γ-聚谷氨酸发酵液预处理的研究

梁金钟，张露露，王风青

(黑龙江省高等学校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076)

摘 要：为了提高γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的质量，基于γ-PGA发酵液的物化特性，采用单因素试验逐个确定影响硅藻土除杂质的因子的最佳条件，最后在单因素试验的基础上用硅藻土层模拟板框模式过滤除菌体。以除菌率、杂蛋白质量浓度、γ-PGA质量浓度为指标，研究硅藻土的用量。结果表明：发酵液加热至50℃，4倍稀释，以1.6cm厚(约25g)的硅藻土层作为滤饼层，连续过滤4次后，能除去130mL原发酵液中几乎全部的菌体，发酵液中蛋白质质量浓度为0.32mg/mL，γ-PGA的损失率为34.8%。

关键词：γ-聚谷氨酸(γ-PGA)；硅藻土；除菌体

Pretreatment of Fermented Mash Containing Poly-γ-glutamic acid (γ-PGA)

LIANG Jin-zhong，ZHANG Lu-lu，WANG Feng-qing

(Key Laboratory of Food Science and Engineering, College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Abstract：In order to improve the quality of poly-γ-glutamic acid (γ-PGA), single factor experiments were used to determine the best conditions for removing bacterial cells through diatomite, based on the physical and chemical properties of fermented mash containing γ-PGA. The amount of diatomite was determined based on bacterial removal, protein concentration, γ-PGA concentration. The results showed that when the fermented mash was heated at 50 ℃, diluted 4-fold and then filtered through 1.6 cm thickness (approximately 25 g) diatomite four times, the bacterial cells were almost completely removed from 130 mL of γ-PGA fermented mash. The protein concentration was 0.32 mg/mL, and the loss of γ-PGA was 34.8%.

Key words：poly-γ-glutamic acid (γ-PGA)；diatomite；bacterial cells

中图分类号：Q939.97 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0168-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321035

γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一种生物高分子材料，由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体通过α-氨基与γ-羧基形成的γ-酰胺键相互缔结而成的一种多肽分子[1]。微生物合成的γ-PGA分子质量在105～106u之间[2]。γ-PGA是一种水溶性可生物降解的高分子物质，具有乳化、增稠、成膜、保湿、絮凝、黏合、无毒等性能，其应用非常广泛。在食品方面，γ-PGA具有食品安全性，能作为苦味掩盖剂而改善果汁和其他饮料的口感；可作为一种食品添加剂而发挥各种作用；又因为γ-PGA几乎是无味的，能增强面粉的抗冻性，延缓面粉(用来制作蛋糕、面包等)变质、改善其质地；还能促进钙的溶解而增加其吸收[3-5]。特别是近年来随着对γ-PGA的深入研究，γ-PGA作为一种高分子生物制品，愈来愈显现出广阔的研究及应用前景。但发酵液中菌体及蛋白质等杂质大大降低了γ-PGA的质量，其应用也因此受到极大程度的限制，因此，对γ-PGA进行纯化、提高其质量意义重大。

目前，报道的除去γ-PGA发酵液中的菌体通常采用有机溶剂沉淀法[6-8]、铜盐沉淀法和膜分离沉淀法[9]，有机溶剂沉淀法和铜盐沉淀法除菌体不够彻底[10]，膜分离技术成本太高、处理量小，很难应用于工业化生产[11-13]。本实验采用发酵液温度处理稀释后，用硅藻土层进行过滤，确定最佳过滤条件，最后在单因素确定的最佳试验条件的基础上模拟板框过滤模式，确定了硅藻土的用量，为工业化上用硅藻土除去γ-PGA发酵液中的菌体提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂与培养基

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis HCUL-B-115) CGMCC2283，由哈尔滨商业大学发酵工程实验室筛选、诱变、分离并保藏，中国科学院菌种保藏中心鉴定。

玉米糖化液 哈尔滨商业大学发酵工程实验室制备；谷氨酸钠 市售；所用氮源、无机盐离子等试剂，均为国产分析纯；硅藻土 天津市巴斯夫化工有限公司。

斜面培养基：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L、琼脂20.0g/L，pH7.2～7.4。种子培养基：牛肉膏3.0g/L、葡萄糖20.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L，pH7.2～7.4。发酵培养基：玉米糖化液(糖度200g/L) 300.00mL/L、CaCl2 0.42g/L、蛋白胨5.00g/L、谷氨酸钠60.00g/L、NaCl 12.00g/L、MgSO4•7H2O 1.25g/L、KH2PO4 4.00g/L、MnSO4 0.08g/L。

1.2 仪器与设备

SBA-40D生物传感分析仪(配有β-D-葡萄糖检测膜及L-谷氨酸检测膜) 山东省科学院生物研究所；UV-9100紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；HNY恒温培养振荡器 天津市欧诺仪器有限公司；DHP-9162电热恒温培养箱、DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-FD型单人单面净化工作台 苏州净化有限公司；BS 224S电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 玉米糖化液的制备方法

