抗坏血酸、半胱氨酸与氯化钙复合处理对
鲜切芋艿褐变的影响

谭谊谈1，曾凯芳1,2,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（重庆），重庆 400715）

摘 要：研究抗坏血酸、半胱氨酸与氯化钙复合处理对于鲜切芋艿贮藏期间酶促褐变的控制效果及其机理。结果表明：切分后的芋艿片褐变度迅速上升，亮度（L*）值下降，苯丙氨酸解氨酶、脂氧合酶、多酚氧化酶和过氧化物酶活性升高，总酚积累。与对照相比，2.5%抗坏血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化钙浸泡处理能够有效降低鲜切芋艿贮藏期间的褐变度，保持较高的L*值和总酚含量，并抑制了苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、过氧化物酶和脂氧合酶活性和相对电导率的升高，达到提高鲜切芋艿贮藏品质和延长贮藏周期的目的。

关键词：抗坏血酸；半胱氨酸；鲜切芋艿；贮藏；褐变

Effects of Combined Treatment with Ascorbic Acid, Cysteine and CaCl2 on Browning of Fresh-Cut Taro

TAN Yi-tan1, ZENG Kai-fang1,2,*

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;

2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing),
Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

Abstract: In this study, we evaluated the effects and mechanism of combined treatment with ascorbic acid (AA) and cysteine (Cys) and calcium chloride (CaCl2) on enzymatic browning of freshly-cut taro during storage. The results showed that the degree of browning in fresh-cut taro rapidly increased, whereas L* value decreased. Moreover, the activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), phenylalanin ammonia-lyase (PAL) and lipoxidase (LOX) rose and the content of total phenol was accumulated during storage. Soaking treatment with 2.5% AA, 0.05% Cys and 0.4% CaCl2 could effectively retard browning, maintain high levels of L* value and total phenol content, inhibit the increases in the activities PPO, POD, PAL and LOX and conductivity, thus improving the storage quality and prolonging the storage life of fresh-cut taro.

Key words: ascorbic acid; cysteine; fresh-cut taro; storage; browning

中图分类号：S609.3；S667.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）04-0231-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201404047

芋艿（Colocasia Schott）俗称为芋头，天南星科单子叶多年生草本植物，在我国云南、四川、贵州、福建和海南等地均有栽培[1-2]，随着人们生活节奏的加快和对营养均衡搭配的重视，芋艿以其丰富的营养价值[3]，越来越受到关注。但芋艿外表带毛刺难以清除，接触后会造成皮肤瘙痒，在加工或烹饪过程造成诸多不便[4]。为了更加方便快捷地食用芋艿, 可对其进行最小加工处理或鲜切加工[4]。然而去皮产生的机械伤破坏了芋艿细胞结构的完整性，使得本来因区域化分部而被分隔开的酚类和酚酶接触，导致酚类被氧化而聚合形成褐色聚合物，导致褐变的发生[5]，降低贮藏品质，严重影响其商品价值。

传统的控制褐变方法中，气调保鲜和亚硫酸盐保鲜具有较好的效果，已在苹果[6]、梨莲[7]、藕[8]和甘薯[9]上得到了广泛的应用。由于气调保鲜成本相对较高，而亚硫酸盐的残留对人体健康和环境污染的影响[10]，在实际应用过程中受到限制。鲜切果蔬由于机械伤加速乙烯的合成，促使果蔬组织代谢加快，导致衰老的发生。同时乙烯可以提高果蔬组织中酚酶的活性，加速贮藏期间褐变的发生[11-12]。抗坏血酸处理能够作用于多酚氧化酶中心的铜离子，钝化酶活性，同时还原被酚酶氧化的酚类物质，而半胱氨酸处理还能够与酚类物质形成复合物，抑制褐变进程[5]。氯化钙处理能够在细胞壁外形成钢性膜，改善细胞透气性，并且增加细胞壁强度，保持贮藏品质[13]，具有操作方便、高效和无毒无害等优点，被广泛应用于控制洋蓟[14]、土豆[15]和梨[16]等的褐变。目前对于鲜切芋艿褐变控制方法的研究主要集中在抗坏血酸（ascorbic acid，AA）及其盐类、L-半胱氨酸（cysteine，Cys）以及4-己基间苯二酚等[4]，虽然操作简单快捷，但单一处理控制褐变效果不佳，因此需要寻求复合处理的方式控制鲜切芋艿褐变的发生。本实验以2.5%抗坏血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化钙浸泡处理鲜切芋艿，研究其对冷藏期间芋艿褐变的控制效果及机理，以期为鲜切芋艿生产中的品质控制提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料

