超高效液相色谱-紫外检测器法快速测定
茶饮料茶多酚中儿茶素类组成及含量

张 爽1，黄梦甜2，焦妍津2，陶冠军1，曾茂茂1，陈 洁1,*

(1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

摘 要：建立超高效液相色谱-紫外检测器(UPLC-PDA)测定茶饮料中没食子酸(GA)和5种儿茶素类化合物，包括儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子酸儿茶素(EGC)的检测方法。采用Kinetex-C18(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱，以0.1%甲酸(V/V)和乙腈为流动相进行梯度洗脱，使乙腈在10min内从5%达到30%。流速为0.3mL/min，柱温45℃，在波长280nm处进行紫外检测。6种组分在7min内达到完全分离。分别建立了6种物质的标准曲线方程，相关系数在0.9993～0.9999间，其中GA和C在0.25～50mg/L内线性范围良好，EGC、EC、EGCG和ECG在1～100mg/L内线性范围良好。采用固相萃取进行样品净化后，6种组分的平均加标回收率分别为92.5%～98.5%(GA)、95.9%～98.5%(ECG)、97.8%～101.0%(C)、95.5%～96.7%(EC)、95.5%～98.9%(EGC)、95.1%～103.4%(EGCG)，相对标准偏差在0.8%～4.7%之间。

关键词：超高效液相色谱法；紫外检测器；定量；儿茶素类茶多酚；茶饮料

Rapid and High Throughput Quantitative Analysis of Catechin Polyphenols in Tea Beverages by Ultra-High Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detection (UPLC-PDA)

ZHANG Shuang1，HUANG Meng-tian2，JIAO Yan-jin2，TAO Guan-jun1，ZENG Mao-mao1，CHEN Jie1,*

(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；

2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract：An efficient and high throughput analytical method was developed for the determination of galiic acid (GA) and five catechin polyphenols including catechin (C), epicatechin (EC), epigallocatechin gallate (EGCG), epicatechin gollate (ECG), and epigallocatechin (EGC) in tea. A Kinetex-C18 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm) column was employed at 45 ℃. Gradient elution was applied with 0.1% acidic methane (V/V) and acetonitrile (from 5% to 30% in 10 min) as the mobile phase at a flow rate of 0.3 mL/min. The detector wavelength was set at 280 nm. The results demonstrated that six standard polyphenols could be separated in approximately 7 min. A good linear relationship between polyphenol concentration and peak area was observed in the range of 0.25－50 mg/L for GA and C and of 1－100 mg/L for EGC, EC, EGCG and ECG, with correlation coefficients of 0.9993－0.9999. Samples were purified by solid phase extraction. The recoveries of six polyphenols were in the range of 92.5%－98.5% (GA), 95.9%－98.5% (ECG), 97.8%－101.0% (C), 95.5%－96.7% (EC), 95.5%－98.9% (EGC), and 95.1%－103.4% (EGCG), with relative standard deviation (RSD) of 0.8%－4.7%, respectively.

Key words：ultra performance liquid chromatography (UPLC)；photodiode array detector (PDA)；quantification；catechin polyphenols；tea beverages

中图分类号：O656.21 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0170-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322034

茶饮料是茶产业发展的重要方向，已经成为茶产业的重要支柱[1-3]。茶饮料不仅继承了中国传统饮茶文化，更作为一种养生健康饮品，受到消费者的青睐。茶中最重要的抗氧化活性成分是茶多酚[3-6]。茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，具有抗氧化、抗癌、降低血糖血压、防治心血管疾病以及抗衰老等多种保健功能[3-6]。茶多酚中最主要的成分是儿茶素类化合物，包括儿茶素(catechin，C)、表儿茶素(epicatechin，EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gollate，ECG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)等[3-4]。因此，检测茶饮料中的茶多酚含量对于茶饮料品质控制具有重要意义。

目前，茶多酚的定量分析检测方法有电化学法[7-8]、分光光度计法[9-11]、高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法[12-17]等。由于HPLC具有准确、快速、灵敏度高等优势，因此多数研究者采用HPLC法进行茶多酚定量，分析时间一般为20～40min[12-17]。超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC)较HPLC具有更高的分离度和灵敏度，分析速度更快[18-20]。本研究建立了茶饮料中茶多酚的UPLC检测方法，在12min内完成了对没食子酸和5种儿茶素类化合物的测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

