HPLC-MS-MS法同时测定酸枣仁分散片中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素的含量

马桂劼1,张 婷1,解军波1,2,*,庞广昌1,2

(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 300134;2.天津市食品生物技术重点实验室,天津 300134)

 

摘 要:目的:建立高效液相色谱-电喷雾电离质谱法同时测定酸枣仁分散片中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素含量的方法。方法:采用YMC ODS-AQTM 色谱柱,乙腈-0.1%甲酸溶液(36:64,V/V)为流动相,流速0.3mL/min,柱温30℃,进样量20μL;ESI负离子模式下,采用多重反应监测模式,监测的离子为m/z 1205.6~1073.6(皂苷A),
m/z 1043.6~911.7(皂苷B),m/z 607.2~427.0(斯皮诺素)。结果:分散片中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素含量与峰面积的线性关系良好(r>0.9992),平均加样回收率分别为97.39%、97.86%和98.48%,相对标准偏差均小于1.0%。酸枣仁分散片中3种组分的含量分别为4.15、1.46mg/g和21.46mg/g。该方法快捷、准确、重复性好,可用于酸枣仁分散片中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素的同时测定。

关键词:酸枣仁分散片;酸枣仁皂苷 A;酸枣仁皂苷B;斯皮诺素;液相色谱串联质谱法;多重反应监测

 

Simultaneous Determination of Jujuboside A, Jujuboside B and Spinosin in Ziziphi Spinosae Semen
Dispersible Tablets by HPLC-MS-MS

 

MA Gui-jie1,ZHANG Ting1,XIE Jun-bo1,2,*,PANG Guang-chang1,2

(1. School of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China;

2. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, Tianjin 300134, China)

 

Abstract:Objective: A method for simultaneous determination of jujuboside A (JuA), jujuboside B (JuB) and spinosin in ZSS (Ziziphi Spinosae Semen) dispersible tablets was established using high performance liquid chromatography tandem electrospray ionization mass spectrometry (HPLC-ESI-MS-MS). Methods: The separation was performed on a YMC ODS-AQTM column with acetonitrile-0.1% formic acid (36:64, V/V) as the mobile phase at flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 30 ℃. The injection volume was 20 μL. The analytes were detected by ESI-MS in the negative ion mode. In the multiple reaction monitoring (MRM) mode, the quantitative determination of JuA at m/z of 1205.6-1073.6, JuB at m/z
of 1043.6-911.7, spinosin at m/z of 607.2-427.0 was carried out. Results: A good linear relationship between the peak area and the concentrations of JuA, JuB and spinosin was obtained (r > 0.9992). The average recovery rates for them were 97.39%, 97.86% and 98.48%, respectively, with relative standard deviation less than 1.0%. The contents of JuA, JuB and spinosin in ZSS dispersible tablets were 4.15, 1.46 mg/g and 21.46 mg/g, respectively. The developed method is rapid, accurate and repeatable, which is suitable for the simultaneous determination of JuA, JuB and spinosin in ZSS dispersible tablets.

Key wordsZiziphi Spinosae Semen (ZSS) dispersible tablet;jujuboside A (JuA);jujuboside B (JuB);spinosin;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS);multiple reaction monitoring (MRM)

中图分类号:R944.4 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)22-0150-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322030

酸枣仁(Ziziphi Spinosae Semen,ZSS)为鼠李科植物酸枣(Ziziphu jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F. Chou)的干燥成熟种子,味甘、酸,性平,具有养肝、宁心、安神、敛汗等功能,属于卫生部颁布的第1批药食同源两用品种之一[1]。现代研究表明,酸枣仁含皂苷、黄酮、脂肪油和生物碱等化学成分[2-5],具有镇静、催眠、强心等多种生物活性[6-12],在保健产品中被广泛应用,主要用于治疗神经衰弱、失眠、多梦等症[13-15]。