芋艿购于重庆市北碚区天生农贸市场，品种为魁芋。挑选大小均一、没有病虫害、外观完整无机械伤的芋艿，经清洗之后用灭菌的工具去皮，切分为厚度为
0.5 cm大小均一的切片，将切分后的芋艿用消毒过的聚乙烯托盘分装，用于不同处理。

1.2 试剂与仪器

丙酮（分析纯） 重庆川东化工化学试剂厂；β-巯基乙醇（分析纯）、邻苯二酚（化学纯） 中国医药集团上海化学试剂公司；愈创木酚（化学纯） 中国佘山化工厂；甲醇（分析纯） 成都科龙化工试剂厂；亚油酸钠（色谱纯） 美国Sigma公司。

S22PC可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 处理

实验处理包括：1）对照：无菌水浸泡处理2 min；2）用无菌水配制2.5%抗坏血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化钙溶液，浸泡处理2 min。处理后装有鲜切芋艿片的托盘用0.05 mm厚聚乙烯保鲜膜覆盖包装，贮藏于（4±1）℃，85%～95%湿度条件下，分别于贮藏2、4、6、8、10d随机取样进行观察测定。每处理用样500g，每个实验处理重复3次。

1.3.2 褐变度和色差值的测定

褐变度测定参考陈功等[17]方法，称取新鲜样品2 g，切碎，研磨后加入质量比1∶10的预冷蒸馏水，在20 ℃条件下、以3500 r/min离心，用蒸馏水作为空白对照，测定波长410 nm波长处的吸光度，以A410 nm×10表示褐变度。色差L*值用测色色差计测试。

1.3.3 总酚的测定

总酚的提取与测定参考Dewanto[18]、Chu Yifang[19]等方法并修改：将2 g样品与50 mL冷冻的80%丙酮混合、均质再抽滤，滤液经80%丙酮冲洗后用旋转蒸发仪在45 ℃条件下旋转蒸发，并用蒸馏水定容到10 mL。总酚测定参照Chu Yifang等[19]方法。

1.3.4 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL）的测定[20]

称取2.5 g样品组织，冰浴条件下与5.0 mL提取缓冲液（50 mmol pH8.8硼酸缓冲液＋5 mmol/L β-巯基乙醇＋40 g/L PVP＋2 mmol/L EDTA）混合匀浆，在12000×g，4 ℃低温离心30 min，取上清液为酶提取液。加入3.4 mL 50 mmol、pH8.8硼酸缓冲液、0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液和0.1 mL酶提取液（对照组酶提取液先煮沸8 min），摇匀。在37℃条件下保温30 min。保温结束立即向试管加入0.1 mL 6mol/L盐酸溶液终止反应。测定波长设为290 nm，以蒸馏水为空白调零，分别测定活性管、对照管吸光度（A1和A0）。单位以0.01ΔA290 nm/（h•g）表示，即每小时每克鲜质量皮组织酶反应体系吸光度增加0.01为一个PAL活性单位（U）。

1.3.5 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）的测定[21]

准确称取1.0 g新鲜样品于研磨中，立即加6 mL 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.8）和0.2 g PVP，冰浴条件下迅速研磨，匀浆液以12000×g、4 ℃条件下离心30 min，收集上清液，4℃放置备用（当天测定）。

PPO活性测定参照Zauberman等[22]的方法并改进。3 mL反应体系：2 mL 0.1 mol/L、pH6.8磷酸缓冲液＋0.9 mL 50 mmol/L邻苯二酚＋0.1 mL酶提取液。测定室温条件下470 nm波长处，反应液10 min内吸光度的变化。实验重复3次。以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位（U）。POD活性测定参照Srivastava等[23]的方法并改进。3 mL反应体系：2.7 mL 0.1 mol/L pH6.8的磷酸缓冲液＋0.1 mL 4%的愈创木酚＋0.1 mL 0.5% H2O2＋0.1 mL酶提取液。测定室温条件下470 nm，反应液10 min内吸光度的变化。以每分钟吸光度变化0.001为一个酶活力单位（U）。

