水，90℃水浴提取2.5h，提取3次，合并滤液，浓缩至滤液体积1/4，80%乙醇反复醇沉4次，冷冻干燥，得青钱柳多糖。

1.4.2 青钱柳多糖的基本理化性质测定

以葡萄糖为标准，苯酚-硫酸法[14]测定多糖的中性糖含量；以半乳糖醛酸为标准，咔唑-硫酸法[15]测定多糖的糖醛酸含量；以牛血清蛋白为标准，考马斯亮蓝法[15]测定多糖的蛋白质含量；以葡萄糖为标准，DNS法[16]测定多糖的还原糖含量。用pH计测多糖溶液酸碱性。

1.4.3 青钱柳多糖的红外光谱分析

称取干燥样品1mg，与约100mg KBr研磨后，KBr封闭样品颗粒，制成透明压片，用傅里叶变换红外光谱仪在400～4000cm-1区内进行光谱扫描[17]。

1.4.4 青钱柳多糖的体外消化

1.4.4.1 青钱柳多糖在体外模拟胃中的消化

向装有10mL体外模拟胃液的14个50mL离心管中分别加入10mL 1mg/mL青钱柳多糖溶液(其中7个离心管用于多糖体外模拟胃消化，剩余7个用于体外模拟胃肠道消化)，充分混合后，于150r/min，37℃的摇床中消化，分别在0.5、1、2、3、4、5、6h取出1个离心管，4800×g离心10min，取4mL的消化产物上清液进行分子质量和还原糖含量的分析；沉淀部分转移到8000～14000D透析袋，去离子水透析5d，最后透析液用50mL容量瓶定容，然后进行分子质量和还原糖含量分析；消化产物剩余的上清液装入500～1000D的透析袋后，透析袋置于装有200mL生理盐水的锥形瓶中透析，透析时间与多糖在体外模拟胃液中消化时间一致，取透析袋外溶液研究多糖产生单糖的情况。空白对照组，用去离子水取代多糖溶液，其他操作步骤同上。实验平行进行3次。

1.4.4.2 青钱柳多糖在体外模拟胃肠道中的消化

取1.4.4.1节中7个在体外模拟胃中消化6h的多糖的离心管，分别用1mol/L NaHCO3调节溶液pH值为7，然后分别向7个离心管中加入6mL的体外模拟的肠消化液，充分混合后，于150r/min，37℃的摇床中消化，在0.5、1、2、3、4、5、6h取出1个离心管，取4mL消化产物进行分子质量和还原糖含量的分析，消化产物的剩余溶液装入500～1000D的透析袋后，透析袋置于装有200mL生理盐水的锥形瓶中透析，透析时间与多糖在体外模拟胃肠道中的消化时间一致，取透析袋外溶液研究多糖消化产生单糖的情况。空白对照组，用去离子水代替多糖溶液，其他操作步骤同上。实验平行进行3次。

1.4.5 胃电解质对青钱柳多糖的影响

称取10mg青钱柳多糖溶液分别溶于20mL去离子水和胃电解质溶液，经高效凝胶渗透色谱分析电解质对多糖的分子质量的分布变化。色谱条件为：色谱柱为Waters UltrahydrogelTM Linear Column柱(7.8mm×300mm)，流动相为去离子水，流速为0.6mL/min，进样量为20μL，检测器为RID，柱温箱和检测器的温度均为35℃[18]。

1.4.6 多糖消化产物的分子质量测定[18]

取经体外模拟胃和模拟胃肠道消化的多糖和水的消化产物上清液以及模拟胃中多糖沉淀透析液，经高效凝胶渗透色谱法测定其分子质量的变化，色谱条件同1.4.3节。

1.4.7 多糖消化产物还原糖含量测定[16]

取经体外模拟胃和模拟胃肠道消化的多糖消化产物的上清液和模拟胃中多糖沉淀透析液用DNS法测定还原糖的含量。在测多糖在体外模拟胃消化产物上清液还原糖之前，需用1mol/L NaHCO3调节溶液pH值至7。取1mL体外模拟胃和体外模拟胃肠道的消化产物于10mL的具塞试管，并向其中加入0.75mL的DNS，混匀，置100℃水浴中加热10min，待冷却后，用去离子水定容至10mL，在540nm波长处测吸光度。