目前酸枣仁的应用仅限于汤剂、口服液和复合胶囊剂。分散片指在水中可迅速崩解、均匀分散的片剂。相对于普通片剂、胶囊剂等固体制剂,分散片服用方便、崩解迅速,可有效地提高天然活性成分在体内的吸收,显著地改变其生物有效性,增强疗效,具有提高难溶性物质溶解度、提高生物利用度、增加稳定性、降低不良反应等优点。

目前关于酸枣仁及其相关制剂仅见利用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(high performance liquid chromatography-evaporation light-scattering detection,HPLC-ELSD)、高效液相-紫外检测法(high performance liquid chromatography-ultraviolet,HPLC-UV)对酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素[16-20]的测定报道。近年来,由于高效液相色谱-质谱(HPLC-tandem mass spectrometry,HPLC-MS-MS)在检测灵敏度、选择性等方面表现出来的优势,已广泛应用于食品、医药等多个领域[21-23]。因此,为进一步评价酸枣仁分散片的质量,本实验建立了HPLC-MS-MS法用于同时测定酸枣仁分散片中的酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素等有效成分,旨在确定酸枣仁制剂中的主要指标成分及其含量,为酸枣仁分散片的质量控制及进一步应用研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸枣仁分散片(批号为20130403、20130407、20130411) 自制(300mg/片);酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素对照品(纯度>98%) 成都思科华生物技术有限公司;甲酸(HPLC级) 美国Tedia公司;乙腈、水(色谱纯) 美国J. T. Baker公司。

1.2 仪器与设备

Bp211D电子分析天平 德国Sartorius公司;KQ-218 型超声波清洗器 江苏省昆山市超声仪器有限公司;1100 Series高效液相色谱仪、G1322A在线脱气机、G1312B二元泵、G1316B柱温箱、G1367D自动进样器、G6410B Triple Quad LC-MS、Quantitative Analysis (QQQ)定量分析软件 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱:YMC ODS-AQTM(2.0mm×250mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%(V/V)甲酸溶液(36:64,V/V);流速0.3mL/min;柱温30℃;进样量20µL。

1.3.2 质谱条件

离子源:负离子电喷雾(electrospray ionization,ESI);多反应检测(multi-reaction monitoring,MRM)模式;电喷雾电压4000V;雾化气体N2;雾化气压力241.2kPa;干燥气体N2,干燥气流速10L/min;离子源温度350℃,碰撞气体高纯氮气;碰撞气压力0.15MPa。

酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素的检测条件参数见表1。

表 1 酸枣仁皂苷A、B和斯皮诺素的质谱分析条件

Table 1 MS parameters for the analysis of JuA, JuB and spinosin

化合物

特征相对分子质量

碎裂电压/V

碰撞能量/V

斯皮诺素

607.2~427.0

240

20

酸枣仁皂苷A

1205.6~1073.6

340

45

酸枣仁皂苷B

1043.6~911.7

320

45

 

 

1.3.3 溶液配制

1.3.3.1 对照品溶液配制

分别精密称取酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素对照品2mg,置10mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀后即得质量浓度为200µg/mL的对照品溶液。精密量取1mL上述对照品溶液置100mL容量瓶中,以36%的乙腈溶液稀释至刻度,得到质量浓度为2μg/mL的混合对照品溶液。

1.3.3.2 供试品溶液的制备

取酸枣仁分散片20片研细,精密称取0.2g,置100mL量瓶中,加甲醇适量,超声处理30min,用甲醇稀释至刻度,摇匀,0.45μm微孔滤膜过滤,以36%的乙腈溶液稀释100倍即得供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 色谱及质谱条件

446303.jpg 

446320.jpg 

图 1 3种对照品(A)及酸枣仁分散片(B)HPLC-MS-MS色谱图

Fig.1 HPLC-MS-MS chromatograms of 3 standards (A) and ZSS dispersible tablet samples (B)

