响应面法优化紫苏籽粕超声辅助
提取原花青素工艺

李 钰，吴 卫*，苏 华，易 斌

（四川农业大学农学院，四川 成都 611130）

摘 要：为充分利用紫苏资源，优化其籽粕原花青素提取工艺，考察了料液比、乙醇体积分数、超声功率、温度、时间对原花青素得率的影响，并根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验基础上选择主要影响因素进行响应面试验。响应面优化后提取工艺条件为乙醇体积分数70%、浸提时间0.5 h、浸提温度70 ℃、超声功率100W、料液比1∶15。在此条件下原花青素得率理论值为0.232%，实测值为0.229%。

关键词：紫苏；籽粒；原花青素；响应面法

Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Proanthocyanidins from Perilla frutescens Using
Response Surface Methodology

LI Yu, WU Wei*, SU Hua, YI Bin

(College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

Abstract: The ultrasound-assisted extraction of proanthocyanidins from defatted seed meal of Perilla frutescens was optimized in the present work. The effects of solid-to-liquid ratio, ethanol concentration, ultrasound power, temperature and extraction time on the extraction yield of proanthocyanidins were evaluated. Main influencing factors were selected based on the results of single factor experiments and optimized using response surface methodology according to the principle of Box-Behnken design. The optimal extraction conditions were determined as follows: extraction with a 15-fold volume of 70% aqueous ethanol solution at 70 ℃ with an ultrasound power of 100 W for 0.5 h. Under these conditions, the theoretically predicted yield of procyanidins was 0.232%, and the actually measured value was 0.229%.

Key words: Perilla frutescent; seed meal; procyanidins; response surface analysis

中图分类号：TS224.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）04-0050-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201404011

紫苏（Perilla frutescent）是传统的药食同源植物。苏叶能发散风寒、行气和胃；苏梗可理气安胎、止痛；苏子有化痰平喘、润腑等作用[1-5]。同时该属植物叶富含氨基酸、微量元素、挥发油以及紫苏苷等多种色素成分，其嫩叶可作蔬菜和菜肴着色剂、配菜、调料等，在日本、韩国等地甚为流行；其种子油不饱和脂肪酸含量高，尤以亚麻酸含量最高，可达80%以上，是一种难得的特种食用油源[6]。众所周知，亚麻酸在人体代谢可生成二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA），被称为“植物脑黄金”。研究表明，食用紫苏籽油能提高视网膜反射能力、增强视力，同时能降低胆固醇含量、降低血脂、抗血栓、抑制肿瘤、延缓衰老等多种功效。紫苏原产中国，现今主要分布于印度、缅甸、中国、日本等国家，在俄罗斯、日本、韩国、美国、加拿大等均有大量的商业性栽种[7]。我国是紫苏出口大国，紫苏籽产量大概5万～6万t，对外出口大部分是以油的形式出口，提油剩下的粕利用较少[8-9]。

原花青素（oligomeric proanthocyanidin，OPC）在结构上是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合形成，具有很强的抗氧化、清除自由基、诱导癌细胞凋亡、改善人体微循环、改善骨的形成、促进伤口愈合和组织修复活性、改善实验小鼠肥胖、改善肠道菌群等多种生物活性等作用[10-12]。有研究表明OPC在许多植物的果实、花、叶、茎及根中均可能含有，且一般在植物果实中含量相对较高[13]。本着充分深度开发利用紫苏资源，提高其药用价值和经济效益，本实验拟利用超声波辅助提取脱脂后的紫苏籽OPC，通过单因素试验确定各单因素最佳值，再利用单变量多因素方差分析选定3个对提取率影响最为显著的3个因素，最后通过Box-Behnken设计响应面优化分析确定超声辅助提取紫苏籽粕OPC的最优条件组合。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏籽：2010年采收的种植于遂宁的P06-4号紫苏品系。该品系为课题组经多年选育而成的紫苏新品系，后经四川省农作物品种审定委员会审定为“川紫1号”紫苏新品种。阴干除杂后过60目筛得紫苏籽粉末。

儿茶素标准品 成都曼斯特生物试剂有限公司；香兰素、甲醇、无水乙醇、浓盐酸均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450型紫外分光光度计 日本岛津公司；RE-2000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；HH-4恒温水浴锅 国华电器有限公司；高速中药HK-04B粉碎机 广州华凯机械设备有限公司；电子分析天平 沈阳龙腾电子有限公司；SHZ-D（III）循环水式多用真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；HF-5.0B超声循环水式真空泵 北京弘祥隆生物技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取紫苏籽OPC工艺流程