没食子酸(galiic acid，GA，纯度99.3%)、EGC(纯度99.3%)、(－)-EGCG(纯度98.4%) 成都普瑞法科技开发公司；ECG(纯度98%)、EC(纯度98%)、C(纯度99%) 中国阿拉丁试剂有限公司；乙腈(色谱纯) 美国Tedia 公司；甲酸(分析纯) 美国Acrōs Organics公司。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统(配有可变波长紫外检测器和Masslynx 4.1工作站) 美国Waters公司；Visiprep DL SPE固相萃取装置 美国Supeloco公司；CNWBOND HC-C18 SPE小柱(500mg/3mL) 上海安谱科学仪器有限公司；SILB-Ⅲ循环水式多用真空泵 豫华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Kinetex-C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相为乙腈(A)和0.1%(V/V)甲酸(B)；流动梯度洗脱程序：0～1min，5%乙腈；1～10min，5%～30%乙腈；10～12min，30%～100%乙腈；流速0.3mL/min；柱温45℃；紫外检测波长280nm；进样量1μL。

1.3.2 标准溶液的配制

准确称取GA、C、EC、EGC、ECG和EGCG标准品于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为500mg/L的标准混合样品储备液。

1.3.3 茶饮料的前处理方法

上样前依次用3mL甲醇、3mL蒸馏水预活化SPE小柱，取1mL样品上样，弃去流出液，抽干。用1mL甲醇洗脱，收集后氮气吹干，残渣用1mL乙腈溶解，过0.45μm滤膜，液相色谱检测。

1.3.4 加标回收率测定

向空白茶饮料样品中添加标准样品溶液，使GA、ECG、C、EC添加质量浓度分别为2、10、25mg/L，EGC、EGCG添加质量浓度分别为5、25、50mg/L。分别测定空白及加标茶饮料样品中6种茶多酚样品的含量，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

为得到满意的分离度同时缩短分析时间，采用梯度洗脱，实验表明，采用乙腈和0.1%甲酸(V/V)在7min内能达到6种化合物的基线分离。HPLC法进行儿茶素类定量，分析时间一般为20～40min之间[10-14]，因此采用UPLC使分析时间显著缩短。乙腈-0.1%甲酸(V/V)流动相体系可直接应用于液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)，实现基于质谱的茶饮料中茶多酚组成定性研究[15-16]。

1. GA；2. EGC；3. C；4. EC；5. EGCG；6. ECG。下同。

图 1 茶多酚混合标样的色谱图

Fig.1 Chromatogram of mixed standards of six polyphenols

2.2 线性范围、检出限及精密度

将标准混合样品储备液进行梯度稀释，制成一系列梯度质量浓度的标准混合溶液，按1.3节色谱条件进行测定。以标准样品的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，得到6种化合物的标准曲线(表1)。采用UPLC进行儿茶素类定量，检出限0.022～0.093mg/L，较HPLC法的0.25～15mg/L[10-14]，显著降低，证明UPLC法较HPLC法具有更高灵敏度。

取标样混合液，重复进样5次，每次1μL，记录峰面积，得到6种茶多酚的相对标准偏差分别为：GA 0.112%、EGC 0.580%、EGCG 0.249%、C 0.353%、EC 0.339%和ECG 0.526%。结果表示仪器精密度良好。

表 1 线性方程、线性范围、相关系数及检出限

Table 1 Linear equations, correlation coefficients and limits of detection

2.3 样品的提取、净化和检测

表 2 茶饮料中6中多酚物质的回收率(n=3)

Table 2 Recoveries of six polyphenols in tea beverage (n = 3)

本实验对洗脱剂的洗脱体积进行了优化。HC-C18 SPE小柱能够有效去茶饮料样品中茶饮料色素等杂质，有效吸附目标物，得到高而稳定的回收率。实验表明，用1mL甲醇可以使待测组分充分洗脱，回收率达到92.6%以上，达到分析测试要求。其加标回收率和相对标准偏差见表2。

2.4 茶饮料6种茶多酚的测定

a.绿茶；b.红茶；c.乌龙茶。

图 2 绿茶、红茶、乌龙茶饮料中6种茶多酚的色谱图

Fig.2 Chromatogram of six tea polyphenols in green tea, red tea and oolong tea beverages

表 3 茶饮料样品检测结果

Table 3 Analytical results of tea beverage samples

分别选取红茶原味茶饮料、绿茶原味茶饮料、乌龙茶原味茶饮料按1.3.3节方法进行前处理、1.3.1节方法分析，分别计算其中6种多酚类物质的含量，结果见表3，色谱分离图见图2。结果表明，UPLC法对杂质干扰小、基线稳定、峰形对称，能很好的应用于茶饮料样品的分析，可在7min内对6种儿茶素类化合物准确定量，比HPLC法分析速度快且分离效率更高[13-17]。同时可知，3种类型的茶饮料中6种茶多酚类物质的含量具有明显差异。

3 结 论

本研究采用固相萃取法对茶饮料中的茶多酚进行提取和净化，采用UPLC-PDA对3种茶饮料样品中GA、C、EC、EGCG、EGC、ECG进行定量分析，较传统HPLC法比，UPLC法更快速、更准确且灵敏度更高。茶饮料的保健与经济价值与茶多酚含量及组成密切相关，因此本研究结果可为茶饮料质量评价和控制提供准确、可靠的前处理方法和检测手段。

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