按1.3节色谱和质谱条件对酸枣仁分散片中各成分进行测定,记录色谱图。由图1可知,在该条件下,3种指标性成分在样品中得到比较好的分离,峰形良好。

2.2 线性关系考察

分别精密量取混合对照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL置于10mL容量瓶中,36%乙腈溶液稀释至刻度,摇匀,按1.3节色谱和质谱条件测定,记录峰面积。以峰面积(A)为横坐标,样品质量浓度(ρ)为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程,见表2。结果表明,酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素在各自的质量浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

表 2 标准曲线及线性关系考察结果

Table 2 Standard curves and linear correlations

成分

标准曲线方程

线性范围/
(ng/mL)

相关
系数(r)

LODa/
(ng/mL)

LOQb/

(ng/mL)

酸枣仁皂苷A

ρ=0.0544A-73.3334

50~1600

0.9992

25

50

酸枣仁皂苷B

ρ=0.0824A-76.012

50~1600

0.9999

20

50

斯皮诺素

ρ=0.0625A-15.798

50~1600

0.9994

20

50

 

注:a.检出限(RSN=3);b.定量限(RSN=10)。

 

2.3 精密度实验

取分散片适量研碎,按1.3.3.1节制备供试品溶液,重复进样5次,记录峰面积,结果见表3。酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素的RSD分别为1.70%、2.20%、0.21%,结果表明仪器精密度良好。

表 3 精密度考察结果(n=5)

Table 3 Results of precision tests (n=5)

成分

平均峰面积

RSD/%

酸枣仁皂苷A

5570.6

1.70

酸枣仁皂苷B

3378.6

2.20

斯皮诺素

21522.2

0.21

 

 

2.4 稳定性实验

表 4 稳定性考察结果

Table 4 Results of stability tests

成分

检测时间/h

峰面积

平均峰面积

RSD/%

酸枣仁皂苷A

0

5723

 

 

2

5803

 

 

4

5803

5756.4

0.75

6

5738

 

 

8

5715

 

 

 

 

 

 

 

酸枣仁皂苷B

0

3736

 

 

2

3892

 

 

4

3758

3779.4

1.77

6

3726

 

 

8

3785

 

 

 

 

 

 

 

斯皮诺素

0

21824

 

 

2

21893

 

 

4

21590

21734.8

0.57

6

21658

 

 

8

21709

 

 

 

 

按1.3.3.2节制备供试品溶液,分别于0、2、4、6、8h进行分析,测定色谱峰面积,结果见表4。酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素峰面积的RSD分别为0.75%、1.77%、0.57%,结果表明8h内各组分稳定性良好。

2.5 重复性实验

取同批分散片样品,精密称取5份,按1.3.3.2节制备供试品溶液,按1.3节色谱及质谱条件进样测定,结果见表5。酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素的RSD分别为1.53%、2.32%、0.62%,结果表明该方法重复性良好。

表 5 重复性实验结果(n=5)

Table 5 Results of repeatability tests (n=5)

成分

称样量/g

测定含量/(mg/g)

平均测定含量/(mg/g)

RSD/%

酸枣仁皂苷A

0.1998

4.01

 

 

0.2034

4.11

 

 

0.2003

4.05

4.10

1.53

0.2022

4.15

 

 

0.2039

4.18

 

 

 

 

 

 

 

酸枣仁皂苷B

0.1998

1.35

 

 

0.2034

1.33

 

 

0.2003

1.36

1.38

2.32

0.2022

1.41

 

 

0.2039

1.42

 

 

 

 

 

 

 

斯皮
诺素

0.1998

21.52

 

 

0.2034

21.59

 

 

0.2003

21.29

21.44

0.62

0.2022

21.36

 

 

0.2039

21.41

 

 

 

 

2.6 加样回收率实验

表 6 加标回收率实验结果(n=5)

Table 6 Results of spiked recovery tests (n=5)

成分

称样

量/g

样品含

量/mg

加标量/mg

测定含

量/mg

加标回收率/%

平均

值/%

RSD/%

酸枣仁皂苷A

0.1012

0.42

0.41

0.82

97.75

 

 

0.9989

0.41

0.41

0.81

96.89

 

 