紫苏籽粉末→石油醚浸泡脱脂→过滤→残渣→根据料液比加入溶剂→提取（控制适当条件）→抽滤→收集滤液→测定OPC含量→计算得率[14-15]

1.3.2 OPC含量测定方法的选择和得率计算

目前国际上还没有统一的OPC含量检测方法，主要的测定方法包括正丁醇盐酸法和香草醛法。正丁醇-盐酸法对OPC化学结构的依赖性较大，选择性高，OPC与儿茶素单体不发生显色反应，因此对于低聚合度OPC的测定并不适宜[16]。而香草醛法较正丁醇盐酸法而言更灵敏、更专一、更简洁可行[17]。但在香草醛-硫酸法中，硫酸引起反应体系放热，且加诸其强氧化作用将共同导致OPC氧化分解，使测定结果偏低[18]。本实验采用香草醛-盐酸法，其原理是利用A环为间苯三酚型的黄烷醇OPC在以盐酸作为催化剂的条件下会与香草醛发生酚醛缩合反应，生成红色产物，并在500nm波长处有最大吸光度，用分光光度法测定OPC含量[19-20]。

测定以儿茶素[21]为对照品，得到OPC质量浓度（ρ）与吸光度（y）的曲线回归方程：y=0.3842ρ＋0.0044，r2=0.9992。

OPC得率/%=（ρV/m）×10-3×100

式中：ρ为提取液中OPC质量浓度/（mg/mL）；V为提取液的体积/mL；m为紫苏籽干质量/g。

1.3.3 紫苏籽OPC提取的单因素试验

称取脱脂紫苏籽粉末2.0g，按料液比1∶15加入体积分数为70%乙醇溶液，50 ℃、300W超声提取0.5 h。固定其他条件，分别考察不同料液比（1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30)、浸提温度（30、40、50、60、70 ℃）、超声功率（100、200、300、400、500W）、浸提时间（10、20、30、40、50min）、乙醇体积分数（50%、60%、65%、70%、75%）对OPC提取效果的影响。

1.3.4 响应面分析

基于单因素试验，选择对OPC得率影响较大的料液比、浸提温度和超声功率3个因素，利用Box-Behnken 试验设计原理，选取5个中心点进行17个试验，试验因素水平见表1。

表 1 紫苏籽OPC提取响应面分析试验因素水平表

Table 1 Experimental factors and levels used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图1A可见，随着温度的升高，OPC得率先升高后降低，到50 ℃和60 ℃时得率增加达到极显著水平，70 ℃又显著降低。这是由于温度升高分子运动加速，进而渗透和扩散速度加快，提取率增加。但温度过高OPC结构易破坏，导致得率降低。故选择60 ℃左右是OPC提取的最佳温度。

通常溶剂用量越大，OPC得率越大。由图1B可见，随着提取液用量的增加，OPC得率增加，并且在料液比1∶15之前，随溶剂增加，OPC得率增加极显著，而在料液比1∶15之后，得率增加趋于平缓，此时紫苏籽中OPC已基本全部溶出。考虑过高的提取液用量不仅收益小，而且会增加后序加工的能耗，增加生产成本，所以选择料液比为1∶15左右为宜。

随超声功率的增加，OPC得率提高，由图1C可见，当功率达到200W时，再增加功率，提取率增高不显著，且在300W后逐渐降低。实质上，随着功率的增加，超声波的空化效应和机械效应能量不断增加，加强了细胞内物质的扩散及溶解，使OPC更易转移至提取液中，OPC得率明显提高。试验结果还表明，当超声功率超过300W 后，得率降低，此时超声功率早已经满足了使目标产物完全析出的能量，再增加超声功率则会产生大量无用气泡，增加了散射衰减，降低了空化强度[22]。因此为节约能量，选择超声功率为200W。

由图1D可知，提取时间较短OPC来不及溶出。但提取时间过长，OPC又会因为长时间受热而发生结构改变，因此确定提取时间为30min。

A.超声温度；B.料液比；C.超声功率；D.提取时间；E.乙醇体积分数。

图 1 不同提取条件对紫苏籽粕OPC得率的影响

Fig.1 Effects of process conditions on extraction yield of procyanidins from defatted seed meal of Perilla frutescens

试验过程中发现低体积分数的乙醇提取液很难过滤，而在分级时溶剂界面上出现悬浮的絮状物，这可能是因为OPC在植物体内、分子间通常与蛋白质、多糖等通过氢键和疏水键形成稳定的复合物，且大量水溶性杂质如多糖、果胶、蛋白质、色素等成分随之溶出，影响OPC的溶出。当乙醇体积分数太大，则会产生很大的渗透压，醇溶性杂质、色素和亲脂性强的成分溶出增多，这些成分会与OPC竞争乙醇-水分子，使得OPC溶出减少，进而导致OPC提取率下降[23]。由图1E可见，各乙醇体积分数提取间，OPC得率无显著差异，为方便过滤操作，选择70%的乙醇体积分数。