1.4.8 多糖消化产物中单糖的体外吸收测定

取体外模拟胃和模拟胃肠道的多糖消化产物上清液的透析袋外溶液，经离子色谱法测定消化产物中游离单糖组成及含量。色谱条件为：CarboPac PA20(3mm×150mm)分析柱和CarboPac PA 20G(3mm×30mm)保护柱，淋洗液梯度洗脱条件[19]见表1，流速为0.5mL/min，进样量为25μL，检测器为金电极，柱温箱温度为30℃，检测器温度为35℃。

表 1 离子色谱的梯度淋洗条件

Table 1 HPIEC elution parameters

2 结果与分析

2.1 多糖的理化性质

表 2 青钱柳多糖的理化性质

Table 2 Physico-chemical properties of polysaccharides from
Cyclocarya paliurus leaves

青钱柳多糖的理化性质结果见表2，青钱柳多糖的糖醛酸含量为38.44%，是一种果胶类的多糖。

2.2 多糖的红外光谱图分析

图 1 青钱柳多糖的红外光谱图

Fig.1 Infrared spectrum of polysaccharides from Cyclocarya paliurus leaves

由图1可知，3200cm-1左右吸收峰为O－H的伸缩振动，2900cm-1和2300cm-1左右吸收峰为C－H的伸缩振动和变角振动，由以上3个特征吸收可推断出该物质为多糖。1400cm-1左右吸收峰为C＝O的对称的伸缩振动，1615.2cm-1的吸收峰为N－H的变角振动和羧酸盐的C＝O的非对称伸缩振动，1700cm-1左右吸收峰为酯基(COOR)中C＝O的伸缩振动且吸收较弱，由此可判断青钱柳多糖的糖醛酸主要是以COOH或COO－形式存在，此结果与青钱柳纯多糖的红外图谱结果一致[15]。由青钱柳多糖pH值为6.17(表2)，可以进一步推断出糖醛酸中的羧酸基团的存在形式为COO－。

2.3 胃电解质溶液对多糖分子质量分布影响

图 2 胃电解质溶液对多糖分子质量分布的影响

Fig.2 Effect of gastric electrolytes on the molecular weight distribution of polysaccharides from Cyclocarya paliurus leaves

高效凝胶渗透色谱法是一种基于保留体积差异实现物质分离的色谱手段。研究表明，对于多糖等高分子物质，溶质体积不仅取决于多糖分子质量，结构的刚性程度，支化度还与温度以及溶剂有关[20-22]。图2为多糖水溶液，多糖电解质溶液以及电解质溶液的示差响应，由图可得，相对于水溶液体系，多糖在电解质体系中的保留时间得到了提前，即减少了多糖的保留体积，有研究表明，Ca2+与COO－通过离子键相互作用易形成聚集现象[23]，由于青钱柳多糖中含有较多的COO－，胃电解质溶液中含有Ca2+，因此，多糖胃电解质体系保留时间提前可能是由于多糖中的COO－与电解质溶液中的Ca2+通过离子键形成聚集体引起的。由此可得，胃电解质溶液会对青钱柳多糖的分子质量分布产生一定影响。

2.4 多糖消化产物分子质量测定

→ 

a.多糖消化产物上清部分；b.水(空白对照组)；c.多糖消化产物沉淀部分。

图 3 多糖和水经体外模拟胃消化不同时间后的消化产物分子质量分布

Fig.3 Molecular weight distribution of polysaccharides from Cyclocarya paliurus leaves and water after digestion for different times in in vitro simulated gastric model