0.1028

0.42

0.41

0.82

97.05

97.39

0.36

0.9997

0.41

0.41

0.81

97.56

 

 

0.1018

0.42

0.41

0.82

97.69

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

酸枣仁皂苷B

0.1012

0.14

0.14

0.28

97.69

 

 

0.9989

0.13

0.14

0.27

98.11

 

 

0.1028

0.14

0.14

0.28

97.55

97.86

0.34

0.9997

0.13

0.14

0.27

97.56

 

 

0.1018

0.14

0.14

0.28

98.37

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

斯皮
诺素

0.1012

2.13

2.11

4.21

98.53

 

 

0.9989

2.13

2.11

4.21

98.11

 

 

0.1028

2.13

2.11

4.21

98.35

98.48

0.30

0.9997

2.12

2.11

4.21

99.01

 

 

0.1018

2.13

2.11

4.21

98.42

 

 

 

 

精密称取分散片样品(批号20130403)加入3种对照品,按照1.3.3.2节制备供试液5份,依1.3节色谱及质谱条件进样测定,结果见表6。由表6可知,酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素的加样回收率满足检测方法的要求。

2.7 实际样品测定

取3批酸枣仁分散片,按1.3.3.2节操作制备供试品溶液(n=3),按1.3节色谱及质谱条件进样测定。根据回归方程计算分散片中酸枣仁皂苷A 、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素的含量。由表7可知,3批酸枣仁分散片中的枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素含量稳定。

表 7 酸枣仁分散片中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B与斯皮诺素的含量(n=3)

Table 7 Contents of JuA, JuB and spinosin in ZSS dispersible tablets (n=3)

成分

 

含量/(mg/g)

 

平均含

量/(mg/g)

RSD/%

20130403

20130407

20130411

酸枣仁皂苷A

4.11

4.18

4.15

4.15

0.69

酸枣仁皂苷B

1.41

1.46

1.51

1.46

2.79

斯皮诺素

21.28

21.52

21.59

21.46

0.62

 

 

3 结 论

本研究采用HPLC-MS-MS技术,同时测定酸枣仁分散片中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B与斯皮诺素的含量。与报道较多的HPLC-UV、HPLC-ELSD含量测定方法相比,HPLC-MS-MS法的灵敏度更高、检测限更低,可用于提高和控制制剂质量。选择MRM模式进行定量分析,可提高其检测选择性及灵敏度。采用乙腈-0.1%甲酸溶液(36:64,V/V)为流动相,3种成分的保留时间分别为2.5、4.2、5.8min,分离度好,无杂质干扰,可在较短时间内实现酸枣仁分散片主要指标成分的同时测定。酸枣仁有效部位中有效成分含量较高,将其制备成分散片,既有药品的治疗疗效又有食品的安全性、稳定性。本实验可为开发新型酸枣仁天然镇静安眠保健品提供一种快速、准确、重复性好的新方法,且同时测定3种有效成分。

参考文献:

[1] 南京中医药大学. 中药大辞典: 下册[M]. 2版. 上海: 上海科学技术出版社, 2006: 3577-3579.

[2] 张雪, 丁长河, 李和平. 酸枣仁的化学成分和药理作用研究进展[J]. 食品工业科技, 2009(3): 348-350.

[3] 张明春, 解军波, 李婷, 等. 复合酶法提取酸枣仁黄酮研究[J]. 食品科学, 2008, 29(9): 174-177.

[4] 王卫记, 罗建光, 孔令义. HPLC-ESI-MS~n分析酸枣仁有效部位的化学成分[J]. 中国中药杂志, 2009, 34(21): 2768-2773.

[5] 赵连红, 乔卫, 许岚. 酸枣仁中生物碱抗惊厥作用的实验研究[J]. 天津药学, 2007, 19(1): 4-5.

[6] 王旭峰, 何计国, 陈阳, 等. 酸枣仁皂苷的提取及改善睡眠功效的研究[J]. 食品科学, 2006, 27(4): 226-229.