1.3.6 脂氧合酶（lipoxidase，LOX）的测定

参照陈松昆等[24-25]测定方法，并有所改进：称取1.0 g柑橘果皮于预冷的研钵中，加入5.0 mL经预冷的提取液，在冰浴条件下研磨匀浆，然后转移至离心管中于4 ℃、12000×g离心30 min，收集上清液备用。再取2.775 mL 0.1 mol/L、pH 6.0 柠檬酸缓冲液于反应休系中，加入25μL亚油酸钠母液，再加入200μL粗酶液。以蒸馏水为参比调零，在反应15s时开始记录反应体系在波长234 nm处吸光度为初始值，然后每隔15s测定1次，测到反应90s为止。以每克鲜样每分钟吸光度增加0.01为1个LOX活性单位（U）。

1.3.7 电导率的测定

参照曹建康[21]、王国泽[26]等测定方法并作一定修改。取厚薄均匀大小一致的组织园片，精确称取0.5g（大约15片组织圆片），放入盛有20 mL去离子水的烧杯振荡10 min，将水倾去，再用去离子水清洗3次并用滤纸片吸干圆片上的水分。把组织圆片放入大试管中，准确加入20 mL去离子水，再放入振荡器中振动1h，在20～25 ℃恒温条件下，用电导率测定仪测定溶液电导率（L1）。再将试管煮沸10 min，加热杀死组织园片，冷却后再次测定提取液的电导率（L0）。细胞膜渗透率即相对电导率按下式计算：

相对电导率/%=L1/L0×100

1.4 数据统计及图形分析

用Excel 2003统计分析所有数据，计算标准误、制图；并利用SPSS对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙处理对鲜切芋艿褐变情况的影响

对照 2.5% AA＋0.05% Cys＋0.4% CaCl2

2d

4d

6d

8d

10d

图 1 抗坏血酸、半胱氨酸复合氯化钙处理对不同贮藏期
鲜切芋艿褐变情况的影响

Fig.1 Effect of combined treatment with ascorbic acid, cysteine and CaCl2 on browning of fresh-cut taro during storage

如图1所示，酚类物质被酚酶所氧化，导致鲜切芋艿表面颜色从白色转变成深黄色（图中显示为褐色），随着褐变的加剧逐渐变成褐色。对照组在贮藏第4天时褐变已经比较严重，而抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理显著延缓了鲜切芋艿的褐变进程，将贮藏周期延长了4～6d。

图 2 抗坏血酸、半胱氨酸复合氯化钙处理对鲜切芋艿
褐变度（A）和L*值（B）的影响

Fig.2 Effects of combined treatment with ascorbic acid cysteine and CaCl2 on browning rate (A) and L* value (B) of fresh-cut taro

褐变度反映了鲜切芋艿在贮藏过程中褐变的程度，图2A结果与图1结果一致，表明抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理能够抑制鲜切芋艿贮藏期间褐变度的上升，起到控制褐变的目的。

L*值表示亮度，其数值在1～100之间变化，数值越大，间接反映褐变程度较低，反之则褐变严重[27]。鲜切芋艿贮藏期间L*值变化趋势如图2B所示，L*值整体呈现不断下降的趋势，对照组从贮藏第4天开始，其L*值下降速度加快，而抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理能有效延缓L*值的下降，控制鲜切芋艿褐变的发生。

2.2 抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙处理对鲜切芋艿PAL活性和总酚含量的影响

PAL是苯丙氨酸代谢途径中的第一个酶，能够分解苯丙氨酸[5]，其产物包括酚类和类黄酮等，而酚类和类黄酮作为褐变的底物可以被酚酶所氧化形成褐色聚合物导致褐变的发生[28]。如图3A所示，贮藏期间对照组PAL活性一直高于抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理组。在贮藏第8天时，抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理对PAL活性抑制效果最佳，仅为同期对照组PAL活性的51.1%，与Zhu Liqin[29]、Vincenzo[30]等的研究结果一致。抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理组的总酚含量显著高于同期对照组（P＜0.05）。抗坏血酸可竞争性被氧化同时还原被氧化的酚类物质，以此提高贮藏期间总酚的含量。在贮藏末期，复合处理组总酚含量为对照组的2.27倍，延缓褐变效果明显。