青钱柳多糖溶液与体外模拟胃液充分混合后，在消化不同时间，部分多糖溶液均会产生絮凝沉淀，而当体外模拟胃中消化的多糖转移到体外模拟肠道(pH 7)消化时，多糖溶液的絮凝沉淀消失。有研究表明，酸性多糖由于存在游离的COO－或COOH，在酸性条件易发生聚集现象[22]。在模拟胃中，青钱柳多糖所在的体系是一个相对比较酸的环境(多糖和模拟胃混合后pH 2.54)，多糖的絮凝现象产生的原因可能是由于酸性体系中糖醛酸的存在形式主要为COOH，这种形式大大降低了多糖分子之间斥力作用使得多糖易形成絮凝沉淀。由图3b、4b可知，体外模拟胃的消化酶以及体外模拟胃肠道消化酶不会对多糖体外消化分子质量变化测定产生影响。由图3a、c和图4a可以推断，青钱柳多糖经体外模拟胃和模拟胃肠道0.5～6h的消化后，多糖在体外模拟胃(上清部分和絮凝沉淀部分)和模拟胃肠道中分子质量基本上不发生改变。然而，多糖体外消化0.5h保留时间比多糖在水溶液中的稍提前，这个结果与多糖在胃电解质溶液中保留时间提前的结果一致，此现象产生可能是由于多糖的溶剂体系由去离子水变为电解质溶液的改变引起的。上述结果表明，在体外模拟胃和模拟胃肠道中，青钱柳多糖不被消化。

→ 

a. 多糖；b. 水(空白对照组)。

图 4 多糖(a)和水(b)经体外模拟胃肠道消化不同时间后的消化产物
分子质量分布

Fig.4 Molecular weight distribution of polysaccharides from Cyclocarya paliurus leaves and water after digestion for different times in in vitro simulated gastrointestinal model

2.5 体外消化产物还原糖的测定

表 3 青钱柳多糖体外消化产物的还原糖含量

Table 3 Reducing sugar content in digested products of polysaccharides from Cyclocarya paliurus leaves

注：同一列之间比较，不同字母代表显著性差异(P＜0.05)。

由于高效凝胶渗透色谱法基于的是溶质渗透体积差异，它不仅取决于多糖的分子质量，还取决于多糖外部一些环境因素，如温度和溶剂等，因此通过保留时间来表征多糖分子质量变化具有一定的偏差，然而，通过测定消化产物的还原糖的含量可以解决这个弊端。有研究表明，多糖糖苷键的断链一定会增加多糖还原糖的含量[24-25] 。从表3可得，多糖体外消化产物的上清液以及沉淀部分的透析液的还原糖含量在统计学上均无显著性差异(P＞0.05)。在体外消化的同一时刻，多糖的体外模拟胃消化产物的上清部分和沉淀部分的还原糖含量之和近似与体外模拟胃肠道的消化产物上清液的还原糖含量相等。结果表明，青钱柳多糖经体外模拟胃肠道消化后，青钱柳多糖的糖苷键均未发生断链，故可知青钱柳多糖未被消化，这与分子质量测定的结果一致。

2.6 多糖消化产生的游离单糖的吸收测定

a. 9种单糖和两种糖醛酸标品：1.岩藻糖，2.鼠李糖，3.阿拉伯糖，4.半乳糖，5.葡萄糖，6.木糖，7.甘露糖，8.核糖，9.果糖，10.半乳糖醛酸，11.葡萄糖醛酸；b和c. 分别为体外模拟胃和模拟胃肠道的消化产物。

图 5 透析袋外液的单糖组成及含量

Fig.5 HPIEC Analysis of monosaccharide composition of digested products of polysaccharides from Cyclocarya paliurus leaves in in vitro simulated gastric and gastrointestinal models

青钱柳多糖的单糖主要由鼠李糖，阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸组成[15]。图5为9种中性糖和两种糖醛酸的离子色谱图，图5b和图5c与图5a离子色谱图对比可得，青钱柳多糖在体外胃液和体外胃肠道消化过程中均没有单糖产生。

3 结 论

本研究采用水提醇沉法得到青钱柳多糖并测定其基本理化性质，然后研究青钱柳多糖在体外模拟胃和模拟胃肠道消化情况。结果发现：在消化过程中，多糖在模拟胃中有部分絮凝沉淀产生，但在体外模拟胃肠道中的肠道消化过程中，絮凝沉淀消失，该现象表明青钱柳在酸性的模拟胃中稳定性变差，多糖分子之间易发生碰撞聚集；而多糖胃电解质溶液在HPGPC中的保留时间提前表明胃电解质溶液对多糖分子质量分布有一定影响；同时，通过测定和分析体外模拟消化的多糖消化产物的分子质量、还原糖以及单糖生成情况，结果表明，多糖分子质量、还原糖均不发生变化，且未有单糖生成。青钱柳多糖在体外模拟胃肠道模型中不被消化，但在体外模拟胃中多糖的稳定性和构象都会受一定影响。

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