取300g市售玉米粉加水1000mL，加入无水CaCl2(添加量为100mg/kg)煮沸，调节pH 6.7～7.0，再加入α-耐高温淀粉酶(添加量为10U/g原料)，迅速降温至80～85℃，保温15～20min，继续降温至58～60℃，调节pH4.5，加糖化酶(添加量为120U/g原料)，60℃保温4h后，再加热煮沸10min，过滤除渣，测定糖化液还原糖含量，低温保存备用。

1.3.2 培养方法

将斜面上的菌种转接到种子培养基中，37℃、150r/min摇床培养18h，将活化后的种子培养液按2%的接种量接种至发酵培养基中，37℃、150r/min摇床培养72h。

1.3.3 过滤方法

将浸湿的滤纸铺在抽滤漏斗底部，使滤纸与漏斗紧密贴合；将用适量水稀释的硅藻土边搅拌边倒入漏斗内，静止片刻后，用真空泵进行抽滤，抽滤压力为0.1MPa。待硅藻土层表面的水抽尽后，倒入发酵液，抽滤液有黏性后换抽滤瓶，同时进行计时。

1.4 分析方法

1.4.1 γ-PGA含量的测定

发酵液在6000r/min离心15min。取上清液10mL，加入25mL的无水乙醇，剧烈摇晃得到团状凝聚物，将其转入恒质量的称量瓶中，置于电热恒温鼓风干燥箱中100℃条件下烘至恒质量，得到块状样品，并称质量。

1.4.2 滤液中菌体量的测定

影响发酵液澄清度的主要原因是发酵液中的菌体，菌体的OD600nm值最大，因此，选择在波长600nm处测滤液的光密度值，以确定菌体的去除率(除菌率)。

1.4.3 考马斯亮蓝法[14]测蛋白质

染色液：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL质量浓度为0.85g/mL的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到1000mL。试剂最终为0.01g/100mL的考马斯亮蓝G-250、0.085g/mL的磷酸。标准蛋白溶液：质量浓度为1mg/mL的牛血清白蛋白溶液。以蛋白质的质量浓度为横坐标(x，mg/mL)，A595nm为纵坐标(y)，得蛋白标准曲线方程为y=0.7401x＋0.0098(R2=0.9992)。

2 结果与分析

2.1 发酵液处理温度的确定

微生物发酵结束后发酵液一般为淡黄色黏稠液体，由于其黏度大，蛋白及菌体被包裹夹杂在γ-PGA中，很难将其分离，降低pH值及温度处理均可以降低发酵液的黏度，但γ-PGA在酸性条件下很不稳定极易降解[15]，同时，改变pH值会增加发酵液中的离子，不利于后续纯化，因此，实验采用加热稀释的方法来降低发酵液的黏度，γ-PGA在低温下不易被降解，但在高温时γ-PGA的分子质量会急剧下降，有资料[16]显示在80℃时γ-PGA容易被降解，在60℃时比较稳定，将发酵液3倍稀释后冷却或加热至不同温度(最高温度为60℃)，用预涂了约1cm厚的硅藻土层进行过滤，比较OD600nm后,确定最佳的处理温度。结果如图1所示。

图 1 温度对发酵液预处理的影响

Fig.1 Effect of temperature on pretreatment of fermented mash

由图1可知，微生物发酵合成γ-PGA的最适温度为37℃，在用硅藻土过滤去除菌体的过程中，处理温度低于或高于最适发酵温度时，除菌效果较好且γ-PGA的质量浓度也较高。特别是温度高时效果更明显，高温时流速的上升主要是由于γ-PGA相互缠绕的分子因受热使氢键断裂而解聚，黏度下降，另一方面，由于溶液黏度的下降导致滤饼黏附的凝胶层变薄，γ-PGA的截留量减少，从而提高了γ-PGA的收率[17]。当处理温度接近最适发酵温度即发酵刚刚结束时的温度，菌体的活性大，菌体代谢旺盛，γ-PGA并未被完全分泌于细胞外。此时，γ-PGA部分处于细胞内，部分处于细胞外，因此，γ-PGA与菌体的黏合作用大，对于发酵液中菌体的去除非常的不利。所以，发酵液的处理温度尽可能的选择离菌体发酵的最适温度远一些且最好是较高的温度。实验确定的最佳处理温度为50℃。

2.2 发酵液稀释倍数的确定

加热处理后的发酵液黏度有明显的降低，但γ-PGA的质量浓度太大，包裹在其中的菌体及蛋白质不易分散开来，因此，实验用稀释的方法来降低γ-PGA的质量浓度。将发酵液50℃处理30min，用蒸馏水进行不同倍数的稀释后，用预涂了约1cm厚的硅藻土层进行过滤，比较OD600nm，确定最佳的稀释倍数，结果如图2所示。