图 3 抗坏血酸、半胱氨酸复合氯化钙处理对鲜切芋艿
PAL活性（A）和总酚含量（B）的影响

Fig.3 Effects of combined treatment with ascorbic acid, cysteine and CaCl2 on PAL activity (A) and total phenol content (B) of fresh-cut taro

2.3 抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙处理对鲜切芋艿POD和PPO活性的影响

图 4 抗坏血酸、半胱氨酸复合氯化钙处理对鲜切
芋艿POD（A）和PPO活性（B）的影响

Fig.4 Effects of combined treatment with ascorbic acid, cysteine and CaCl2 on POD (A) and PPO activities (B) of fresh-cut taro

在果蔬褐变过程中，PPO和POD是最重要的两个酶，PPO能够催化氧化酚类物质形成褐色聚合物，而POD能够在有H2O2存在的情况下，氧化酚类物质形成褐变。控制鲜切果蔬褐变主要通过抑制褐变相关酶活性实现[5]。鲜切芋艿贮藏期间PPO和POD活性总体呈现上升后下降的趋势。抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理均对PPO和POD具有一定的抑制效果，分别在Zhu Liqin[29]、Degl'Innocenti[31]、Cabezas-Serrano[14]等的实验中已得到证明。而图4表明，抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理组能够降低鲜切芋艿贮藏期间PPO和POD的活性。芋艿的PPO和POD活性高峰均出现在贮藏第8天，此时抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理组的PPO和POD活性分别只有对照组PPO和POD活性的68.43%和76.55%，控制效果显著（P＜0.05）。表明了抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理能够较好地抑制鲜切芋艿贮藏期间PPO和POD活性，延缓贮藏期间褐变的进程。

2.4 抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙处理对鲜切芋艿LOX活性和相对电导率的影响

图 5 抗坏血酸、半胱氨酸复合氯化钙处理对鲜切芋艿LOX
活性（A）和相对电导率（B）的影响

Fig.5 Effects of combined treatment with ascorbic acid, cysteine and CaCl2 on LOX activity (A) and relative conductivity (B) of fresh-cut taro

由图5A可知，果蔬经切分后，LOX活性上升，并加速细胞质膜的破坏，使得细胞结构受损破坏了酚类与酚酶的区域化分布[32]，加速了褐变的发生。鲜切芋艿在贮藏期间其LOX活性逐渐升高，而抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理能够抑制其LOX活性的上升，通过钝化LOX活性，降低细胞膜脂破坏程度，保护细胞结构的完整性。在贮藏第6天和第8天，处理组LOX活性仅为对照组同期的60.3%和65.3%，抑制效果显著（P＜0.05）。相对电导率的结果如图5B所示，和LOX活性变化较为一致，从贮藏第6天开始，抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理较好地控制了相对电导率的上升，表明抗坏血酸、半胱氨酸和氯化钙复合处理能有效保护鲜切芋艿的细胞结构，从而延缓酚类与酚酶接触，阻止褐变的发生。

3 结 论

3.1 2.5%抗坏血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化钙复合处理抑制了鲜切芋艿贮藏期间的PAL活性，同时降低了LOX活性，延缓了膜脂过氧化进程，保持细胞膜脂结构的完整性。

3.2 2.5%抗坏血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化钙复合处理显著抑制了贮藏期间PPO和POD的活性，降低酚类物质被氧化的速度。

3.3 2.5%抗坏血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化钙复合处理能够保护酚类物质，延缓膜脂过氧化进程，阻碍酚类与酚酶的接触，同时钝化了褐变相关酶的活性，降低了鲜切芋艿贮藏期间褐变度，从而达到控制鲜切芋艿贮藏期间褐变、提高贮藏品质和延长贮藏周期的目的。

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