2.2 OPC提取的响应面分析

2.2.1 响应面试验设计及结果

表 2 紫苏籽OPC提取响应面分析试验设计及结果

Table 2 Scheme and experimental results of response surface
Box-Behnken design

根据Box-Behnken试验设计原理[24]，综合单因素影响试验结果，选择温度（X1）、料液比（X2）、超声功率（X3）对OPC提取影响显著的3个因素，在单因素试验基础上采用三因素三水平的响应面分析法。单因素试验结果显示：在提取温度60 ℃、料液比1∶15、功率200W时，紫苏籽中的OPC有最大得率。超声法提取紫苏籽中OPC的响应面试验设计方案与试验结果见表2。

2.2.2 模型的建立及显著性检验

利用Design-Expert V8.0.6.统计软件对表2所得试验数据结合表3进行多元回归拟合分析，剔除不显著项，得到OPC得率（Y）对温度（X1）、料液比（X2）、超声功率（X3）的多元二次回归方程模型为：

Y（OPC得率/%）=0.12＋0.03X1－0.018X3－0.019X1X3－0.023X2X3＋0.056X12－0.025X22

由表3分析结果可以看出，因素X1（温度）对OPC得率呈极显著（P＜0.01）影响，X3（超声功率）对OPC得率呈显著影响，因素X1X3和X2X3对响应值的曲面效应也呈显著影响，由此可以得出结论：温度和超声功率是紫苏籽OPC提取工艺中重要的影响因素，根据F值的大小，确定该3个因素对OPC提取率的影响大小为：X1（温度）＞X3（超声功率）＞X2（料液比）。

对多元回归方程进行方差分析，虽然失拟项显著，但其中二次响应面回归模型的F值为12.99，响应值变异系数（CV）为12.58%，模型回归关系达到高度的极显著水平（P=0.0014），且R2=0.9435，调整决定系数R2Adj =0.8709，RSN为16.219，远大于5，说明该模型能解释87.09%响应值的变化，能在一定程度下对不同提取条件下的OPC得率进行预测。

表 3 回归方程各项的方差分析结果

Table 3 Analysis of variance for each term in the response surface regression model

注：*.P＜0.05，差异显著；**.P＜0.01，差异极显著。

2.2.3 响应面分析

响应曲面分析法优化图形为响应值Y与对应的因素间构成的三维图及在二维平面上的等高图，综合直观地反映各因素对响应值的影响，每个响应面对其中两个因素进行分析，另外一个因素固定在零水平上。回归优化响应面图分别见图2。比较2组图并结合表3中P值可知：模型的一次项X1极显著，X2不显著，X3显著，X1X3、X2X3交互项显著，X1X2交互项不显著。二次项X12极显著，X22显著，表明这两个影响因素对得率不是简单的线性关系。由图2可知，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，温度对得率影响最为显著，表现为曲面比较陡；其次是超声功率，再是料液比，表现为曲面比较平滑。

A.超声功率和料液比

B.超声功率和温度

图 2 各因素交互作用响应面图和等高线

Fig.2 Response surface and contour plots showing the pairwise interaction effects of various hydrolysis conditions on the extraction
yield of procyanidins

2.2.4 最佳工艺条件验证

软件分析得到最大的响应值为0.231687%，即OPC得率预测值最高为0.231687%，与之对应的预测工艺条件为：浸提温度70 ℃、超声功率100W、料液比1∶15.55（g/mL）。根据实际操作，对工艺条件进行简单处理，在乙醇体积分数为70%、浸提时间为0.5 h、浸提温度70 ℃、超声功率100W、料液比1∶15.5（g/mL）的条件下进行2次验证实验，OPC得率的实测值为0.229%，与预测的理论值相接近，验证了此模型的有效性。

3 结 论

本实验采用响应面分析法优化紫苏籽OPC的提取工艺，在温度、料液比、超声功率3个因素中，温度对紫苏籽OPC的得率的影响达到了极显著水平，超声功率达到显著水平，而料液比对紫苏籽OPC得率的影响不显著，3个因素的主次关系为：温度＞超声功率＞料液比。利用Design-Expert V8.0.6.软件对BBD试验数据进行分析，结果表明，紫苏籽OPC超声辅助最佳提取条件为浸提温度70 ℃、超声功率100W、料液比1∶15.55（g/mL），OPC得率理论预测值为0.232%，实测值为0.229%。为紫苏中OPC开发与利用提供一定的参考价值和理论基础。

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