[7] CAO Jiexin, ZHANG Qingying, CUI Suying, et al. Hypnotic effect of jujubosides from Semen Ziziphi Spinosae[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 130(1): 163-166.

[8] 吴玉兰, 许惠琴, 陈诜. 酸枣仁不同炮制品及炒酸枣仁中总黄酮与总皂苷的镇静催眠作用比较[J]. 时珍国医国药, 2005, 16(9): 868-869.

[9] WANG Linen, BAI Yanjing, SHI Xiaorong, et al. Spinosin, a C-glycoside ?avonoid from semen Zizhiphi Spinozae, potentiated pentobarbital-induced sleep via the serotonergic system[J]. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 2008, 90(3): 399-403.

[10] 黄宜生, 贾钰华, 孙学刚, 等. 酸枣仁皂苷A对缺血再灌注损伤大鼠心律失常及Bcl-2、Bax表达的影响[J]. 中药新药与临床药理, 2011, 22(1): 51-54.

[11] XIE Junbo, ZHANG Yanqing, WANG Lijuan,et al. Composition of fatty oils from Semen Ziziphi Spinosae and its cardiotonic effect on isolated toad hearts[J]. Natural Product Research, 2012, 26(5): 479-483.

[12] YOU Zili, XIA Qing, LIANG Fanrong, et al. Effects on the expression of GABAA receptor subunits by jujuboside A treatment in rat hippocampal neurons[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 128(2): 419-423.

[13] LI Yujuan, BI Kaishun. Study on the therapeutic material basis of traditional Chinese medicinal preparation Suanzaoren decoction[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2006, 54(6): 847-851.

[14] 隋宏, 周慧玲, 陈建峰, 等. HPLC-ELSD测定酸枣仁合剂中酸枣仁皂苷A的含量[J]. 现代食品与药品杂志, 2007, 17(6): 35-37.

[15] 王丽娟, 张明春, 李彬, 等. 酸枣仁半仿生提取物和醇提取物对睡眠的改善作用[J]. 时珍国医国药, 2010, 21(12): 365-366.

[16] 张志斐, 袁志芳, 张兰桐, 等. 河北道地药材酸枣仁HPLC-ELSD指纹图谱研究[J]. 中草药, 2007, 37(8): 1247-1250.

[17] 张彦青, 解军波, 张明春, 等. HPLC-ELSD法测定酸枣仁滴丸中酸枣仁皂苷A、B和白桦脂酸[J]. 中草药, 2009, 40(2): 234-235.

[18] 张翠英, 刘峰, 郭丽丽, 等. 酸枣仁醇提物中4个活性成分的测定[J]. 中成药, 2011, 33(12): 2119-2122.

[19] 李游, 梁宗锁, 周自云, 等. 基于HPLC 指纹图谱和定量分析法评价酸枣仁质量[J].食品科学, 2010, 31(4): 143-149.

[20] ZHANG Mingchun, ZHANG Yanqing, XIE Junbo. Simultaneous determination of jujuboside A, B and betulinic acid in Semen Ziziphi Spinosae by high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008, 48(5): 1467-1470.

[21] 单艺, 马微, 王象欣, 等. HPLC-PAD外标法及UPLC-MS/MS内标法测定乳及乳制品中三聚氰胺的含量[J]. 食品科学, 2012, 33(20): 171-175.

[22] 黄睿, 张贵君, 潘艳丽, 等. 金莲花化学成分的HPLC-MS表征分析与鉴定[J]. 中草药, 2012, 43(4): 670-672

[23] 李健, 刘鑫,  刘宁, 等. HPLC-MS法表征苦瓜皂苷结构[J]. 食品科学, 2009, 30(18): 314-316.

 

收稿日期:2013-06-17

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31000749)

作者简介:马桂劼(1988—),女,硕士研究生,研究方向为生物活性物质的分离筛选。E-mail:journeyma@sina.com

*通信作者:解军波(1975—),男,副教授,博士,研究方向为天然活性物质。E-mail:xjbo@tjcu.edu.cn