图 2 稀释倍数对发酵液预处理的影响

Fig.2 Effect of dilution ratio on the pretreatment of fermented mash

由图2可知，处理后发酵液的OD600nm值有了不同程度的降低，随着稀释倍数的增加发酵液处理前后的OD600nm值相差越大，γ-PGA的质量浓度有所提高。当发酵液稀释倍数很低时，长链结构的γ-PGA相互缠绕，很容易在硅藻土层表面形成凝胶层，降低了硅藻土的通量[18]，同时，菌体被包裹在γ-PGA里面，很难被硅藻土吸附及筛分；当达到一定稀释倍数，γ-PGA分子间相互作用力减弱，γ-PGA分散开来，增加了硅藻土层的通量，同时，菌体也游离出来，能被硅藻土层截留，易于与γ-PGA分离。当发酵液稀释倍数为原发酵液的4、5、6倍时，处理后的发酵液OD600nm值均大幅度降低，γ-PGA的质量浓度基本达到恒定，但稀释倍数越大，能耗也就越大，因此，确定最佳稀释倍数为4。

2.3 硅藻土过滤层厚度的确定

硅藻土因其多孔性本身就具有吸附作用，但当其厚度达到一定程度还具有筛分作用[19-21]，能更有效地除去发酵液中的菌体及蛋白质。用预涂了不同厚度的硅藻土层过滤经50℃加热30min后稀释4倍的发酵液，比较超滤液的OD600nm值、蛋白质含量、单位时间的滤液量及γ-PGA的损失率4个参数，确定最佳的硅藻土厚度，结果如图3所示。随着硅藻土层厚度的增加，滤液的浊度愈来愈小，蛋白质质量浓度也有很大程度的降低，但同时滤液量也愈来愈小，γ-PGA的质量浓度也大幅度下降。当硅藻土厚度为1.6cm时，滤液的OD600nm值为0.050，蛋白质质量浓度为0.64mg/mL，达到了滤液初步的处理要求，当硅藻土厚度为2.0cm时，单位时间处理的滤液量急剧下降，γ-PGA的含量也大幅度降低。因此，综合考虑，硅藻土的厚度为1.6cm最适宜。

图 3 硅藻土厚度对发酵液预处理的影响

Fig.3 Effect of diatomaceous earth thickness on the pretreatment of fermented mash

2.4 硅藻土饱和度的确定

硅藻土层形成的涂层会随着发酵液的不断滤过，菌体的积累附着而达到饱和[22]，将经50℃加热30min后稀释4倍的发酵液用预涂了1.6cm厚的硅藻土层进行过滤，每隔0.5h取一次样，测滤液的OD600nm值及滤液量，结果如图4所示。

图 4 时间对发酵液预处理的影响

Fig.4 Effect of filtration time on the pretreatment of fermented mash

当发酵液不断滤过时，硅藻土会不断地吸附及截留菌体，起初阶段，因枯草芽孢杆菌菌体非常小，硅藻土截留效果不太明显，硅藻土以吸附作用为主，截留作用为辅，滤液澄清度大幅度降低，但当滤液达到一定量时，硅藻土吸附达到饱和，主要以截留作用为主[23]，滤液澄清度达到稳定。由图4可知，6号样之前滤液的OD600nm值逐渐增大，澄清度在逐渐降低，6号样之后达到稳定，处理后的滤液的OD600nm值在0.14以下，除去了发酵液中近90%的菌体。

2.5 硅藻土层模拟板框过滤

在以上实验的基础上，模拟板框模式[24]，将经50℃加热30min后稀释4倍的发酵液连续进行硅藻土层多层过滤，每滤过一层，测过滤液的OD600nm值、处理量、杂蛋白的质量浓度及γ-PGA的质量浓度。结果如图5所示。

图 5 过滤次数对发酵液预处理的影响

Fig.5 Effect of number of repeated filtrations on the pretreatment of fermented mash

由图5a、b可知，随着过滤次数的增加，滤液的浊度及蛋白质质量浓度都有所下降，当过滤次数达到4次时，滤液的浊度及蛋白质质量浓度基本达到恒定，达到了发酵液预处理的效果。此时，硅藻土的厚度为1.6cm(约25g)，过滤4次，硅藻土的总用量为100g，发酵液最终滤液量为520mL，稀释4倍，相当于原发酵液130mL。即1g硅藻土能除去1.3mL发酵液中几乎全部的菌体，发酵液中蛋白质质量浓度为0.32mg/mL，γ-PGA的损失率为34.8%。

3 结 论

γ-PGA发酵液的黏度极大，菌体被包裹其中很难除去，本实验采用加热稀释后通过硅藻土层多次吸附筛分，达到了一定的除菌效果，但发酵液多次过滤造成了γ-PGA的损失很大，同时硅藻土的用量也很大。在本实验室条件下，发酵液加热至50℃，进行4倍稀释，以1.6cm厚(约25g)的硅藻土层作为滤饼层，连续过滤4次后，能除去130mL原发酵液中几乎全部的菌体，发酵液中蛋白质质量浓度为0.32mg/mL，γ-PGA的损失率为34.8%，这为工厂生产可提供初步的参考数据。

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